大肠杆菌中功能性半胱氨酸抑制实现琥珀密码子编码硒代半胱氨酸

来源：Reassigning an amber codon to selenocysteine using a functional cysteine suppression pair in Escherichia coli.（Synth Syst Biotechnol）| 编译：DNA Lab Space

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导读

含硒蛋白因含有第21种氨基酸——硒代半胱氨酸（Sec），在生物体内执行独特的氧化还原功能。人谷胱甘肽过氧化物酶1（GPx1）对维持氧化还原稳态至关重要，但其复杂的重编码机制使其在大肠杆菌中的高效表达面临挑战。本研究通过对大肠杆菌内源半胱氨酰-tRNA合成酶（CysRS）及其同源tRNA^Cys进行定向进化，构建了一套功能性琥珀抑制系统（M38-18/M1-1），成功实现了GPx1及其突变体的重组表达，酶活分别达到约420 U/mg和290 U/mg，为硒蛋白的细菌平台生产提供了新方案。

研究背景

硒代半胱氨酸（Sec）作为第21种氨基酸，通过独特的重编码机制被遗传性地整合进硒蛋白中。其独特的化学性质使硒蛋白在三大生命域中执行重要的生化与生物物理功能。人类中已鉴定出25种硒蛋白。其中，谷胱甘肽过氧化物酶（GPx1–4和GPx6）活性位点含有硒代半胱氨酸，在氧化防御和维持氧化还原稳态中发挥关键作用。氧化应激与衰老、癌症、神经退行性疾病和心血管疾病等多种生理病理状态相关，因此谷胱甘肽过氧化物酶的研究与生产日益受到关注，尤其是在治疗应用方面。

Sec的位点特异性整合通过重新定义通常作为终止密码子的UGA密码子来实现。为此，生物体进化出了专一的Sec特异性延伸因子（原核生物中的SelB或真核生物中的eEFSec）、保守的mRNA基序——硒代半胱氨酸插入序列（SECIS），以及独特的Sec特异性tRNA^Sec。在原核生物中，tRNA^Sec首先被内源丝氨酰-tRNA合成酶（SerRS）识别并氨酰化形成Ser-tRNA^Sec，随后由硒代半胱氨酸合成酶催化转化为Sec-tRNA^Sec。这一复杂机制限制了硒蛋白在异源系统中的高效表达。

研究方法

2.1 菌株、质粒与试剂

大肠杆菌DH5α菌株用于质粒扩增。无琥珀密码子的大肠杆菌菌株C321.ΔA.exp购自Addgene（49018），用于蛋白质表达。pGFIB和pRSF-DuetI载体由Dieter Söll惠赠。pACYC-184和pCDF-DuetI载体购自生工生物工程（上海）股份有限公司。NADPH、GSH、IPTG、X-gal和谷胱甘肽还原酶（GR）购自Sigma-Aldrich（St. Louis, MO, USA）。氯霉素、氨苄青霉素、卡那霉素和壮观霉素购自生工生物工程（上海）股份有限公司。其他所有化学品购自北京化工厂（北京，中国），均为分析纯级。

