来源：Optimization of fermentation parameters for the valorization of tomato pomace into biomass to produce single cell protein using Saccharomyces cerevisiae.（Bioresour Bioprocess）| 编译：DNA Lab Space
导读
番茄加工产业每年产生大量皮渣副产物，传统填埋焚烧处理面临环保压力。本研究以番茄皮渣水解液为碳源，利用酿酒酵母RX60进行单细胞蛋白生产，通过全因子设计结合响应面分析，系统优化了固形物负荷、接种量和发酵周期三个关键参数。最优条件下干细胞重量达6.25 g/L，粗蛋白含量38.40%，为番茄加工废弃物的高值化利用提供了可复现的技术路径。
研究背景
番茄是全球消费量最大的蔬菜之一，既可鲜食也加工为酱料、果汁等产品。2024年全球番茄加工量达到4580万吨。加工过程中产生大量以果皮、种子和果肉残渣为主的番茄皮渣，约占原料重量的3–5%。传统填埋和焚烧处置方式因碳排放和环境影响而受限，循环生物经济战略下，将番茄皮渣转化为高附加值产品成为重要方向。
番茄皮渣富含膳食纤维、蛋白质、脂质、矿物质、多酚和类胡萝卜素。已有研究探索了从皮渣中提取油脂、果胶、蛋白质、生物活性化合物，以及开发可降解包装膜等用途。此外，皮渣中较高的碳水化合物含量可通过水解产生还原糖，为微生物发酵提供碳源——这正是本研究的技术切入点。
研究方法
酵母活化与种子液制备
酿酒酵母RX60（Zymaflore RX60，Laffort，法国）接种于含1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖的YPD培养基中，在30°C、200 rpm条件下于轨道摇床（JSSI-050T，JSR，韩国）培养18小时。培养后的酵母细胞划线接种于营养琼脂平板，30°C培养24小时。随后将菌落转接至YPD培养基，在相同条件下培养。菌种以50:50甘油-水溶液混合后保存于-80°C冰箱备用。
发酵实验前，在250 mL锥形瓶中加入50 mL YPD培养基，于高压灭菌锅（FD50A-Uniclave，Zealway，中国）中121°C灭菌15分钟。培养基冷却后接种保藏菌种，30°C、200 rpm培养18小时。使用酶标仪（FlexA-200 Microplate Reader，Allsheng，中国）测定600 nm处光密度（OD600）监测细胞生长。吸光值通过标准曲线换算为干细胞重量（g/L），标准曲线覆盖0.05–0.7 g/L的干细胞重量范围，按Mazi（2010）所述方法制备。
【数据】培养基：YPD（1%酵母提取物+2%蛋白胨+2%葡萄糖）；温度：30°C；转速：200 rpm；时间：18h；OD600监测；标准曲线范围：0.05–0.7 g/L
底物与成分分析
干燥番茄皮渣购自番茄酱生产工厂（TAT Gıda Sanayi A.Ş.，布尔萨，土耳其）。物料经配备0.5 mm筛网的转子磨（Pulverisette 16，Fritsch，德国）粉碎后，于4°C密封袋中储存备用。水分含量采用红外水分分析仪（MAC 50，Radwag，波兰）测定。总蛋白含量采用凯氏定氮法测定，氮-蛋白换算系数取5.45（适用于番茄皮渣）。脂肪含量采用索氏提取法（EFLAB，土耳其），以正己烷为溶剂，参照Zhao和Zhang（2013）的方法略作修改。灰分含量于马弗炉（Electro-mag，土耳其）中600°C焚烧8小时测定。碳水化合物含量按差减法计算至100%。
【数据】粉碎筛网：0.5 mm；储存温度：4°C；蛋白换算系数：5.45；灰分测定：600°C、8h
发酵样品制备
