来源：Probing the binding stability of organic UV filters to human SLC transporters using AlphaFold and molecular dynamics simulations.（Sci Rep）| 编译：DNA Lab Space
导读
有机紫外吸收剂（UVFs）作为个人护理品核心组分，在环境和人体中广泛存在，但其跨膜转运机制长期不清。本研究将分子对接与分子动力学模拟相结合，构建了51种UVFs与470个人源SLC转运蛋白的超家族筛选体系，通过分析23,970个复合物对，揭示了TBPT-SLC22A31与DBT-SLC29A4等强稳定复合物的疏水锚定机制，为评估UVFs经皮吸收与器官特异性毒性提供了新框架。
研究背景
有机紫外吸收剂是防晒产品的关键组分，凭借高效紫外线吸收能力被广泛添加至洗发水、防晒霜等个人护理品中，有助于降低光老化和皮肤癌风险。然而，越来越多的证据表明，有机UVFs的大量使用也带来不容忽视的环境与健康风险。已有报道显示，有机UVFs在灰尘、土壤和沉积物中的质量分数可达µg/kg水平，地表水中的浓度可高达mg/L水平，凸显其强环境持久性和生物可利用性。本研究团队前期工作揭示了有机UVFs暴露可诱导人巨噬细胞产生炎症细胞因子，在室内环境中检出多种有机UVFs，各类室内空气样本检出率超过92%；四种常用有机UVFs（BP-3、4-MBC、HMS和OC）在室内灰尘中的总浓度范围为66.6至56,123.0 ng/g。这些新兴污染物可能通过多种途径进入人体，产生潜在毒性效应。然而，UVFs的跨膜转运机制——这一理解皮肤吸收和器官特异性毒性的关键环节——至今仍不清楚。本研究旨在通过计算手段填补这一空白。
研究方法
分子文件的获取
UVF分子来源于两个渠道：（1）中国、欧盟和美国法规中批准的有机UVFs；（2）文献中报道的天然有机UVFs。UVF分子的三维结构以SDF格式从PubChem数据库下载。对于缺乏可用三维结构文件的分子，使用Chem3D进行能量最小化以获得最低能量构象。该几何优化采用MM2力场执行。结构最小化迭代进行直至达到默认收敛标准，即均方根（RMS）梯度小于0.010 kcal/(mol·Å)，从而获得用于后续对接的最低能量构象。
所有人源SLC家族成员列表收集自HUGO基因命名委员会（HGNC）数据库。为确保计算流程的最佳生物学相关性，研究团队通过优先选择实验解析结构来系统筛选蛋白质结构数据集。通过对蛋白质数据银行（PDB）的全面搜索，为其中10个人源SLC转运蛋白检索到高分辨率实验结构。对于其余460个缺乏实验结构的SLC转运蛋白，从AlphaFold蛋白质结构数据库下载对应的预测模型，以实现超家族范围的筛选。
本研究共鉴定51种有机UVFs和470个人源SLC蛋白。51种UVFs的详细信息见表S1，470个SLC蛋白的完整列表见表S2。
【数据】UVF数量：51种；SLC蛋白数量：470个；实验结构SLC：10个；AlphaFold预测SLC：460个；RMS收敛标准：<0.010 kcal/(mol·Å)
分子对接与分子动力学模拟
为研究有机UVFs与SLC蛋白之间的结合特性，本研究采用分子对接与MD模拟相结合的计算方法。
分子对接使用AutoDock Vina 1.2.0执行，用于评估大分子受体与小分子配体之间的结合亲和力和构象稳定性。为提高对接效率并满足结构多样的人源SLC超家族高通量筛选的要求，开发了批处理自动化脚本以执行组合对接任务。具体而言，采用无偏盲对接策略。工作流程包括以下步骤：首先，使用AutoDockTools对所有受体和配体进行预处理，包括添加极性氢、计算Gasteiger电荷并转换为PDBQT格式。为确保所有470个靶标的可重复性，AutoDock Vina网格盒参数通过脚本动态分配。对于每个蛋白，网格盒中心（坐标）设置为大分子的几何中心。