【数据】菌株：DH5α、C321.ΔA.exp（Addgene 49018）；试剂来源：Sigma-Aldrich、生工生物、北京化工厂；纯度：分析纯

2.2 质粒构建

tRNA^Cys和CysRS的序列从大肠杆菌基因组（Gene IDs: 946414和946969）中扩增，分别克隆至pGFIB和pACYC-184载体。通过定点突变和随机饱和突变构建pGFIB-tRNA^Cys^CUA和pACYC-184-CAT112TAG-CysRS突变体（CysRSM）。含TAG的NMC-A β-内酰胺酶（NMC-A）由生工生物合成并克隆至pCDF-DuetI。在氨苄青霉素筛选过程中，tRNA^Cys^CUA被转移至pCDF中，构建pCDF-NMC-A-TAG-tRNA^Cys。图1中的蛋白质表达使用了pColdI-GPx1-tRNA^Cys^CUA以及pACYC-184-CAT112TAG-CysRS/CysRS变体或pACYC-184空载体。LeuQ启动子从大肠杆菌基因组获得，亚克隆至pRSF-DuetI的XbaI位点，随后连接tRNA^Cys^CUA。针对M1-1（tRNA^Cys^CUA的一个更正交变体）受体臂附近氨基酸残基的文库，被连接至pRSF-M1-1的NdeI/XhoI位点。质粒pCDF-EGFP-TAG和pCDF-GPx1以及pRSF-M1-1-M38-18分别用于荧光测定和硒蛋白表达。所有构建的质粒均由Azenta公司测序验证。本研究使用的主要引物序列列于表S1中，包括文库构建和蛋白质表达的关键引物。

图1 CysRS反密码子结合结构域的进化。(A) 大肠杆菌tRNA^Cys^CUA的三叶草结构，反密码子以红色突出显示。(B) 基于Protein Data Bank（PDB）条目1U0B，使用开源PyMOL软件可视化的CysRS反密码子结构域内相互作用位点的结构表示。(C) 用于氯霉素抗性筛选的质粒示意图。(D) 所选变体氯霉素抗性的斑点平板验证。(E) NMC-A-TAG报告基因质粒图谱。(F) 不同变体的氨苄青霉素抗性评估。测序分析确认CysRSM37和CysRSM30相同（Arg427Ala, Trp432Ile, Asp436Gly, Arg439Thr）；因此，CysRSM37被排除在氨苄青霉素抗性验证之外，由CysRSM30替代。(G) 使用CAT10/112TAG报告基因验证氯霉素抗性的斑点平板测定。(H) 对照组和M38中β-半乳糖苷酶活性的测定。在β-半乳糖苷酶第17位氨基酸处插入了一个琥珀密码子。(I-J) GPx1表达的SDS-PAGE分析和定量。CysRSM：CysRS突变体；D436S：CysRS Asp436Ser；Cm：氯霉素；Amp：氨苄青霉素；M：Marker；Empty vector：pACYC-184-CAT112TAG；Positive control：报告基因内无琥珀密码子。数据以平均值±标准差（SD）表示（n = 3）；***P < 0.001。

【数据】载体：pGFIB、pACYC-184、pCDF-DuetI、pRSF-DuetI、pColdI；基因ID：946414（tRNA^Cys）、946969（CysRS）；酶切位点：XbaI、NdeI/XhoI；测序公司：Azenta

2.3 筛选与斑点方案

将pACYC-184-CAT112TAG-CysRSM质粒转化至大肠杆菌C321.ΔA.exp-pGFIB-tRNA^Cys^CUA中。通过计数琼脂平板上的菌落数来评估文库转化效率。刮取菌液适当培养后，将菌液涂布于含梯度氯霉素浓度的琼脂平板上。收集高浓度抗生素平板上的菌落，进行另一轮涂板筛选。从高浓度平板中挑选的克隆接种至2 mL含卡那霉素（50 μg/mL）和氨苄青霉素（100 μg/mL）的Luria-Bertani（LB）培养基中，振荡过夜培养。随后将OD600值归一化，细胞悬液稀释至不同浓度。取等分试样点样于不同浓度的氯霉素平板上。选择优势菌落进行质粒提取并重新转化以确认结果。使用氨苄青霉素抗性筛选对M1-1具有更高亲和力的CysRS变体，除所用质粒不同外，操作流程与此类似。

【数据】培养基：LB；抗生素浓度：卡那霉素50 μg/mL、氨苄青霉素100 μg/mL；筛选方式：梯度氯霉素平板、斑点稀释

2.4 半乳糖苷酶与荧光测定

将pACYC-CysRS/CysRS变体质粒与pColdI-LacZ-TAG-tRNA^Cys^CUA共转化至大肠杆菌C321.ΔA.exp中。所得单菌落分别接种至2 mL含氨苄青霉素（100 μg/mL）和卡那霉素（50 μg/mL）的LB培养基中，培养过夜至稳定期。将细菌培养物OD600归一化后，取3–5 μL各培养物点样于预先制备的含1 mM IPTG和0.2 mg/mL X-gal的LB琼脂平板上。平板在37°C下培养，观察菌落颜色。