番茄皮渣作为发酵碳源。水解条件依据Akgun等人（2025）报道的最高还原糖产量确定。首先在高压灭菌锅中121°C水热预处理15分钟，浆料冷却至50°C后，加入4.24%（v/w）Pectinex Ultra Pulp和6.20%（v/w）Cellic CTec3（Novozymes，丹麦）进行酶解。酶解在50°C、75 rpm条件下于振荡水浴中进行18小时。水解液经纱布过滤去除不溶性纤维组分，然后3000 × g离心15分钟（NF 1200/1200R，Nuve，土耳其）获得澄清发酵培养基。最后用1 M NaOH调节pH至5.0，接种前经121°C灭菌15分钟。
【数据】水热处理：121°C、15min；酶解：4.24%（v/w）Pectinex Ultra Pulp + 6.20%（v/w）Cellic CTec3，50°C、75rpm、18h；离心：3000 × g、15min；pH：5.0（1M NaOH调节）；灭菌：121°C、15min
生物反应器发酵条件
分批发酵在3 L夹套生物反应器中进行，配备六叶Rushton涡轮搅拌器、气体分布器、温度/pH/泡沫传感器及控制系统，并配有溶解氧（DO）探针连续监测（Biopex A，Unopex，土耳其）。每次实验工作体积为1.5 L。温度、pH、搅拌速度和通气速率分别维持在30°C、pH 5.0、200 rpm和1.2 L/min。200 rpm的搅拌速度旨在最小化对酵母细胞的剪切应力，同时保持充分混合。pH通过自动控制器以0.2 M NaOH和0.1 M H₂SO₄全程维持在5.0。必要时向发酵培养基中添加消泡剂溶液（1:50稀释）。发酵过程持续5天，每天取样分析。
【数据】反应器：3L夹套式；工作体积：1.5L；温度：30°C；pH：5.0；搅拌：200rpm；通气：1.2L/min；pH调节剂：0.2M NaOH/0.1M H₂SO₄；发酵周期：5天
实验设计与统计建模
采用两步统计实验设计（DOE）方法评估发酵参数对干细胞重量（g/L）的影响。首先，采用3 × 3 × 5混合水平结构的全因子设计（FFD），考察三个自变量：固形物负荷（5%、10%、15% w/v）、接种量（1%、2%、3% v/v）和发酵周期（五个水平），具体见表1。实验设计使用Minitab软件（Version 19，Minitab，英国）生成，共45个实验条件（表2）。较大的实验次数提高了统计模型的稳健性和可靠性。所有实验均设三次重复。
表1 全因子设计用于生物量生产优化的实验因素与水平
| 因素 | 水平 |
|------|------|
| 固形物负荷（%w/v） | 5, 10, 15 |
| 接种量（%v/v） | 1, 2, 3 |
| 发酵周期（天） | 1, 2, 3, 4, 5 |
表2 干细胞重量生产的全因子实验设计矩阵
| 序号 | 固形物负荷（%w/v） | 接种量（%v/v） | 发酵周期（天） | 干细胞重量（g/L） |
|------|-------------------|---------------|---------------|-------------------|
| 1 | 5 | 1 | 1 | 1.04 ± 0.30 |
| 2 | 5 | 1 | 2 | 2.23 ± 0.79 |
| 3 | 5 | 1 | 3 | 4.18 ± 1.02 |
| 4 | 5 | 1 | 4 | 5.39 ± 1.10 |
| 5 | 5 | 1 | 5 | 5.21 ± 0.06 |
| 6 | 5 | 2 | 1 | 1.07 ± 0.09 |
| 7 | 5 | 2 | 2 | 3.00 ± 0.06 |
| 8 | 5 | 2 | 3 | 4.09 ± 0.02 |
| 9 | 5 | 2 | 4 | 5.02 ± 0.15 |
| 10 | 5 | 2 | 5 | 4.30 ± 0.17 |
