来源：A versatile CRISPR-Cas13d platform for multiplexed transcriptomic regulation and metabolic engineering in primary human T cells（Cell）| 编译：DNA Lab Space
导读
CAR-T细胞疗法在血液肿瘤治疗中取得突破，但Cas9基因编辑工具在安全性、有效性和应用范围上存在局限。本研究开发了MEGA（多重效应子引导RNA阵列）平台，利用CRISPR-Cas13d的RNA靶向切割活性，在不切割基因组DNA的前提下，实现对原代人T细胞转录组的多重、定量、可逆调控。研究团队将该平台应用于CAR-T细胞耗竭模型、组合CRISPR筛选及免疫代谢通路工程，在体外和体内均显著增强了CAR-T细胞的抗肿瘤功能。
研究背景
嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法已彻底改变了难治性B细胞和浆细胞恶性肿瘤的治疗格局，并在侵袭性肿瘤模型中展现出治愈潜力。然而，原发或获得性耐药以及对实体瘤疗效有限等障碍依然突出。近期研究将T细胞内在功能障碍机制——如耗竭和代谢失调——与治疗失败联系起来。
基于CRISPR-Cas9技术的下一代工程化T细胞被视为潜在解决方案，但Cas9核酸酶和碱基编辑器均会永久性改变T细胞基因组。虽然某些场景下完全基因敲除是理想选择，但在原代人T细胞中引入可动态调控的分级扰动，仍是基础发现和临床开发中未满足的需求。此外，基因组DNA切割可能引发p53激活、染色体易位等不良后果，限制了Cas9系统在需要可逆调控或高安全性场景中的应用。
研究方法
关键资源与试剂
研究使用的主要抗体包括：AF405标记抗人CD8（克隆3B5，Invitrogen）、APC标记抗人CD46（克隆TRA-2-10，Biolegend）、BUV395标记抗人LAG3（克隆T47-530，BD Biosciences）、BV421标记抗人TIM3（克隆F38-2E2，Biolegend）、PE-Cy7标记抗人CD25（克隆2A3，BD Biosciences）等。细菌和病毒株包括Stellar感受态细胞（Takara）。生物样本来自斯坦福血液中心的健康人白膜层（buffy coat）。
化学试剂包括：三磷酸腺苷二钠盐水合物（ATP，Sigma-Aldrich）、Alt-R S.p. Cas9核酸酶V3（IDT）、人重组IL-2（STEMCELL）、甲氧苄啶（TMP，Sigma-Aldrich）、台盼蓝染液（Invitrogen）等。关键商业试剂盒包括：腺苷检测试剂盒（荧光法，Abcam）、AMP-Glo检测试剂盒（Promega）、CellTiter-Glo 2.0细胞活力检测试剂盒（Promega）、DNeasy Blood and Tissue试剂盒（QIAGEN）、EasySep人CD8阳性选择试剂盒II（STEMCELL）、EasySep人T细胞分离试剂盒（STEMCELL）、人IFNγ ELISA MAX Deluxe（Biolegend）、人IL-2 ELISA MAX Deluxe（Biolegend）、iScript cDNA合成试剂盒（Bio-Rad）、iTaq Universal SYBR Green Supermix（Bio-Rad）、KAPA HiFi HotStart（Roche）、NEBuilder HiFi组装试剂盒（NEB）等。
质粒构建方面，pSLQ4419为pHR（U6-BsmBI-BsmBI-EFS-PuroR-WPRE）载体，pSLQ4428为pHR（EF1a-mCherry-P2A-RfxCas13d-2xNLS-3xFLAG-ecDHFR-WPRE）载体，均由本文构建并已存入Addgene（#214875和#214885）。pSLQ5428为pHR（EF1a-mCherry-P2A-RfxCas13d-2xNLS-3xFLAG-WPRE）载体。包装质粒pMD2.G和psPAX2来自Didier Trono。
实验动物模型
免疫缺陷NSG小鼠（NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ，JAX #005557）购自Jackson Laboratory，在斯坦福大学无菌条件下饲养，符合APLAC方案。小鼠饲养于屏障设施中，12小时光照/黑暗循环，由兽医人员每日监测。体内实验使用健康雄性小鼠，肿瘤植入时小鼠4月龄，未参与过先前任何实验。
细胞系培养
