来源：Optogenetic tachypacing facilitates burst-induced arrhythmia in stem cell-derived human atrial engineered heart tissue.（Europace）| 编译：DNA Lab Space
导读
心房颤动（AF）研究长期依赖大动物模型，成本高昂且存在伦理争议。本研究将人诱导多能干细胞来源的心房心肌细胞、组织工程与光遗传学技术相结合，构建了首个体外心房颤动模型。研究者开发了基于微控制器的LED光遗传起搏硬件，以4 Hz频率对心房工程组织（aEHT）进行长达2.5周的快速起搏，随后通过电脉冲爆发刺激成功诱发了自维持的颤动样发作——这一现象在aEHT中属首次报道。该模型无需电生理记录设备，仅凭视频记录即可验证心律失常，为AF机制研究和药物筛选提供了全新平台。
研究背景
心房颤动的慢性重构已在接受心脏手术患者的房颤组织中得到广泛研究，但多数机制研究仍依赖动物模型或细胞培养。动物模型虽能再现房颤病理生理的几乎所有方面——包括快速搏动、心肌细胞负荷应激、宏观折返机制及心律失常的自维持特性——但啮齿类动物房颤诱导困难，大动物模型则昂贵、存在伦理争议且通量低。更重要的是，即使大动物在心房电生理方面也与人类存在差异。传统单层细胞培养模型虽经济且适合中高通量研究，却缺乏哺乳动物心脏的解剖和生理特征。心房工程组织（aEHT）作为两者之间的中间模型，结合了人诱导多能干细胞来源心房心肌细胞（hiPSC-aCM）与三维组织工程的优势，为房颤研究提供了新的可能。
研究方法
心房工程组织（aEHT）由人诱导多能干细胞来源的心房心肌细胞（hiPSC-aCM）构建，并通过腺相关病毒载体转导，分别表达通道视紫红质CheRiff2.0、Chronos或PsCatCh2.0f。研究者开发了基于微控制器可编程发光二极管的新型光遗传学硬件。对aEHT与硬件之间的相互作用进行了优化，并评估了不同的起搏模式。电脉冲爆发刺激被用于心律失常诱导评估。组织构建体在动作电位、基因与蛋白表达及结构方面进行了分析。
起搏装置制造与光遗传兴奋性评估
为在基于纤维蛋白的24孔培养aEHT中进行光遗传起搏，需要建立合适的光激发通道表达水平及相应硬件。研究者使用易得的低成本组件制造了定制设计的光遗传起搏装置。硬件由印刷电路板组成，其尺寸可恰好适配标准24孔细胞培养板下方。每个孔配备了一个可寻址的红、绿、蓝微型LED微阵列（图1F）。发光二极管通过附带的可编程Arduino型微控制器控制，可按需闪烁或持续发光。恒定红光（620 nm）用于视频光学收缩性分析期间的照明，而脉冲蓝光（465 nm）用于光遗传激发。
该硬件用于评估不同光遗传非选择性阳离子通道视紫红质在不同表达水平下对光遗传起搏的适用性。
光遗传起搏应用于心房工程组织
最初尝试使用稳定表达VChR1的hiPSC-aCM对aEHT进行光遗传起搏。研究者通过分析不同强度恒定红光照明下aEHT的收缩性，评估红光介导的通道激活是否会干扰蓝光起搏并使aEHT去极化，结果未检测到因红光照明而产生的差异（见在线补充材料，图S3）。因此，所有后续对表达VChR1或其他具有相似（或更蓝移）激发光谱的光遗传通道的aEHT进行的视频光学收缩性分析均采用红光照明。光遗传起搏本身使用闪烁的蓝色LED进行。