EGFP由pCDF-EGFPTAG在大肠杆菌C321.ΔA.exp中表达，该菌株已与质粒pRSF-M1-1-CysRS/CysRS变体共转化。从平板上挑取单菌落，细胞在37°C下于2 mL含卡那霉素（50 μg/mL）和壮观霉素（90 μg/mL）的LB选择性培养基中振荡培养至饱和。随后，将3–5 μL归一化培养物点样于含IPTG的琼脂平板上。向剩余培养物中加入IPTG至终浓度100 μM。继续培养9–12小时后，离心收集细胞。细菌沉淀用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次，重悬于PBS中，使用微孔板读数器（BioTek Synergy HTX）测量细菌悬液的荧光强度，并归一化至600 nm处的光密度值。

【数据】诱导剂：IPTG 1 mM（平板）、100 μM（液体）；X-gal：0.2 mg/mL；温度：37°C；时间：9–12 h；抗生素：氨苄青霉素100 μg/mL、卡那霉素50 μg/mL、壮观霉素90 μg/mL；仪器：BioTek Synergy HTX

2.5 蛋白质表达、纯化与活性测定

GPx被亚克隆至pCDF-DuetI中CspA启动子下游，该启动子需要低温诱导表达。所得重组质粒与pRSF-M1-1-M38-18共转化至大肠杆菌C321.ΔA.exp中。转化后从单菌落开始，细胞在37°C下于2 mL含卡那霉素（50 μg/mL）和壮观霉素（90 μg/mL）的LB培养基中振荡培养。随后，将200 μL过夜培养物接种至200 mL含相同抗生素的LB培养基中，37°C过夜培养。当培养物OD600达到1.2−1.5时，温度降至20°C。4小时后，加入100 μM IPTG和10 μg/mL Sec诱导蛋白质表达，随后在20°C下继续培养18小时。

细胞在20°C下以5000× g离心5分钟收集，细胞沉淀重悬于10 mL裂解缓冲液中。超声裂解后以20,000× g离心10分钟，使用Ni–NTA树脂的固定化金属亲和层析纯化系统从上清中纯化蛋白质。经低浓度咪唑缓冲液梯度洗脱后，目标蛋白用含50 mM磷酸钠、300 mM NaCl和300 mM咪唑的缓冲液洗脱。

GPx活性按照先前描述的方法测定。样品与50 mM PBS（pH 7.4）、1 mM EDTA、0.25 mM NADPH和1 U谷胱甘肽还原酶（GR）在比色皿中混合，37°C孵育3分钟。加入500 μM H2O2启动反应。通过测量340 nm处NADPH吸光度随时间的减少来测定GPx活性。活性单位（U）定义为在37°C下每分钟氧化1 μmol NADPH所需的酶量。比活性以U/mg蛋白表示。

【数据】诱导条件：IPTG 100 μM、Sec 10 μg/mL、20°C、18 h；OD600：1.2−1.5；离心：5000× g/5 min、20000× g/10 min；纯化：Ni–NTA；洗脱缓冲液：50 mM磷酸钠、300 mM NaCl、300 mM咪唑；活性测定：PBS pH 7.4、EDTA 1 mM、NADPH 0.25 mM、GR 1 U、H2O2 500 μM、37°C、3 min、A340