| 11 | 5 | 3 | 1 | 0.62 ± 0.21 |
| 12 | 5 | 3 | 2 | 3.00 ± 0.36 |
| 13 | 5 | 3 | 3 | 4.58 ± 0.20 |
| 14 | 5 | 3 | 4 | 4.40 ± 0.54 |
| 15 | 5 | 3 | 5 | 4.64 ± 0.73 |
| 16 | 10 | 1 | 1 | 1.48 ± 0.80 |
| 17 | 10 | 1 | 2 | 2.67 ± 0.53 |
| 18 | 10 | 1 | 3 | 4.03 ± 0.47 |
| 19 | 10 | 1 | 4 | 5.26 ± 0.51 |
| 20 | 10 | 1 | 5 | 6.06 ± 0.63 |
| 21 | 10 | 2 | 1 | 2.78 ± 0.84 |
| 22 | 10 | 2 | 2 | 5.29 ± 0.97 |
| 23 | 10 | 2 | 3 | 7.02 ± 1.08 |
| 24 | 10 | 2 | 4 | 7.52 ± 0.80 |
| 25 | 10 | 2 | 5 | 6.86 ± 0.87 |
| 26 | 10 | 3 | 1 | 1.08 ± 0.22 |
| 27 | 10 | 3 | 2 | 3.94 ± 0.89 |
| 28 | 10 | 3 | 3 | 5.72 ± 0.84 |
| 29 | 10 | 3 | 4 | 6.49 ± 0.51 |
| 30 | 10 | 3 | 5 | 6.50 ± 0.60 |
| 31 | 15 | 1 | 1 | 1.19 ± 0.21 |
| 32 | 15 | 1 | 2 | 1.71 ± 0.13 |
| 33 | 15 | 1 | 3 | 4.53 ± 0.41 |
| 34 | 15 | 1 | 4 | 5.98 ± 0.50 |
| 35 | 15 | 1 | 5 | 6.38 ± 0.23 |
| 36 | 15 | 2 | 1 | 2.27 ± 0.66 |
| 37 | 15 | 2 | 2 | 2.94 ± 0.54 |
| 38 | 15 | 2 | 3 | 3.77 ± 0.14 |
| 39 | 15 | 2 | 4 | 4.90 ± 0.57 |
| 40 | 15 | 2 | 5 | 5.50 ± 0.69 |
| 41 | 15 | 3 | 1 | 1.38 ± 0.47 |
| 42 | 15 | 3 | 2 | 2.46 ± 0.47 |
| 43 | 15 | 3 | 3 | 3.62 ± 0.78 |
| 44 | 15 | 3 | 4 | 5.29 ± 0.94 |
| 45 | 15 | 3 | 5 | 5.88 ± 0.65 |
数值表示为均值 ± 标准误（n = 3）
全因子设计使研究者能够评估所选变量的主效应及其对干细胞重量的潜在交互作用。随后，将二阶多项式回归模型拟合至实验数据，描述自变量与响应之间的关系，并通过响应面分析确定生物量生产的最优区域。为保持模型简洁并提高预测精度，通过向后消去法移除不显著项（p > 0.05），同时维持模型层次性原则。
二阶多项式模型包含线性项、二次项和交互项，按以下方程拟合实验数据：
Y = β₀ + Σβᵢxᵢ + Σβᵢᵢxᵢ² + ΣΣβᵢⱼxᵢxⱼ
其中Y为预测响应（干细胞重量），k为自变量个数。
【数据】实验设计：3×3×5全因子设计；实验条件：45组；重复：3次；模型：二阶多项式回归；显著性阈值：p > 0.05剔除
研究结果
番茄皮渣成分分析
本研究所用番茄皮渣的化学成分见表3。尽管成分可能因番茄品种和加工条件而异，但番茄皮渣总体上以高碳水化合物含量为特征。该碳水化合物组分可水解产生还原糖，在发酵过程中作为碳源。