网格尺寸（X、Y、Z轴维度）经计算以涵盖整个蛋白质结构，并在所有方向上额外增加15 Å缓冲区域，为配体采样提供充足空间。对接搜索以exhaustiveness参数8执行。每次对接运行中，AutoDock Vina设置为在3 kcal/mol能量范围内生成最多9个结合姿态（num_modes = 9）。所有对接结果随后通过自动化流程处理，提取结合亲和力得分最低（最稳定构象）的单一姿态。该最优姿态确定了用于后续统计和可视化分析的选定结合口袋。由于这些AlphaFold预测的SLC模型缺乏实验解析的共晶结构，传统的再对接验证不可行。因此，盲对接严格用作初始假设生成器。这些预测结合姿态的严格验证以及假阳性伪影的消除，完全交由后续200 ns的MD模拟完成。
MD模拟使用AMBER 25软件执行。为准确捕捉转运蛋白的天然样构象动态，系统在显式脂双层环境中进行评估。由于AlphaFold预测结构缺乏预定义的膜坐标，其相对于脂双层疏水核心的空间取向通过PPM服务器严格计算。在正确空间对齐后，定向的蛋白质-配体复合物使用CHARMM-GUI的Membrane Builder模块嵌入均质POPC脂双层中。蛋白质组分使用Amber ff14SB力场参数化，小分子配体通过Antechamber模块使用通用Amber力场（GAFF）参数化。POPC脂双层使用Lipid17力场描述。膜-蛋白质系统在矩形周期性盒子中用TIP3P水模型溶剂化，溶质与盒子边界沿Z轴保持最小距离15 Å。系统被中和，生理盐浓度维持在0.15 M NaCl。为消除不利的空间冲突，系统经历多步能量最小化，首先对蛋白质-脂质重原子施加谐波约束，随后采用最陡下降法和共轭梯度法进行无约束最小化。随后，系统在NVT系综下逐步加热至300 K，接着在NPT系综下进行多步平衡阶段，以仔细松弛跨膜结构域周围的脂双层。生产阶段包括在NPT系综和周期性边界条件下进行200 ns的MD模拟。长程静电相互作用采用Particle Mesh Ewald（PME）方法处理，非键相互作用（包括范德华力和短程静电）施加10 Å截断半径。所有涉及氢原子的键使用SHAKE算法约束以提高积分效率。温度使用Langevin恒温器（ntt = 3）在300 K下控制，碰撞频率为2 ps⁻¹。关键的是，为适应脂双层的物理特性，压力使用半各向同性Berendsen恒压器耦合（ntp = 2）控制，目标压力为1 atm，弛豫时间常数为2 ps。生产运行的时间步长设为2 fs。能量、轨迹和重启信息每1,000步记录一次。轨迹和重启文件以NetCDF二进制格式保存（ioutfm = 1, ntxo = 2）以提高输入/输出效率，并设置随机种子（ig = −1）以确保模拟间的随机性。为明确解耦内在转运蛋白动力学与配体诱导的构象变化，对所有选定的SLC转运蛋白的无配体（Apo）状态执行了平行的200 ns MD模拟。Apo系统的构建、嵌入POPC脂双层及模拟均使用与其对应全息（holo）体系完全相同的协议、力场和环境参数。
【数据】对接软件：AutoDock Vina 1.2.0；网格缓冲：15 Å；exhaustiveness：8；最大姿态数：9；能量范围：3 kcal/mol；MD软件：AMBER 25；力场：ff14SB/GAFF/Lipid17；水模型：TIP3P；盐浓度：0.15 M NaCl；模拟温度：300 K；模拟时间：200 ns；截断半径：10 Å；时间步长：2 fs；压力：1 atm
数据处理
#### 分子对接数据的筛选标准
阳性对照组由经实验验证可与特定SLC家族蛋白结合的化合物组成，而阴性对照组由经实验验证不与SLC蛋白结合的化合物组成。非结合相互作用的结合亲和力范围通过阴性对照确定，结合相互作用的结合亲和力范围通过阳性对照确定。基于阳性对照和阴性对照组的平均结合亲和力值，定义了一个截断值，将所有对接结果根据结合亲和力分为三类。
