来源：Semantic Scholar | 编译：DNA Lab Space
导语
随着合成染料在纺织、印染行业的广泛使用，含染料废水的生物治理成为全球性环境难题。漆酶作为一种多铜氧化酶，能够催化多种芳香族污染物的氧化降解，在绿色水处理领域备受关注。近日，科研人员从深海来源的嗜碱盐单胞菌 *Halomonas alkaliantartica* 中克隆并表达了一种新型细菌漆酶，经系统表征后展现出卓越的染料脱色能力，尤其是在高盐碱性条件下对多种顽固染料的去除效率远超同类已报道酶，为工业印染废水的生物修复提供了理想的候选酶制剂。
研究背景
合成染料虽然赋予纺织品丰富的色彩，但也因其复杂的芳香环结构和难以生物降解的特性成为重要环境污染物。传统的物理化学处理方法（如混凝、吸附、高级氧化）成本高昂或容易产生二次污染，而生物酶法因反应条件温和、催化效率高、底物专一性强而显示出独特优势。漆酶（EC 1.10.3.2）是生物法脱色领域最具潜力的酶之一，它利用分子氧作为电子受体，将底物氧化为相应的自由基，并最终将氧气还原成水，整个过程无需昂贵的辅因子，经济环保。然而，大多数真菌漆酶在酸性至中性条件下表现最佳，对高盐、碱性环境极为敏感；而纺织印染废水往往pH高、含盐量大，这使得真菌漆酶的实际应用严重受限。
近年来，来自海洋极端环境微生物的细菌漆酶因耐受极端pH和盐度而备受关注。深海嗜盐或嗜碱细菌的漆酶很可能具有独特的适应机制，能在印染废水的恶劣条件下保持稳定和高活性。*Halomonas alkaliantartica* 是一株分离自南极深海沉积物的极端细菌，已知其能够耐受高碱性和高盐环境，但其漆酶基因资源尚未被发掘。因此，从该菌中克隆、异源表达漆酶基因，并系统评估其酶学性质和染料脱色能力，对于拓展极端酶制剂库、实现在实际印染废水处理中的应用具有重要意义。
研究方法
研究团队首先从 *Halomonas alkaliantartica* 基因组中筛选到一个预测的漆酶编码基因 *lacH*，通过信号肽分析与序列比对确认其为细菌多铜氧化酶家族成员。通过PCR扩增获得成熟蛋白编码序列，并将其克隆到pET‑28a表达载体中，转化至 *Escherichia coli* BL21(DE3) 感受态细胞，构建了重组表达体系。采用异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达，在16°C低温条件下过夜培养，以提高可溶性蛋白的比例。裂解菌体后，利用镍离子螯合层析（Ni‑NTA）对带有His标签的重组漆酶LacH进行纯化，得到电泳纯级别的蛋白，随后以ABTS (2,2‘‑联氮‑双‑3‑乙基苯并噻唑啉‑6‑磺酸)为底物测定酶活力及基本动力学参数。
在酶学性质研究中，系统考察了温度、pH和NaCl浓度对LacH活性和稳定性的影响，同时测试了不同金属离子、有机溶剂和抑制剂的作用，以评估其工业适应性。染料脱色实验选择了代表性偶氮染料（刚果红、活性黑5）、蒽醌染料（活性蓝19）、三苯甲烷染料（孔雀石绿）等多种结构类型染料，分别在无介体、添加天然介体（如乙酰丁香酮、丁香醛）和人工介体（ABTS）的条件下测定脱色率。利用紫外‑可见分光光度法监测染料最大吸收峰的下降，并通过高效液相色谱（HPLC）分析降解产物，初步探究脱色机理。所有实验均设置平行和平行对照，采用方差分析进行统计学检验。
研究结果
研究表明，*lacH* 基因全长为1476 bp，编码一个由491个氨基酸组成的成熟漆酶蛋白，具有完整的T1铜、T2铜和双核T3铜结合保守基序。重组LacH在 *E. coli* 中实现可溶性高效表达，经一步亲和层析获得纯度超过95%的目的蛋白，表观分子量约为53 kDa。以ABTS为底物时，LacH的最适反应温度为60°C，最适pH为4.0，但值得注意的是，在高碱性环境（pH 8.0–10.0）中依然保持50%以上的最高活性，显示出典型碱性漆酶特征。热稳定性实验显示，LacH在50°C下孵育2小时后仍保留80%以上活力，70°C下半衰期超过30分钟，具有突出的热稳定性，明显优于多数真菌漆酶。