在相同条件下水解后，不同固形物负荷下的初始还原糖浓度分别为：5%（w/v）固形物负荷时17.60 ± 2.15 g/L，10%时30.87 ± 1.35 g/L，15%时38.23 ± 1.21 g/L。固形物负荷增加使水解液中还原糖浓度升高，但增幅与固形物负荷不成比例——这是高固形物效应所致。在木质纤维素酶解中，高固形物效应会降低水解速率，因为自由水变得稀缺。自由水减少会增加表观粘度和屈服应力，削弱混合效果并造成传质传热限制。
除碳水化合物外，番茄皮渣中的蛋白质提供了补充氮源，有利于发酵过程中微生物生长。这种营养组成凸显了番茄皮渣作为微生物生物量生产底物的潜力。
表3 番茄皮渣的近似成分分析
| 成分 | % 干基 |
|------|--------|
| 粗蛋白 | 16.21 ± 0.11 |
| 脂肪 | 9.88 ± 0.05 |
| 碳水化合物 | 69.31 ± 0.15 |
| 灰分 | 4.16 ± 0.06 |
数值表示为均值 ± 标准误（n = 3）
【数据】还原糖浓度（5%固形物）：17.60 ± 2.15 g/L；还原糖浓度（10%固形物）：30.87 ± 1.35 g/L；还原糖浓度（15%固形物）：38.23 ± 1.21 g/L；粗蛋白：16.21 ± 0.11%；脂肪：9.88 ± 0.05%；碳水化合物：69.31 ± 0.15%；灰分：4.16 ± 0.06%
微生物生长特征
酿酒酵母在22.5小时培养期内的生长曲线如图1所示，用于确定最佳接种生理状态。生长曲线显示培养物在大约18小时达到对数生长后期。因此，该时间点被选为后续发酵实验的标准接种时间。在对数生长后期收获接种物可确保酵母细胞具有高代谢活性和活力，这对高效启动发酵至关重要。酿酒酵母在对数期的最大比生长速率（µmax）计算为1.084 h⁻¹。这一较高的生长速率表明该菌株在本研究培养条件下具有强代谢活性和快速适应能力。
图1 酿酒酵母生长曲线
【数据】培养时间：22.5h；接种时间点：18h（对数后期）；µmax：1.084 h⁻¹
输入变量对干细胞重量和生长动力学的影响
不同发酵条件下获得的干细胞重量见表2。发酵过程中还原糖浓度与生物量生产之间的动态关系如图2所示。图2a、b、c分别对应1%、2%、3%（v/v）接种量。
随着发酵进行，还原糖浓度逐渐下降而干细胞重量增加，表明底物被积极消耗并形成生物量。发酵约第2–3天后，还原糖浓度开始趋于稳定，尤其在5%和10%固形物负荷下（图2），而生物量生产持续增加直到第4–5天达到最大值。这一观察结果表明酵母生长并非仅依赖初始可用的还原糖。
还原糖浓度趋于稳定而生物量持续增加的现象，部分可由二次生长转换（diauxic shift）解释。发酵前48小时内，酿酒酵母快速消耗培养基中易得的还原糖（主要是葡萄糖和果糖），导致生物量快速形成。当这些偏好碳源受限后，酵母进行代谢重编程，开始利用替代底物。在这一二次生长阶段，初始发酵代谢产生的乙醇以及其他代谢物（如有机酸和甘油）可作为替代碳源支持细胞进一步生长和蛋白质合成。
此外，酵母细胞可能代谢水解液中非还原性或初始未检测到的碳水化合物。例如，蔗糖等非还原性二糖可在胞内水解后用于呼吸作用。木质纤维素底物水解液通常含有戊糖和己糖的混合物。酿酒酵母能高效代谢己糖，但戊糖利用通常因碳分解代谢物阻遏机制而受限。因此，发酵培养基中残留的还原糖可能主要由酵母不易代谢的戊糖构成。
类似糖利用与生物量形成的关系在以往研究中已有报道。Yang等人（2025）在共培养发酵系统中观察到，随着可发酵糖利用率提高，单细胞蛋白含量从32.5%增加到36.0%。