【数据】阳性对照：实验验证结合SLC的化合物；阴性对照：实验验证不结合SLC的化合物；分类依据：结合亲和力截断值
#### 分子动力学模拟结果的处理
均方根偏差（RMSD）指特定时间给定构象相对于参考结构的结构偏差。对于MD模拟结果，计算了模拟时间内蛋白质的RMSD值，以及蛋白质-配体复合物中小分子相对于参考框架的RMSD值。
均方根波动（RMSF）是分析蛋白质链上局部变化的重要指标。它描述了给定残基i（或原子）在一段时间内相对于参考构象的结构偏差，从而反映原子灵活性程度。
配体均方根偏差（RMSD）反映配体在结合口袋内的结合稳定性，是柔性结合RMSD分析的补充。基于MD模拟结果，计算了模拟过程中配体原子相对于结合口袋的RMSD。结合口袋定义为距配体5 Å范围内的残基。
总相互作用频率描述模拟期间配体与周围蛋白质残基之间的一般空间接触。为评估该指标，使用MDAnalysis库以4.5 Å的统一距离截断值计算接触频率，以捕获配体与靶标SLC转运蛋白之间的所有重原子接触（不包括氢原子）。特定残基的相互作用频率定义为至少一个重原子落在该阈值内的帧数百分比。为消除瞬时随机碰撞，仅保留相互作用频率大于10.0%的残基进行后续分析。
此外，疏水相互作用占有率提供了所研究UVFs亲脂锚定机制的特定见解。该占有率使用Protein-Ligand Interaction Profiler（ProLIF）包进行定量评估。为优化计算效率，轨迹以10帧间隔采样，并明确提取特定疏水指纹。基于检测到有效疏水接触的采样帧比例对残基进行排序，应用> 5.0%占有率的保守阈值以识别决定复合物稳定性的核心疏水锚点。
【数据】RMSD参考：frame 0；结合口袋定义：距配体5 Å内残基；接触距离截断：4.5 Å；相互作用频率阈值：>10.0%；采样间隔：10帧；疏水占有率阈值：>5.0%
研究结果
分子对接筛选与结合亲和力分析
通过对23,970个复合物对（51种UVFs × 470个SLC蛋白）的系统分析，本研究识别出不同的结合行为。初始对接结果显示结合亲和力范围约为−2.6至−13.9 kcal/mol。具体而言，三联苯三嗪（TBPT）与SLC22A31形成高度稳定的复合物，结合亲和力为−10.8 kcal/mol；二乙基己基丁酰胺三嗪（DBT）与SLC29A4形成高度稳定的复合物，结合亲和力为−9.8 kcal/mol。相反，4-（二甲氨基）苯甲酸戊酯（APABA）与TMEM163的复合物显示出弱相互作用，结合亲和力仅为−3.9 kcal/mol。
图1展示了SLC家族蛋白与UVF分子之间分子对接计算的结合亲和力热图。白色方块表示阳性对照的结合亲和力。x轴代表蛋白质文件名，y轴代表配体文件名。顶部和左侧轴上的树状图分别说明了SLC转运蛋白和UVF配体之间的聚类关系，揭示了不同的靶标易感模式和配体驱动的结合强度。
图2展示了通过分子对接获得的代表性UVF–SLC复合物的结合构象：（A）SLC22A31–TBPT，（B）SLC29A4–DBT，（C）SLC10A6–BP4_BP5，（D）SLC4A9–IPMC，（E）SLC6A13–TAS，（F）TMEM163–APABA。蛋白质以卡通表示（青色），配体以棒状显示（黄色）。放大视图突出了结合口袋以及配体与周围残基之间的局部相互作用。
【数据】复合物对总数：23,970个；结合亲和力范围：−2.6至−13.9 kcal/mol；TBPT-SLC22A31：−10.8 kcal/mol；DBT-SLC29A4：−9.8 kcal/mol；APABA-TMEM163：−3.9 kcal/mol
分子动力学模拟的稳定性评估
在200 ns模拟过程中，TBPT-SLC22A31和DBT-SLC29A4复合物保持配体RMSD值低于5 Å，表明这两种复合物具有显著的结合稳定性。图3展示了模拟期间蛋白质骨架的RMSD（以frame 0坐标为参考）：（A）SLC22A31与TBPT在200 ns内的RMSD，（B）SLC29A4与DBT，（C）SLC10A6与BP4_BP5，（D）SLC4A9与IPMC，（E）SLC6A13与TAS，（F）TMEM163与APABA。