盐度适应性是LacH最令人瞩目的特性之一：在0–2.0 M NaCl范围内，酶活性不仅未受抑制，反而在0.5 M NaCl时表现出约1.5倍的激活效应；即便在2.0 M NaCl（远超海水盐度）条件下，相对酶活依然保持在120%，体现了深海盐单胞菌漆酶独特的“嗜盐活化”机制。金属离子测试中，Cu²⁺和Mn²⁺显著提升酶活力，而EDTA和NaN₃则完全抑制，证实活性中心铜离子的关键作用。有机溶剂耐受性结果表明，LacH在10%（v/v）甲醇、乙醇或二甲基亚砜中仍保留80%以上相对活性，显示出优异的有机相催化潜力。
染料脱色实验中，LacH表现了宽广的底物谱和极高的脱色效率。在最优条件（pH 8.0，0.5 M NaCl，50°C）下，无需介体即可催化活性蓝19完全脱色（100%），对刚果红和活性黑5的脱色率分别达到92%和88%。当加入0.1 mM乙酰丁香酮作为氧化还原介体后，孔雀石绿脱色率由无介体时的65%跃升至97%，且脱色速度大幅提高，30分钟内即接近平衡。值得强调的是，该酶在模拟真实印染废水（pH 9.0，含5% NaCl）中的表现同样优异，对混合染料体系的总脱色率在3小时内超过90%，并能够在连续6个循环使用后保持初始脱色活性的70%以上，体现了极好的操作稳定性和再生利用价值。
HPLC分析表明，染料脱色伴随着发色基因的断裂和新极性小分子峰的生成，证实LacH催化染料发生氧化裂解而非单纯的吸附或聚集，且降解产物可生化性提高，有利于后续微生物联合处理。动力学参数测定显示，LacH对ABTS的Km值为0.32 mM，Vmax为12.5 U/mg，催化效率（kcat/Km）达到6.2×10⁴ M⁻¹s⁻¹，处于已报道细菌漆酶中的前列。
讨论与展望
Jingjing Wang 等人的这项工作首次从深海嗜碱盐单胞菌中挖掘并表征了一类极具应用潜力的细菌漆酶LacH，打破了传统漆酶在实际染料废水处理中耐受性差的瓶颈。LacH在碱性、高盐、高温“三高”极端条件下的卓越稳定性和脱离介体即可高效脱色蒽醌类染料的能力，源于其独特的氨基酸组成与蛋白质结构——这可能与深海低温高压但高盐偏碱的环境选择性压力有关。此外，盐离子对酶活的激活现象提示分子表面负电荷残基的协调作用，为蛋白质工程理性设计提供了重要启示。
虽然成果十分亮眼，但该研究仍处于实验室规模，距离工业化应用还需回答诸多问题：首先，重组表达的产量虽满足研究需求，但通过高密度发酵或分泌表达优化实现克级规模生产是必然方向；其次，固定化方案的选择与放大工艺中传质限制的解决，直接关系到连续流处理器的设计。更重要的是，真实纺织废水中成份极其复杂，除染料外还含有表面活性剂、盐类、浆料和助剂等，LacH在更多实际基质干扰下的耐受和催化表现尚待验证。此外，联合介体系统或与其他水解酶联用可能进一步拓宽底物范围、提高矿化程度。
值得期待的是，基于LacH抗逆性突出的优势，它不仅在废水处理领域有前景，还可能被拓展至高盐碱环境的生物修复、生物传感器及有机合成等方向。未来可结合结构生物学和定向进化策略，进一步解锁其催化机理并创造活性更强、稳定性更高的突变体，为绿色生物制造提供核心催化剂。
参考来源
> Jingjing Wang, Ran Zhang, Guilan Zhu, Lingling Wang, Han Bai. Expression of a deep-sea bacterial laccase from *Halomonas alkaliantartica* and its application in dyes decolorization. *Annals of Microbiology*, 2023. DOI: 10.1186/s13213-023-01723-w
DOI: 10.1186/s13213-023-01723-w