在测试条件中，最高干细胞重量（7.52 g/L）在10%固形物负荷、2%接种量、发酵4天后获得。需要指出的是，这一单点观测值超过了后续模型预测的最优值6.92 g/L。这是预期的结果——多项式模型代表的是拟合全部135个数据点的平滑曲面，而非对单个观测值的直接插值。因此，模型最优值反映的是重复实验中最一致可达到的最大值，而非最高单次测量值。虽然增加固形物负荷提高了初始还原糖浓度，但并未按比例加速生物量形成（图2b和c）。
图2 不同固形物负荷和接种量下发酵过程中还原糖浓度与干细胞重量的变化，(a) 1%、(b) 2%、(c) 3%（v/v）接种量
计算的比生长速率、生物量倍增时间和生物量产率见表4。较高的比生长速率通常表示更快的生物量形成和SCP积累。然而，底物利用并不总能转化为高效的生物量或蛋白质生产。在某些条件下，支持较高比生长速率的代谢途径可能导致较低的生物量产率，而与较高产率相关的途径往往导致较慢的生长速率。这种生长速率与产率之间的权衡可能发生在氧限制条件下，此时代谢通量转向发酵途径而非生物量合成。发酵过程中溶解氧的实时观测显示，在生物量积累高峰期，DO从初始饱和（约100%）下降至最低3–5%，且高固形物负荷和高接种量下的下降幅度始终比低水平更明显，随后随发酵末期生长减缓而部分恢复（至25–30%）。
此外，生长速率可影响微生物生物量的生化组成。较低的比生长速率通常与较高的胞内蛋白质比例和改变的氨基酸谱相关，而较高的生长速率有利于快速生物量积累，但可能导致RNA含量增加和单位细胞蛋白质浓度降低。这些观察结果强调，发酵性能不仅取决于生物量产量，还取决于微生物的生理状态和代谢调控。值得注意的是，生物量产率系数（YX/S）未显示出显著差异……
图3 响应面与等高线图：各因素对干细胞重量的影响
【数据】最高干细胞重量：7.52 g/L（10%固形物+2%接种量+4天）；DO最低值：3–5%；DO恢复值：25–30%；Yang等报道SCP含量：32.5%→36.0%
讨论与解读
本研究系统考察了关键发酵参数对以番茄皮渣水解液为底物生产单细胞蛋白的影响。番茄皮渣来源的还原糖成功用作碳源，证明将番茄加工废弃物转化为高价值替代蛋白资源具有可行性，有助于减轻食品工业的环境负担。
全因子实验设计结合二阶多项式回归实现了发酵过程的系统优化。结果表明，中等水平的固形物负荷和接种量有利于发酵过程中的生物量生产。最优发酵条件为10.35%（w/v）固形物负荷、2.07%（v/v）接种量和5天发酵周期，对应预测干细胞重量6.92 g/L。实验验证在此条件下获得6.25 g/L干细胞重量和38.40%粗蛋白含量，证实了模型的充分性。
未来研究应探索进一步提高生物量产率和蛋白质含量的具体策略，包括溶解氧控制以防止高细胞密度下的氧限制、补充氮源等。
编译者解读
本研究的方法学亮点在于采用全因子设计而非常用的单因素轮换法，45组实验的规模为响应面拟合提供了扎实的数据基础。值得关注的是，模型预测值（6.92 g/L）与实验验证值（6.25 g/L）存在约10%的偏差，这在生物系统中属于可接受范围，但也提示高固形物体系中的非理想混合效应可能未被模型完全捕捉。从应用角度看，38.40%的粗蛋白含量已接近传统饲料蛋白源的水平，但距离商业化生产仍需考虑水解酶成本的优化和连续发酵模式的探索。溶解氧在高峰期降至3–5%的现象提示，供氧策略可能是进一步提升生物量产率的关键杠杆点。
参考来源
Akgun AS, Cabuk DS, Cinar D, Alp O, Kaya D. Optimization of fermentation parameters for the valorization of tomato pomace into biomass to produce single cell protein using Saccharomyces cerevisiae. Bioresour Bioprocess. PMID: 42606756. DOI: 10.1186/s40643-026-01115-3.
PMID: 42606756