Lenti-X 293T雌性人胚胎肾细胞（Takara）培养于0.22 μm无菌过滤的DMEM（Gibco）中，添加10%胎牛血清（FBS）。Nalm6-GD2、Nalm6-ROR1和Nalm6-CD19雄性急性淋巴细胞白血病细胞培养于0.22 μm无菌过滤的完全培养基（CM）中（RPMI添加10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素）。所有细胞在37°C、5% CO2的湿化培养箱中培养。
原代人T细胞分离与扩增
从斯坦福血液中心购买匿名健康供者白膜层（IRB豁免方案）。使用EasySep人T细胞分离试剂盒（STEMCELL），按照制造商方案，结合Ficoll-Paque PLUS（GE Healthcare）和SepMate-50管进行原代人T细胞分离。
MEGA CAR T细胞制备流程
采用优化的顺序转导工作流程（图1B）：首先将原代人T细胞与RfxCas13d慢病毒和HA-28ζ CAR慢病毒共转导，1天后转导crRNA慢病毒。第5天分选mCherry+细胞，第10天检测受体表面表达。
引导RNA阵列设计与组装
每个基因设计3条引导RNA（使用cas13designtool在线工具），构建单引导、双引导（靶向所有两两组合）及三引导阵列（编码LAG3/PD-1/TIM3靶向间隔区的所有独特排列）。使用In-Fusion Snap Assembly Master Mix（Takara）或NEBuilder HiFi组装试剂盒（NEB）进行阵列组装。引导RNA阵列通过Twist Oligo Pools（Twist Bioscience）合成。
慢病毒生产与转导
Lenti-X 293T细胞用于慢病毒包装，使用TransIT-LT1（Mirus）转染试剂，配合pMD2.G和psPAX2包装质粒。病毒上清经Lentivirus precipitation solution（Alstem Bio）浓缩，使用ViralBoost（Alstem Bio）增强转导效率。
流式细胞术分析
使用CytoFLEX S（Beckman Coulter）流式细胞仪，数据用FlowJo v10软件分析。抗体染色按照制造商推荐浓度进行。对于胞内蛋白检测（ZAP70、Lck），使用Cyto-Fast Fix/Perm Buffer Set（Biolegend）进行固定和透化。
RNA提取与定量PCR
使用RNeasy Plus Mini试剂盒（QIAGEN）提取总RNA，iScript cDNA合成试剂盒（Bio-Rad）反转录，iTaq Universal SYBR Green Supermix（Bio-Rad）进行qPCR。
RNA测序与分析
使用kallisto进行转录本定量，sleuth进行差异表达分析。DESeq2用于筛选数据。GSEA使用fgsea包执行。
CRISPR筛选
二维CRISPR筛选使用6,400个引导阵列，在两个时间点（早期和晚期）比较富集情况。使用MAGeCK进行引导阵列排序分析。
代谢物检测
ATP浓度使用CellTiter-Glo 2.0试剂盒检测，AMP使用AMP-Glo Assay（Promega），腺苷使用Adenosine Assay Kit（荧光法，Abcam）。
T细胞功能检测
肿瘤杀伤动力学使用IncuCyte S3（Sartorius）实时监测。细胞因子分泌（IFNγ、IL-2）使用ELISA MAX Deluxe试剂盒检测。T细胞增殖通过CellTiter-Glo 2.0评估。
Cas9 RNP电穿孔
使用P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X kit S（Lonza）进行Cas9核糖核蛋白（RNP）电穿孔，在HA-28ζ CAR T细胞中实现四基因敲除（4KO：LAG3、PD-1、TIM3、CD46）或安全港对照（AAVS1）。
体内实验
NSG小鼠（每组n=4）皮下接种Nalm6-GD2肿瘤细胞，尾静脉注射MEGA HA-28ζ CAR T细胞。肿瘤负荷通过IVIS Spectrum成像系统（PerkinElmer）进行生物发光成像（BLI）监测。
研究结果
Cas13d在原代人T细胞中的表达与活性优化
RfxCas13d系统来源于黄化瘤胃球菌XPD3002，在哺乳动物细胞中表现出优异的催化活性和靶向特异性。研究团队选择靶向功能障碍HA-28ζ CAR T细胞中LAG3、PD-1和TIM3的上调来确认功能活性。每个基因设计3条引导RNA，第10天检测表面表达并与非靶向（NT）对照比较。
使用双顺反子CRISPR系统时，由于RfxCas13d慢病毒转导效率低，三个供者均仅观察到有限的敲低效果。研究发现所有单载体双顺反子构型均导致功能性病毒滴度低——这归因于慢病毒RNA在293T细胞包装过程中被RfxCas13d阵列加工（正向）或crRNA引导切割（反向）。基于此，建立了优化流程：原代人T细胞先与RfxCas13d和HA-28ζ CAR慢病毒共转导，再转导crRNA慢病毒。