2.6 十二烷基硫酸钠–聚丙烯酰胺凝胶电泳

（原文此节内容未在节选中完整呈现）

【数据】原文未详述

研究结果

3.1 创建tRNA^Cys的琥珀抑制变体及CysRS的初步进化

根据GenBank数据库中大肠杆菌tRNA^Cys的DNA序列，我们构建了一个琥珀抑制变体，如图1A所示。该变体通过引物定向合成构建，随后克隆至pGFIB质粒中，由Lpp启动子调控。广泛认为tRNA^Cys的反密码子和核苷酸U73是CysRS的关键识别元件。我们假设改变的反密码子可能导致产生一个相对正交的tRNA，无法被内源CysRS识别；因此，我们首先进化了CysRS的反密码子结合结构域，以获得对tRNA^Cys^CUA具有更高亲和力的变体。CysRS的反密码子结合结构域及其配体tRNA^Cys如图1B所示，从中可以清楚理解它们之间的相互作用模式。我们从大肠杆菌基因组中获取CysRS序列，在氨基酸位置427/432/436/439处进行了位点饱和突变。所得CysRS文库被连接至pACYC184载体中，该载体已在氯霉素乙酰转移酶（CAT）报告基因的第112位预先引入了琥珀突变（图1C）。氯霉素抗性的增加将表明突变CysRS对tRNA^Cys^CUA的亲和力增强。经过迭代轮次的初步筛选，鉴定出几个优势突变体，如图1D所示。

为鉴定最优突变体，我们使用含琥珀突变的NMC-A β-内酰胺酶（NMC-A）作为替代报告系统（图1E）。所得氨苄青霉素抗性谱如图1F所示，突出了CysRSM38（简称M38，Arg427Thr, Trp432His, Asp436Arg, Arg439Ser）的优越性能。为进一步验证，在CAT开放阅读框中引入了双TAG密码子。氯霉素抗性测试（图1G）表明，与野生型CysRS和Asp436Ser（D436S）突变体（据报道可增强tRNA^Cys^CUA的体外TAG抑制效率）相比，M38表现出显著改善。图1H的颜色观察进一步支持了这一结论，其中β-半乳糖苷酶（LacZ）作为报告基因。此外，在利用pColdI-GPx1-tRNA^Cys^CUA载体评估GPx1蛋白表达产量时，M38也表现出更高的效率，产量约为CysRS的1.5倍。图1I和J分别详细展示了M38和对照组的SDS-PAGE分析和产量定量。

【数据】突变位点：427/432/436/439；M38突变：Arg427Thr, Trp432His, Asp436Arg, Arg439Ser；GPx1产量：M38约为CysRS的1.5倍；统计：n = 3，***P < 0.001

3.2 构建更正交的tRNA^Cys^CUA变体

尽管反密码子已改为CUA，但内源CysRS似乎仍能对tRNA^Cys^CUA进行Cys装载，如图1D和I中的空载体对照和CysRS对照所示。为减轻潜在的非正交性，我们针对受体茎进行了理性设计和突变策略，以筛选更正交的tRNA^Cys^CUA变体。众所周知，修饰tRNA受体茎（可能含有aaRS的主要或次要识别决定簇）是增强GCE正交性的标准且有效策略。鉴于更强的启动子可以放大交叉反应性并有助于鉴定更正交的变体，我们将tRNA^Cys^CUA序列从先前的pGFIB载体亚克隆至pRSF-DuetI载体中，并旨在用LeuQ启动子替换原有启动子，据报道该启动子比Lpp启动子具有更强的强度。图2A中的荧光强度检测显示，LeuQ启动子成功从大肠杆菌基因组扩增，并且在抑制EGFP中允许位点的琥珀密码子方面比Lpp启动子更有效。为进一步验证这一结果，我们使用NMC-A-TAG报告基因重新检测了该启动子。与Lpp启动子相比，LeuQ启动子赋予tRNA^Cys^CUA更高的氨苄青霉素抗性，浓度差异至少为100 μg/mL（图2B），进一步证明LeuQ启动子具有更高的转录效率，与上述荧光强度分析得出的结论一致。