图4显示了模拟期间配体的RMSD（相对于frame 0中蛋白质结合口袋计算，结合口袋定义为距配体5 Å内的蛋白质残基）：（A）SLC22A31与TBPT在200 ns内的配体RMSD，（B）SLC29A4与DBT，（C）SLC10A6与BP4_BP5，（D）SLC4A9与IPMC，（E）SLC6A13与TAS，（F）TMEM163与APABA。
值得注意的是，APABA-TMEM163复合物表现出显著的结构不稳定性，表现为配体逐渐逃逸且RMSD值超过15 Å。
图5展示了模拟期间蛋白质的逐残基RMSF值（以frame 0中的残基坐标为参考）：（A）SLC22A31与TBPT在200 ns内，（B）SLC29A4与DBT在200 ns内，（C）SLC10A6与BP4_BP5在200 ns内，（D）SLC4A9与IPMC在200 ns内，（E）SLC6A13与TAS在200 ns内，（F）TMEM163与APABA在200 ns内。
【数据】TBPT-SLC22A31配体RMSD：<5 Å（200 ns）；DBT-SLC29A4配体RMSD：<5 Å（200 ns）；APABA-TMEM163配体RMSD：>15 Å（200 ns）
逐残基相互作用剖析与疏水锚定机制
逐残基相互作用谱分析揭示，持续稳定性由高占有率（>80%）的疏水锚点控制，这些锚点在亲脂性UVFs周围形成刚性的"疏水陷阱"。相反，APABA与TMEM163的复合物则缺乏这种稳定的疏水锚定网络，与其观察到的结构不稳定性一致。
【数据】疏水锚点占有率：>80%；APABA-TMEM163疏水占有率：低于阈值
讨论与解读
本研究整合系统分子对接与MD模拟，阐明代表性有机UVFs与SLC转运蛋白之间的相互作用特征及其复合物的动态稳定性。SLC蛋白三维结构使用AlphaFold预测，其对新污染物的适用性已在先前研究中得到验证——AlphaFold预测结构已被用于执行内分泌干扰化学物质的全蛋白质组对接和相互作用网络分析，证明了其在揭示污染物-蛋白质相互作用多靶点多通路机制方面的可靠性。在此结构平台上，研究构建了涵盖51种UVFs和470个SLC蛋白的综合筛选数据库。据作者所知，这是首次建立UVFs跨膜相互作用谱的超家族级数据集。与先前聚焦孤立UVF-SLC相互作用的研究相比，本计算研究涵盖了整个人源SLC超家族。鉴于SLC转运蛋白是细胞代谢和外源物清除的关键守门人，这一广泛范围为预测全身性UVFs暴露诱导的器官特异性毒性和代谢紊乱提供了必要的系统性支持。
从合成生物学应用角度看，本研究的价值在于构建了一个可扩展的计算筛选框架——AlphaFold预测结构与高通量对接的结合，为缺乏实验结构的膜蛋白超家族提供了可行的功能预测路径。疏水占有率>80%的锚点概念为后续设计靶向SLC转运蛋白的分子探针或抑制剂提供了结构层面的设计原则。局限同样明显：所有结论基于计算预测，缺乏湿实验验证；AlphaFold模型对转运蛋白构象动态的捕捉能力有限，且200 ns模拟时间对于观察完整的转运周期可能不足。未来若能与体外转运实验或细胞摄取实验对接，该框架的预测效能将得到更充分检验。
参考来源
Xing R, Jiang Z, Wei T, Chen J, Zhang L. Probing the binding stability of organic UV filters to human SLC transporters using AlphaFold and molecular dynamics simulations. Sci Rep. PMID: 42249015. DOI: 10.1038/s41598-026-56714-z.
PMID: 42249015