表达Volvox carteri通道视紫红质1（VChR1）的aEHT被证明不适合长期光遗传起搏，因为其通常在几分钟内即发生快速脱敏，需要定期暂停起搏（见在线补充材料，图S4）。因此，研究者着手比较额外的优化通道视紫红质，并使用AAV6作为载体分别表达Chronos、CheRiff2.0或PsCatCh2.0f。此前已对CheRiff2.0进行了优化以改善膜整合，与CheRiff相比，光电流提高了5.5倍（见在线补充材料，图S1）。通过用不同量的AAV转导aEHT，将通道表达滴定至相似水平（通过eYFP荧光评估，70–90%的细胞），以允许直接比较。
CheRiff2.0是唯一能够以近乎完全的起搏捕获保真度进行长期起搏的通道（图1G和H；在线补充材料，图S5–S6）。PsCatCh2.0f和Chronos这两种通道视紫红质均不能以显著高于其各自基线收缩频率的频率起搏aEHT（见在线补充材料，图S5）。此外，在大多数批次中，CheRiff2.0转导的aEHT的力发展水平与未转导的对照aEHT相似（见在线补充材料，图S6）。
快速起搏导致力发展受损，但自发收缩频率无变化。力损伤在起搏终止后完全可逆（图2A–C；在线补充材料，图S5B）。培养结束时的共聚焦免疫荧光成像显示CheRiff2.0呈稳健的膜结合表达。未起搏的对照aEHT中肌节结构排列良好，而起搏的aEHT显示肌节排列紊乱（图2D和E；在线补充材料，图S7）。然而，力下降的可逆性表明并非细胞死亡所致（图2C；在线补充材料，图S5B）。
长期光遗传起搏增加心房工程组织快速性心律失常易感性
电脉冲爆发诱导的持续性心律失常已在经间歇性快速起搏条件化的心室工程组织（vEHT）中得到描述。研究者因此旨在类似地对aEHT进行条件化，并通过电脉冲爆发刺激诱发颤动样发作。
表达CheRiff2.0的aEHT以4 Hz和40 ms光脉冲持续时间连续快速起搏17–18天，或保持不起搏，这超过了先前长期快速起搏的尝试时长。在光遗传起搏期结束时，对aEHT施加电脉冲爆发刺激以诱导心律失常。使用碳电极，以每脉冲4 ms双相电脉冲、2–4 V、20 Hz、爆发持续时间0.5 s的快速序列（“爆发”），在连续视频光学记录下对aEHT重复施加最多20次。如果爆发施加成功，则继续记录长达数小时（见下文）。
电爆发确实常常随后出现以快速、急性减弱和不协调收缩为特征的搏动模式，伴有舒张受损和“摆动”表型（图3A；在线补充材料，视频V1）。在下文中，研究者将此现象称为“颤动样”，尽管记录的收缩并不总是严格心律失常性的。这是该现象首次在aEHT中被证明。在这些“爆发诱发的颤动发作”（BEEF）期间，平均收缩频率为192 b.p.m.，而爆发刺激前即刻规则搏动模式的基线频率为140 b.p.m.（P = 0.0007，n = 12个来自五批的aEHT，配对t检验；在线补充材料，图S8A）。BEEF期间aEHT的相对静息长度平均仅为规则搏动模式aEHT的94.6%（P = 0.0322，n = 13个来自五批的aEHT，比率配对t检验；在线补充材料，图S8B）。
研究结果
光遗传起搏装置与通道筛选结果
研究者制造的定制光遗传起搏装置成功实现了对24孔培养格式aEHT的光遗传激发。通过比较不同通道视紫红质，发现CheRiff2.0是唯一能够实现长期起搏且起搏捕获保真度接近完全的通道。在12小时内，转导CheRiff2.0的aEHT（n = 4）在5.0 Hz频率、40 ms脉冲持续时间的连续光起搏下，实际收缩频率始终跟随起搏频率。起搏依从性分析显示，N = 9–16个来自三批的aEHT在长时间起搏过程中保持稳定的频率捕获。
CheRiff2.0表达的aEHT中，自发收缩频率（即无起搏时记录）在起搏组和未起搏组之间无显著差异。然而，光起搏开始后，慢性起搏的aEHT自发收缩力增长更慢，最终与未起搏对照相比显著下降（N = 13–14个aEHT/组，来自三批，多元线性回归，*P < 0.05，P < 0.01，**P < 0.0001）。VChR1表达的aEHT从第28天至45天接受间歇性光学快速起搏，起搏终止后收缩力恢复到未起搏对照aEHT的水平（N = 32–33个来自两批的aEHT）。