图2 更正交的tRNA^Cys^CUA突变体的设计与表征。(A) 荧光分析测定LeuQ启动子介导的tRNA^Cys^CUA转录的功能和强度。(B) 使用氨苄青霉素抗性测定比较Lpp启动子和LeuQ启动子的转录活性。(C) tRNA^Cys的受体茎（红框）和几个工程化变体的三叶草结构。与天然tRNA^Cys相比，反密码子和受体臂前三个碱基对的突变以红色突出显示。M1-1中额外的A58G突变以黄色标记。(D) 使用NMC-A报告基因确定不同变体正交性的示意图。氨苄青霉素抗性水平降低与TAG通读效率降低以及tRNA^Cys^CUA变体与内源CysRS之间交叉反应性降低相关。(E) 不同tRNA^Cys^CUA变体的氨苄青霉素抗性分析。斑点测定使用OD600归一化为1的细菌培养物进行。P^LeuQ^：LeuQ启动子。"Negative control"指不存在任何tRNA，"positive control"指报告基因内无琥珀密码子。

在更强的LeuQ启动子的基础上，我们开发了几个tRNA变体，主要修饰tRNA^Cys^CUA的前三个碱基对。突变体1−突变体4（M1–M4）通过碱基对倒置和替换产生，另一个变体M1-1在质粒构建过程中通过PCR意外产生（图2C）。如图2D所示，较低的氨苄青霉素抗性与CysRS交叉反应性降低相关，而表现出背景水平的变体为正交变体。氨苄青霉素抗性评估显示M1至M4构建体的抗性水平降低。相对于亲本tRNA^Cys^CUA，在OD600为1时测得的浓度差异至少为50 μg/mL。这种差异在10倍稀释的样品中进一步放大（图S1）。令人惊讶的是，变体M1-1在所有构建的变体中表现出最低的氨苄青霉素抗性水平，几乎与背景水平无法区分（图2E）。这表明M1-1变体与内源CysRS的交叉反应性足够低，可作为更正交的tRNA。这一发现得到了后续使用EGFP和GPx1等其他报告基因的研究结果的进一步支持。

【数据】启动子差异：LeuQ vs Lpp，氨苄青霉素浓度差≥100 μg/mL；tRNA变体：M1–M4、M1-1；氨苄青霉素浓度差：≥50 μg/mL（OD600=1）；M1-1：A58G突变、抗性接近背景水平

3.3 筛选对M1-1变体具有增强催化效率的CysRS变体

据推测，进化出的变体M1-1可能因受体臂和A58的修饰而无法被内源aaRS有效装载，同时也无法被M38有效装载。因此，我们对M38进行了进一步的定向进化，以增强其对M1-1的催化效率和特异性。图3A描绘了tRNA^Cys前三个碱基对附近的选定残基。在这些位置使用NNK简并性进行了定点突变。所得文库被连接至pRSF-M1-1载体中，其序列多样性通过测序验证。为提高筛选强度，我们在NMC-A报告基因的活性位点引入了两个琥珀密码子。在这些位点成功掺入Cys赋予NMC-A报告基因功能活性（图3B）。我们将文库质粒转化至大肠杆菌C321.ΔA.exp-pCDF-NMC-A-70/240TAG细胞中，并进行氨苄青霉素抗性筛选。表现出高水平抗性的变体表明其对M1-1具有更高的催化效率。经过多轮严格筛选，获得几个优势变体。

图3 筛选对M1-1具有更高亲和力的CysRS变体。(A) tRNA^Cys前三个碱基对周围选定残基的结构示意图。使用PyMOL对CysRS⋅tRNA^Cys（PDB ID: 1U0B）进行结构可视化。(B) 筛选方法的示意图。NMC-A报告蛋白（PDB ID: 1BUE）使用PyMOL可视化。C70Am：Cys70Amber密码子；C240Am：Cys240Amber密码子。(C) 所得突变体和对照组的氨苄青霉素抗性验证。调整至一致OD600为1的细菌悬液被涂布于不同水平氨苄青霉素的平板上。突变体和对照组的荧光观察(D)和荧光定量(E)。定量分析以归一化荧光值表示。"Negative control"指无tRNA，"positive control"指EGFP报告基因中无琥珀密码子。tRNA^Cys^CUA和M1-1均在LeuQ启动子控制下。数据以平均值±标准差（SD）表示（n = 3）。***P < 0.001；ns，不显著。

