来源：Semantic Scholar | 编译：DNA Lab Space
导语
植物病原真菌与水稻的分子博弈一直是作物病害防控研究的前沿战场。传统上，真菌漆酶被视为降解植物细胞壁木质素的多酚氧化酶，而本研究彻底颠覆了这一认知。研究发现，水稻稻曲病菌（*Ustilaginoidea virens*）分泌的漆酶UvLACC2能够作为新型效应蛋白直接进入水稻细胞，精准靶向先天免疫受体激酶OsSRF3。UvLACC2并非通过酶切降解，而是利用去泛素化活性消除OsSRF3蛋白积累，从而破坏OsBAK1–OsSRF3免疫复合体的形成，抑制水稻基础防卫反应。该工作首次揭示了真菌漆酶通过翻译后修饰操控寄主免疫的分子通路，为开发持久抗稻曲病品种提供了全新靶标，发表于《自然·通讯》。
研究背景
在水稻与病原微生物的互作研究中，病原相关分子模式触发的免疫（PTI）构成了植物第一道先天防线。这一过程依赖质膜定位的模式识别受体（PRRs）识别保守的微生物分子，进而招募共受体激酶如BAK1，形成激活下游防御信号的蛋白复合体。水稻中已鉴定多个PRR，其中富含丝氨酸/精氨酸的受体样激酶OsSRF3被报道能正调控对多种病原菌的抗性，其功能通常需要与OsBAK1发生配体依赖性异源聚合。然而，针对OsSRF3的病原效应蛋白及其去稳定化机制仍属空白。
稻曲病是由子囊菌*Ustilaginoidea virens*引起的水稻穗部病害，不但造成产量损失，还产生对人类和动物有害的真菌毒素。该病菌在侵染过程中分泌大量效应蛋白来抑制水稻免疫，但多数效应蛋白的作用模式尚未阐明。*U. virens*基因组编码多个漆酶家族成员，这类含铜氧化酶通常参与木质素降解和色素合成，但在病原与植物互作中的直接免疫调控功能鲜有报道。近期蛋白质组学和转录组分析提示，部分漆酶在侵染早期高表达且分泌至水稻细胞间隙，暗示其可能具备未知的毒力功能。
本研究的核心科学问题在于：*U. virens*分泌型漆酶是否可以直接进入水稻细胞内部，是否靶向免疫正调控因子OsSRF3，以及通过何种生化机制解除OsSRF3介导的抗病信号。解答这些问题将不仅重塑对真菌漆酶功能的认识，更为理解细菌和真菌效应蛋白功能性演化提供范例。
研究方法
研究团队采用多学科手段交叉验证，构建了从效应蛋白筛选到活体功能确证的完整证据链：
**1. 候选漆酶鉴定与表达分析。** 通过稻曲病菌侵染期转录组与分泌蛋白质组数据，筛选出侵染早期显著上调且N端含信号肽的漆酶UvLACC2。利用qRT-PCR和Western blot验证其侵染阶段表达动态，并构建UvLACC2-绿色荧光蛋白（GFP）融合载体，通过农杆菌侵染烟草叶片和水稻原生质体进行亚细胞定位，结合免疫印迹检测质外体液中是否存在该蛋白，证实其为分泌蛋白并可转位进入植物细胞。
**2. 蛋白互作网络解析。** 以水稻受体样激酶家族酵母文库为筛选对象，通过分裂泛素酵母双杂交确定UvLACC2直接结合OsSRF3胞内激酶域。进一步运用萤火素酶互补成像、双分子荧光互补、免疫共沉淀和GST pull-down实验在烟草瞬时表达系统和水稻原生质体中反复确证体内外互作。为定位互作关键区域，构建UvLACC2与OsSRF3的系列截短及点突变体，结合结构预测进行界面分析。
**3. 去泛素化活性测定与机制探讨。** 鉴于UvLACC2含有预测的漆酶催化结构域，首先检测纯化蛋白对底物ABTS的氧化活性。分别构建酶活性中心铜离子配位氨基酸突变的失活型（UvLACC2-mLac）和仅删除去泛素化基序的变体，以区分酶氧化活性与潜在的去泛素化功能。在烟草中共表达OsSRF3与泛素及上述各变体，利用抗泛素抗体免疫沉淀和免疫印迹分析OsSRF3的泛素化水平。此外，在体内和体外体系中加入蛋白酶体抑制剂MG132，判断降解途径。
**4. 免疫信号传导功能表征。** 通过在水稻原生质体和稳定转基因水稻植株中分别过表达OsSRF3、OsBAK1以及UvLACC2效应蛋白（野生型与各突变型），测定flg22诱导的活性氧爆发、MAP激酶磷酸化水平和防卫基因（如*PAL*、*PR10a*）表达。利用免疫共沉淀检测OsSRF3与OsBAK1的二聚化是否受UvLACC2干扰。使用免疫印迹定量OsSRF3蛋白丰度，并用环己酰亚胺阻断蛋白合成测定半衰期，以分辨转录调控与蛋白稳定性改变。
**5. 致病性验证。** 构建*U. virens* UvLACC2敲除菌株与回补菌株，接种水稻穗部，统计穗发病率、每穗病粒数以及真菌生物量。同时，在水稻OsSRF3 RNAi及过量表达背景下接种野生型菌株，以及采用Δ*UvLACC2*菌株挑战OsSRF3紊乱株系，以解析效应蛋白与宿主靶标的遗传关系。
研究结果
研究取得以下核心发现：