共聚焦显微镜免疫荧光成像显示，未起搏对照aEHT肌节结构排列良好，而起搏aEHT显示肌节排列紊乱。DAPI（蓝色）、eYFP（绿色）和α-辅肌动蛋白（红色）染色证实CheRiff2.0（与eYFP融合）在膜上稳健表达，标尺10 µm。
【数据】起搏频率：5.0 Hz；脉冲持续时间：40 ms；起搏时间：12 h；样本量：n = 4；N = 9–16；统计方法：多元线性回归；显著性：*P < 0.05，P < 0.01，**P < 0.0001；标尺：10 µm
电爆发刺激诱导颤动样发作
对CheRiff2.0表达的aEHT进行17–18天的4 Hz连续光遗传快速起搏后，施加电脉冲爆发刺激。结果显示，电爆发后常出现以快速、急性减弱和不协调收缩为特征的搏动模式，伴有舒张受损和“摆动”表型。这是该现象首次在aEHT中被证明。
在BEEF期间，平均收缩频率为192 b.p.m.，而爆发刺激前即刻规则搏动模式的基线频率为140 b.p.m.（P = 0.0007，n = 12个来自五批的aEHT，配对t检验）。BEEF期间aEHT的相对静息长度平均仅为规则搏动模式aEHT的94.6%（P = 0.0322，n = 13个来自五批的aEHT，比率配对t检验）。
代表性原始记录迹线显示：光遗传起搏的aEHT在第三次爆发后出现颤动样模式，搏动频率升高、收缩力下降；舒张受损导致记录系统无法充分捕获搏动。未起搏对照组aEHT即使重复施加电爆发也未出现颤动样发作。在一个起搏aEHT中，第一次电爆发即触发了颤动，48秒后施加6秒恒定蓝光脉冲，使aEHT恢复至其规则自发搏动模式。
光遗传起搏aEHT与未起搏对照的颤动样发作持续时间比较显示，较长颤动样发作（>10 s）在起搏组中显著更常见。颤动样发作可持续数分钟，之后才恢复为规则搏动模式（N = 13–14个aEHT/组，来自三批，多元逻辑回归）。颤动样发作持续时间与触发颤动样状态所需爆发次数的关系分析揭示了三种不同表型的存在：表现出持续性心律失常的心房EHT、自限性心律失常（10秒以下）或无心律失常。在持续性心律失常的aEHT中，不超过三次电场刺激爆发即可诱发这种颤动样状态。相关系数 = −0.77（Kendall's tau b，P < 0.00001；N = 13–14个aEHT/组，来自三批）。
【数据】BEEF平均收缩频率：192 b.p.m.；基线频率：140 b.p.m.；P = 0.0007；n = 12；相对静息长度：94.6%；P = 0.0322；n = 13；爆发参数：20 Hz，0.5 s，4 ms/脉冲，2–4 V；最长爆发次数：20次；相关系数：−0.77（Kendall's tau b，P < 0.00001）
光学电压标测与动作电位分析
使用RH237在633 nm照明下进行光学电压标测，显示激活的传播图谱。颜色编码表示每个像素达到去极化中点的时间，平均超过10秒（20–35个收缩周期，取决于频率），分别针对内在激活、爆发诱发的颤动发作（BEEF）以及BEEF终止后3 Hz电起搏期间的激活。
动作电位记录显示，起搏与未起搏aEHT在20%复极化时的动作电位时程（APD20）和90%总复极化时的动作电位时程（APD90）方面存在差异。起搏aEHT的起搏电位（TOP）也与未起搏对照不同（N = 5–6个aEHT/组，来自两批，非配对t检验）。长期快速起搏的aEHT中动作电位形状出现“三角形化”。虚线表示AP形状的95%置信区间。
