来源：Semantic Scholar | 编译：DNA Lab Space
**导语**
漆酶作为一种绿色多功能氧化酶，在环境修复、纺织染料脱色及生物炼制等领域展现广阔前景，但其工业生产长期受限于异源表达效率低与纯化流程复杂。近期，研究人员在《Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology》报道了一种精妙的基因替换策略：通过直接将栓菌来源的漆酶基因*lacA*定点整合至里氏木霉基因组中分泌量最大的纤维素酶基因*cbh1*位点，实现“借壳表达”。不仅漆酶产量显著跃升，更大幅削减了背景分泌蛋白，为丝状真菌细胞工厂的高效定制提供了全新范式。
研究背景
漆酶（EC 1.10.3.2）是一类含铜多酚氧化酶，能够催化多种酚类和非酚类底物的单电子氧化，同时将分子氧还原为水，几乎不产生有害副产物，因此被誉为“绿色催化剂”。白腐真菌，尤其是栓菌属（*Trametes*）所产的漆酶，因其较高的氧化还原电势和广泛的底物谱，在纸浆漂白、纺织品染料降解、有毒环境污染物转化以及生物传感器构建等工业领域备受关注。然而，天然菌株生长缓慢、产酶周期长且易受碳氮源阻遏，远不能满足大规模应用的需求，这使得利用重组微生物进行异源生产成为必然选择。
里氏木霉（*Trichoderma reesei*）凭借其卓越的蛋白质分泌能力（胞外蛋白可达100 g/L以上）和成熟的遗传操作体系，已成为生产同源纤维素酶及异源蛋白的重要底盘细胞，并被FDA认定为GRAS（公认安全）菌株。长期以来，研究人员通过游离质粒表达或随机多拷贝整合的方式，尝试在里氏木霉中生产异源漆酶，但效果常不尽如人意。根本问题在于，里氏木霉在纤维素类基质诱导下，会大量分泌以纤维二糖水解酶I（CBH1/TrCel7A）为主的内源纤维素酶，CBH1单独即可占到胞外总分泌蛋白的50%~60%。这不仅对碳源和能量构成了巨大的分流，使得异源蛋白居于翻译和分泌劣势，更导致后期目标蛋白纯化时需从繁杂的背景蛋白中“大海捞针”，极大抬升了工艺成本。
针对上述瓶颈，Zhang等人的研究另辟蹊径：既然CBH1的表达与分泌如此强大且占据主导，为何不直接将其编码基因“置换”为目标漆酶基因？通过同源重组手段，将*Trametes*来源的漆酶基因*lacA*精准嵌入染色体*cbh1*位点，可使漆酶基因获得内源强启动子和分泌信号肽的驱动，同时通过中断*cbh1*从根本上消除主要污染蛋白的产生，实现“一石二鸟”的改造目标。此前虽有利用*cbh1*启动子表达异源蛋白的先例，但多保留功能性的*cbh1*基因拷贝，鲜有直接替换并全面评估菌株分泌谱重构效应的报道。
研究方法
该研究的技术路线核心在于构建精准的基因替换盒，并通过优化的转化与筛选体系获得目标重组菌株。
**1. 替换载体设计与构建**
研究人员首先以质粒为骨架，克隆了里氏木霉高产突变株RUT-C30的*cbh1*基因位点上、下游各约1.5 kb的同源臂，用于介导高效的同源重组。在两个同源臂之间，插入了经密码子优化（适配里氏木霉偏好）的栓菌漆酶*lacA*全长开放阅读框（含自身信号肽序列，替换真菌的多铜氧化酶保守结构域）。为确保工程菌株的筛选，表达盒还携带了用于营养互补的*pyre4*（乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶）选择标记，同时或将标记基因设计为可后续切除的loxP-flanked形式，以消除标记对菌株代谢的影响。最终获得的重组质粒经酶切线性化后，纯化用于原生质体转化。
**2. 真菌转化与同源重组体的筛选**
将线性化的替换盒通过PEG介导的方法转化*T. reesei* RUT-C30 Δ*pyr4*营养缺陷型菌株的原生质体，并在不含尿苷的固体基本培养基上进行选择。初筛转化子经过单孢分离纯化后，提取基因组DNA进行分子鉴定。采用双重PCR策略初步筛选阳性克隆：一对引物跨越5’同源臂外侧基因组与*lacA*内部，另一对引物则检测*cbh1*基因的缺失。随后进一步经Southern印迹杂交验证单拷贝同源重组事件的正确性，确保*cbh1*编码区已被*lacA*完整取代，且无外源骨架序列的随机插入。最终获得了基因型为Δ*cbh1*::*lacA*的工程菌株。
**3. 漆酶发酵生产与蛋白分析**
将工程菌株与对照菌株（如仅携带游离*lacA*表达盒或随机插入*lacA*且保留完整*cbh1*的菌株）在含有乳糖-玉米浆复合碳氮源的培养基中进行摇瓶和7 L发酵罐的补料分批培养。全程监测菌体形态、胞外总蛋白浓度及漆酶活性。漆酶活性以2,2’-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）为底物进行测定。发酵液上清通过SDS-PAGE和免疫印迹分析蛋白组成，比较重组漆酶条带丰度与背景蛋白变化。同时，利用强阴离子交换层析对工程菌株的漆酶进行一步纯化，制备电泳纯蛋白以用于酶学性质表征，包括最适pH、最适温度、热稳定性及对典型抑制剂的耐受性测试。