【数据】筛选策略：NNK简并性、双琥珀密码子（C70Am、C240Am）；筛选菌株：C321.ΔA.exp-pCDF-NMC-A-70/240TAG；统计：n = 3，***P < 0.001

3.4 基于硒蛋白GPx1-C-S-49TAG表达的M38-18/M1-1对功能验证

（原文此节内容未在节选中完整呈现，但根据图表清单，图4展示了功能验证结果）

图4 基于硒蛋白GPx1-C-S-49TAG表达的M38-18/M1-1对功能验证。(A) M38-18/M1-1对和对照组表达的GPx1-C-S-49TAG的SDS-PAGE分析。(B) M38-18/M1-1对和对照组表达的GPx1-C-S-49TAG的总蛋白产量和活性分析。(C) M38-18/M1-1对表达的GPx1-C-S-49TAG的Western blotting分析。(D) 通过半胱氨酸密码子正常解码（GPx1-C-S组）或使用M38-18/M1-1对进行琥珀密码子抑制（GPx1-C-S-49TAG组）表达的GPx1突变体的活性测定。分别在含和不含Sec的条件下进行测量。(E) 额外引入M38-18或不引入所获得的GPx1-C-S的活性测量。(F) M38-18/M1-1对表达的GPx1-C-S-49TAG中Sec的质谱检测。M：Marker。ND："Not Detected"。Empty vector：pRSF-DuetI。数据以平均值±标准差（SD）表示（n = 3）；***P < 0.001。

【数据】统计：n = 3，***P < 0.001

3.5 使用M1-1/M38-18对表达天然GPx1及其表征

（原文此节内容未在节选中完整呈现，但根据图表清单，图5展示了天然GPx1的表达与表征结果）

图5 使用M1-1/M38-18对表达天然GPx1及其表征。(A) M1-1和M38-18表达的GPx1-49TAG（天然GPx1）的总蛋白产量和活性。(B) 使用不同浓度Sec时M1-1和M38-18表达的GPx1-49TAG的总蛋白产量和活性。活性以相对值表示，最大值设为100%。(C) M1-1/M38-18对表达的GPx1-49TAG的SDS-PAGE和Western blotting分析。(D) 以H2O2为底物，随时间测量NADPH在A340处的吸光度。阴性对照：仅空白溶液。(E) 将第49位分别改为TAG、TGC和AGC密码子的GPx1的总蛋白产量和活性测量。ND："Not Detected"。数据以平均值±SD表示（n = 3）；*P < 0.05，***P < 0.001。

图6 使用M1-1/M38-18对表达的天然GPx1的质谱分析。(A) 对应于GPx1肽段GSLRGKVLLIENVASLUGTTVRDY的四电荷前体离子m/z 653.82（[M+4H]^4+^）的MS/MS谱图。(B) 对应于GPx1肽段VVLGFPUNQF的双电荷前体离子m/z 586.25（[M+2H]^2+^）的MS/MS谱图。

【数据】质谱：m/z 653.82（[M+4H]^4+^）、m/z 586.25（[M+2H]^2+^）；统计：n = 3，*P < 0.05，***P < 0.001

3.6 使用M1-1/M38-18系统表达其他GPx

（原文此节内容未在节选中完整呈现，但根据图表清单，图7展示了其他GPx的表达结果）

图7 使用M1-1/M38-18系统表达其他GPx。(A) M1-1/M38-18对表达的GPx4的SDS-PAGE和Western blotting分析。(B) M1-1/M38-18对表达的GPx4的总蛋白产量（mg/L）和活性（U/mg）。(C) GPx4第46位Sec掺入的LC-MS/MS检测。(D) 通过SDS-PAGE和Western blotting测定重组GPx2和GPx3的表达。"Non-reduced"指不添加还原剂且不进行高温变性的实验条件。(E) 以H2O2为底物，随时间测量NADPH在A340处的吸光度。阴性对照：仅空白溶液。(F) M1-1/M38-18对表达的GPx2的总蛋白产量（mg/L）和活性（U/mg）。(G) 两种系统实现位点特异性Sec掺入的示意图。(H) 使用UTuT6系统和M1-1/M38-18系统获得的GPx3总蛋白产量和酶活性的比较。数据以平均值±SD表示（n = 3）；*P < 0.05，**P < 0.01。