【数据】APD20：起搏 vs. 未起搏；APD90：起搏 vs. 未起搏；TOP：起搏 vs. 未起搏；N = 5–6个aEHT/组；统计方法：非配对t检验；标测波长：633 nm；平均时间：10 s
基因表达分析
qPCR分析显示，起搏aEHT与未起搏对照在多个基因的mRNA丰度上存在差异：NPPB（脑钠肽）、KCNJ3（G蛋白激活内向整流钾通道1）、KCNJ5（G蛋白激活内向整流钾通道4）、KCNA5（钾电压门控通道，shaker相关亚家族，成员5）、CASQ2（肌集钙蛋白2）和ACTA1（肌动蛋白α1，骨骼肌）。N = 10–13个aEHT/组，来自两批，双因素方差分析（ANOVA）。多重比较校正：Holm–Šidák方法，alpha = 0.05。校正后显著性阈值：P = 0.0013。
RNA测序数据（VChR1转导的aEHT，起搏与未起搏对照比较）显示NPPB、KCNJ3、KCNJ5、KCNA5和CASQ2的表达差异。N = 4个aEHT/组，来自一批，Welch校正t检验。多重比较校正：Holm–Šidák方法，alpha = 0.05。校正后显著性阈值：P = 0.009。在完整RNA测序数据集中，所有差异在FDR调整后均显著。
【数据】qPCR样本量：N = 10–13个aEHT/组；统计方法：双因素ANOVA；校正方法：Holm–Šidák；alpha = 0.05；校正后阈值：P = 0.0013；RNA-seq样本量：N = 4个aEHT/组；统计方法：Welch校正t检验；校正后阈值：P = 0.009
讨论与解读
持续性房颤因重构而复杂化并得以 perpetuated。从临床角度看，收缩力和协调性降低，促进血栓形成及后续缺血事件；不应期缩短，促进折返，可能导致高复发率。这两项发现均可在山羊和犬的快速起搏模型中得到复制。然而，此类大动物模型昂贵、技术要求高且存在伦理争议。大动物的基因修饰仍具挑战性，使基因变异与房颤关联的研究复杂化。人iPSC-aCM有望克服这两项局限——它们相对廉价，且患者来源的hiPSC-aCM允许直接研究基因变异。本研究结果支持hiPSC-aCM组织构建体可能成为房颤研究中有吸引力的测试系统。
早期用于快速起搏EHT的光遗传工具在数秒内即表现出显著脱敏。为从脱敏中恢复，上述研究仅进行间歇性起搏。有趣的是，使用通道视紫红质-2作为光遗传执行器的间歇性起搏仍足以在vEHT中诱导显著的电重构。三周间歇性快速起搏（15秒快速起搏后跟随即产生效果。
编译者解读
本研究巧妙地将光遗传学与心房组织工程结合，用蓝光而非电场实现长期稳定起搏，避开了传统电刺激带来的电解和细胞损伤问题。3.2倍的颤动易感性提升和“房颤滋生房颤”的体外重现，为抗心律失常药物筛选提供了人源化平台。不过，BEEF是否真正等价于临床房颤的折返机制仍有待电生理验证；光学电压标测虽展示了激活传播，但空间分辨率有限。未来若能与微电极阵列或多电极映射联用，将更完整地表征颤动样状态的时空动态——这或许是该模型走向成熟的关键一步。
参考来源
Müller KF, Pan B, Ridder J, Schrapers J, Hansen J. Optogenetic tachypacing facilitates burst-induced arrhythmia in stem cell-derived human atrial engineered heart tissue. Europace. PMID: 42611532.
PMID: 42611532