研究结果
通过基因替换与发酵优化，工程菌株的表现全面超越了传统表达模式，凸显了“删除竞争、强化表达”策略的优越性。
**1. 基因替换重塑了里氏木霉的分泌蛋白谱**
分子鉴定确认，所得工程菌株T. reesei Δ*cbh1*::*lacA*的纤维素酶核心基因*cbh1*被完全敲除，取而代之的是栓菌漆酶*lacA*的单拷贝整合。摇瓶发酵结果显示，在乳糖诱导条件下，工程菌株胞外总蛋白浓度虽较出发菌株有所下调（因缺失了CBH1这个分泌主力），但漆酶活性却升高至328 U/mL，较随机插入表达对照的107 U/mL高出2倍以上。更为直观的是，SDS-PAGE图谱发生显著变化：野生株中分子量约70 kDa的CBH1浓重条带完全消失，而在约65 kDa处出现一条清晰的漆酶重组蛋白主带，杂蛋白的种类和丰度大幅降低，漆酶占总分泌蛋白的比例从不足15%一举提升至超过65%，近乎“一峰独秀”。
**2. 发酵工艺放大实现漆酶高产**
在7 L发酵罐中采用分批补料培养，并控制溶氧与pH，工程菌株Δ*cbh1*::*lacA*的漆酶产量在168小时后达到峰值，胞外漆酶活性最高可达2.85 g/L（对应体积活性约4200 U/mL）。该产量水平在组成型表达或游离质粒表达的同类研究中表现亮眼，展示了去除CBH1所带来的碳通量与分泌通道释放的巨大红利。同时，由于背景蛋白的大幅净减，仅需一步离子交换层析，即可将发酵上清中的漆酶纯化至95%以上的纯度，总收率超过70%，操作简便性远优于对照工艺。
**3. 异源漆酶维持优良酶学性质**
来源自栓菌的重组LacA漆酶经纯化后，表现出典型的真菌漆酶特征：最适反应pH为4.0，在pH 4.0–6.0范围内可保持80%以上的活力；最适温度60 °C，并具有较好的热稳定性，50 °C孵育2小时残余活力仍高于70%。Cu²⁺和适当的氧化还原介体（如ABTS、丁香醛连氮）可显著增强其活性，而NaN₃和卤素离子则表现出典型的抑制作用。这些性质与原菌株天然LacA基本一致，表明基因替换和密码子优化并未影响蛋白折叠和活性中心构象，里氏木霉的折叠与修饰系统能正确加工该异源蛋白。
讨论与展望
本研究巧妙地利用了里氏木霉自身高强度转录和高度冗余的分泌资源，将原本“竞争性”的内源基因位点转化为异源蛋白的超表达平台。直接靶向替换*cbh1*基因，其背后逻辑清晰且易于推广：CBH1的分泌效率已历经自然进化与菌株诱变的千锤百炼，其启动子、信号肽以及相关的囊泡运输和折叠辅助因子资源极其雄厚，这为异源蛋白提供了现成的“高速公路”，而中断CBH1这一主导蛋白的表达，则彻底解决了异源蛋白“后起之秀难敌先入为主”的瓶颈。
另一方面，背景蛋白的极大简化显著降低下游分离成本，这与工业生物技术追求“过程经济性”的目标高度契合。同时，该策略并未引入抗生素抗性基因等生物安全隐患，且基因组定点整合赋予菌株良好的遗传稳定性，有利于连续发酵和长期保藏。当然，该方案也存在一定局限性：*cbh1*的完全缺失可能诱导其他纤维素酶基因的代偿性上调，在利用天然纤维素类廉价底物时仍需全面评估滤纸酶活等总糖化力变化；此外，漆酶表达仍依赖于乳糖作为诱导剂，虽已规避纤维二糖的抑制，但诱导剂成本仍是工业化的考量因素之一。
展望未来，这一“替换主效基因”的理念可拓展至里氏木霉其他高丰度分泌蛋白（如CBH2、EG1等），通过多重替换构建全纤维素酶最小化底盘，从而将代谢流集中导向目标产品。结合启动子工程替换为精准响应的合成诱导系统或去阻遏的组成型启动子，甚至引入体外调节回路，有希望实现完全脱离诱导剂的高强度异源分泌生产。这样的丝状真菌超分泌底盘，将在功能酶制剂、生物制药及材料蛋白的绿色制造中扮演更加关键的角色。
参考来源
**Zhang J, Hong Y, Li K, Sun Y, Yao C.** Enhancing the production of a heterologous *Trametes* laccase (LacA) by replacement of the major cellulase CBH1 in *Trichoderma reesei*. *Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology*, 2023. DOI: [10.1093/jimb/kuad002](https://doi.org/10.1093/jimb/kuad002)
DOI: 10.1093/jimb/kuad002