【数据】统计：n = 3，*P < 0.05，**P < 0.01

3.7 M38变体中各氨基酸贡献分析

（原文此节内容未在节选中完整呈现，但根据图表清单，图8展示了M38变体中各氨基酸贡献分析结果）

图8 M38变体中各氨基酸贡献分析。M38和tRNA^Cys^CUA的结构由HDOCK生成并由PyMOL展示。(A) 氨基酸到潜在可及核苷酸的距离。4 Å以内的距离以黄色线标记。(B) 构建的变体和对照组的氨苄青霉素抗性验证。阴性对照：NMC-A-TAG；空载体组：pACYC-184载体；阳性对照：不含琥珀密码子的NMC-A。除阴性和阳性对照组外，所有实验组均转染了tRNA^Cys^CUA。(C) Arg436与U35之间的氢键相互作用。

【数据】距离阈值：4 Å；氢键：Arg436-U35

讨论与解读

活性氧（ROS）是生理过程中固有产生的含氧化合物，少量时对细胞信号传导至关重要。然而，其过量产生会诱导氧化应激，这一状态与多种病理相关。GPx是一类具有抗氧化特性的硒蛋白酶，对维持细胞氧化还原稳态至关重要。Sec特异性掺入硒蛋白所需的复杂重编码机制对其作为生物药物的开发构成了重大障碍。

过去二十年中，遗传密码扩展（GCE）技术使蛋白质能够功能化掺入非 canonical 氨基酸，赋予其多样的物理化学特性。本研究致力于工程化更正交的tRNA和氨酰-tRNA合成酶（aaRS）对用于Sec掺入。我们没有选择来自不同生物来源的组件，而是对大肠杆菌内源CysRS和tRNA^Cys进行了定向进化。这项工作不仅推进了硒蛋白生物合成，还为合成生物学设计做出了贡献，并加深了我们对aaRS结构-功能关系的理解。

我们通过构建tRNA^Cys的琥珀抑制变体tRNA^Cys^CUA开始了这项研究。我们假设CysRS不会识别tRNA^Cys^CUA，因为反密码子与区分碱基U73一起是CysRS的主要决定因素。然而，结果显示内源CysRS仍能对其装载，这促使我们进一步工程化更正交的tRNA变体（M1-1）和相匹配的CysRS变体（M38-18）。最终，这套M38-18/M1-1系统在大肠杆菌C321.ΔA.exp中成功实现了GPx1及其突变体的重组表达，酶活分别达到约420 U/mg和290 U/mg。

【编译者解读】该研究选择"同源进化"而非跨物种正交对筛选的策略颇具巧思——通过对内源CysRS/tRNA^Cys进行定向进化，规避了异源组件在宿主中可能存在的兼容性问题。M38-18/M1-1系统不仅实现了琥珀密码子向Sec的重新分配，还通过双报告基因（CAT和NMC-A）建立了严格的筛选压力。从合成生物学应用角度看，该系统为含硒治疗蛋白的微生物工厂化生产提供了可行平台，但GPx1约420 U/mg的酶活与天然来源相比仍有提升空间。未来若能将此系统与连续进化策略结合，有望进一步拓展其底物谱和应用场景。

参考来源

Niu S, Wei J, Li M, Guo B, Yan Q. Reassigning an amber codon to selenocysteine using a functional cysteine suppression pair in Escherichia coli. Synth Syst Biotechnol. PMID: 42569311.

PMID: 42569311