**漆酶UvLACC2作为新型效应蛋白进入植物细胞并靶向OsSRF3。** 亚细胞定位和免疫印迹表明，带信号肽的全长UvLACC2可定位于烟草和水稻细胞质与细胞核，质外体液中亦检测到UvLACC2，证明该蛋白既存在于胞外，又可进入胞内。酵母双杂交筛库鉴定出OsSRF3为其胞内直接互作伙伴，双荧光互补与免疫共沉淀实验证实UvLACC2特异性结合OsSRF3胞内激酶域，而不结合BAK1等其他共受体。互作界面依赖于OsSRF3的JM结构域近膜区，UvLACC2的N端α-螺旋基序是其识别关键。
**UvLACC2通过去泛素化活性而非漆酶氧化活性降低OsSRF3蛋白积累。** 令人意外的是，野生型UvLACC2抑制OsSRF3蛋白表达的效应在漆酶催化位点突变体（mLac）中依然保留，表明经典的底物氧化功能并非免疫抑制所必需。进一步序列分析发现UvLACC2含有一个与泛素特异性蛋白酶类似的去泛素化模体。在体外去泛素化实验中，UvLACC2显著降低OsSRF3的多聚泛素链修饰水平；删除去泛素化模体的UvLACC2突变体则完全丧失此活性，同时丧失降解OsSRF3的能力。这意味着UvLACC2除作为氧化酶外，还进化出了去泛素化酶功能，使靶蛋白稳定化降解信号消除，实则加速了OsSRF3经由何种途径的降解还需进一步实验证实，但本研究显示OsSRF3的降解并非依赖于26S蛋白酶体，而是可能通过液泡靶向途径。MG132处理无法完全恢复OsSRF3积累，且细胞自噬抑制剂可部分阻断UvLACC2诱导的降解。因此，UvLACC2利用一种非催化氧化方式的蛋白干扰策略——去泛素化后改变靶蛋白定位或识别，最终导致OsSRF3蛋白量下降。
**UvLACC2破坏OsSRF3–OsBAK1免疫复合体形成，阻断信号传导。** 体内免疫共沉淀显示，当UvLACC2存在时，OsSRF3与OsBAK1的配体诱导结合显著减弱。伴随复合体的解体，flg22诱导的活性氧产生减少52%，MPK3/6磷酸化水平下降逾60%，下游防卫基因*PAL*和*PR10a*的表达也受到强烈抑制。使用UvLACC2去泛素化缺陷突变体则无此效果，表明上述免疫抑制表型直接归因于UvLACC2介导的OsSRF3蛋白不稳定。
**遗传证据确认UvLACC2是稻曲病菌的关键毒力因子。** 与野生型菌株相比，Δ*UvLACC2*菌株在水稻穗部引发的穗发病率降低46%，每穗病粒数减少57%，真菌生物量下降至原来的三分之一，同时感染部位OsSRF3蛋白积累量显著回升，防卫基因表达上调。回补全长UvLACC2可完全恢复毒力，而回补去泛素化模体缺失突变体则回复失败，直接证实去泛素化活性对于菌体致病不可或缺。尤为关键的是，在OsSRF3沉默的水稻植株中，Δ*UvLACC2*菌株与野生型的致病性差异基本消失；反之，OsSRF3过表达植株对Δ*UvLACC2*菌株表现出超敏抗性，但对野生型菌株抗性提升有限，这就建立了UvLACC2与OsSRF3在病害发展中的严格遗传对应关系。
综上，该研究阐明了*U. virens*启用漆酶UvLACC2作为一种胞内效应蛋白，通过去泛素化活性直接削弱水稻受体激酶OsSRF3的积累，进而干扰OsSRF3–OsBAK1免疫复合物的组装，最终有效抑制PTI信号流，实现成功侵染。
讨论与展望
该工作具有多重理论价值与应用前景。首先，真菌漆酶长久以来被认为是作用于植物细胞壁多聚物的胞外酶，本研究证明其可以作为转位效应蛋白，在宿主胞内发挥翻译后修饰功能，这为效应蛋白的功能分类拓展了一个全新分支。利用去泛素化活性而不是经典催化氧化功能来调控靶蛋白稳定性，体现出病原蛋白“一物多功”和进化的精巧性，提示在效应蛋白中可能存在其他类似的双功能蛋白等待挖掘。
其次，OsSRF3的去泛素化降解机制揭示了植物受体激酶稳态调控的另一层面。过去普遍认为PRR蛋白含量通过磷酸化-泛素化-26S蛋白酶体途径控制，本研究表明存在不被蛋白酶体抑制剂阻断的降解轨迹，暗示泛素化状态变化可影响内吞分选和液泡降解路线。这为深入理解植物免疫受体质量控制提供了新切入点。
在应用层面，UvLACC2–OsSRF3互作界面可作为设计作物保护措施的靶标。通过定向编辑OsSRF3的JM结构域使其丧失与UvLACC2的结合能力而保留正常免疫功能，有望创制抗稻曲病且不影响发育的水稻新种质。同时，鉴定能够阻断UvLACC2去泛素化活性的小分子化合物，也有可能发展为新型绿色杀菌剂。
当然，研究也留下了若干待解问题。UvLACC2进入植物细胞的转位机制以及与寄主蛋白互作诱导去泛素化的详细结构基础尚不清楚。此外，OsSRF3降解的精确液泡运输路径以及是否存在寄主去泛素化酶参与调控也有待阐明。未来结合冷冻电镜结构解析和化学示踪将为此提供答案。总体而言，该发现不仅深化了对稻曲病菌致病机理的理解，更开辟了真菌漆酶功能研究的新维度。
参考来源
Duan Y, Wang Z, Fang Y, Pei Z, Hu H. A secreted fungal laccase targets the receptor kinase OsSRF3 to inhibit OsBAK1–OsSRF3-mediated immunity in rice. *Nature Communications*, 2024. DOI: 10.1038/s41467-024-52204-w.
DOI: 10.1038/s41467-024-52204-w