优化后的MEGA HA-28ζ CAR T细胞中，单引导和双引导阵列均能将各靶向受体特异性地抑制至接近基线水平，且在多供者独立实验中结果一致。LAG3、PDCD1和HAVCR2转录本丰度与表面蛋白表达呈强相关性。双引导阵列中存在间隔区位置效应：LAG3靶向间隔区在阵列中任何位置均高效，而PD-1和TIM3靶向间隔区在3'端位置通常更有效。
全转录组RNA-seq分析显示，与NT相比，所有样本均存在显著的LAG3和/或HAVCR2靶向敲低。检测到的显著脱靶或下游生物学效应极少：靶向LAG3时为0个，靶向TIM3时为7个，同时靶向LAG3+TIM3时为4个。未观察到干扰素（IFN）通路激活。
三引导阵列（编码LAG3/PD-1/TIM3靶向间隔区的所有独特排列）均能在2-3个供者中抑制耗竭标志物上调，转录本丰度与表面蛋白表达强相关。单细胞水平分析显示，所有引导阵列均增加了三阴性（LAG3-/PD-1-/TIM3-）细胞群比例，其中LPT构型效果最佳。
【数据】靶向LAG3脱靶基因数：0；靶向TIM3脱靶基因数：7；靶向LAG3+TIM3脱靶基因数：4；供者数：2-3；检测时间：第10天
MEGA在原代人T细胞中无 collateral 活性
RfxCas13d在某些哺乳动物细胞中可能触发非特异性RNA降解（collateral活性）。为检测该系统是否存在此现象，研究选择靶向B2M——原代人T细胞中表达最丰富的转录本之一。MEGA在蛋白水平实现B2M高效敲低，但不影响CD46或CD3等脱靶蛋白表达，也未检测到mCherry报告基因的collateral敲低。
活细胞计数和总RNA产量在靶向组与NT组间无显著差异，表明无系统性非特异性RNA降解。主成分分析显示，样本变异主要来自供者间差异（PC1）而非靶向vs NT条件（PC2）。差异表达分析确认B2M敲低，鉴定出37个差异表达基因。以线粒体RNA（mtRNA）作为内部对照，未观察到B2M靶向组与NT组之间的显著差异。
【数据】B2M敲低效率：高效（原文未提供具体百分比）；差异表达基因数：37；mtRNA水平：靶向组与NT组无显著差异
MEGA组合CRISPR筛选鉴定CAR T细胞增殖的配对调控因子
Cas9筛选鉴定出的候选基因双敲除通常比单敲除更能增强T细胞功能。研究将MEGA应用于概念验证筛选，鉴定调控CAR T细胞增殖的候选耗竭相关基因组合。二维CRISPR筛选使用6,400个引导阵列，在早期和晚期时间点比较富集情况。筛选鉴定出显著富集/耗竭的基因阵列，以及具有最显著计数变异的阵列。
通过FACS分选的RfxCas13d+CD8+HA-28ζ CAR T细胞在15天培养中的扩增倍数变化显示，富集引导阵列与NT对照相比显著促进T细胞增殖。重复肿瘤杀伤实验显示，富集引导阵列组较NT对照具有更好的杀伤动力学。
【数据】筛选引导阵列总数：6,400；显著性阈值：adj. p < 0.05，|l2fc| > 0.5；扩增时间：15天；供者数：n = 3-4
可药物调控的MEGA系统
通过将RfxCas13d与大肠杆菌二氢叶酸还原酶（ecDHFR）融合，实现甲氧苄啶（TMP）依赖性调控。TMP添加后72小时内CD46敲低动力学显示快速诱导敲低；TMP去除后敲低效果逐渐逆转。TMP剂量-反应曲线显示CD46敲低程度可定量滴定。
LPT阵列表达细胞中，LAG3、PD-1、TIM3表达随TMP剂量变化，呈现剂量依赖性调控。进一步构建PROX（4-plex）引导阵列靶向LCK和ZAP70，TMP依赖性降解LCK和ZAP70转录本可调节T细胞激活强度。IL-2分泌、CD69和CD3表达均随TMP剂量变化。
【数据】TMP调控时间窗口：72小时；PROX阵列：4-plex（LCK + ZAP70，各2条引导RNA）；检测时间：第10天
大阵列MEGA的构建与功能验证
研究开发了快速引导阵列组装方法，成功构建SURF1（5-plex）和SURF2（10-plex）引导阵列，分别靶向LAG3、FAS、CD5、ENTPD1、CD46、TRAC、B2M、CTLA4、PDCD1、HAVCR2。基因组PCR扩增子的电泳图谱确认了预期扩增子长度。
第10天转录水平检测显示，SURF2阵列中所有10个靶基因均相对NT显著下调。表面蛋白表达（MFI）相对NT的检测在2个供者中一致。高维流式细胞术数据经FlowSOM聚类和t-SNE降维分析显示，表达SURF2的细胞与NT对照在表型上明显分离。
【数据】SURF1：5-plex；SURF2：10-plex；检测时间：第10天；供者数：n = 2（蛋白）或n = 3技术重复（转录）
嘌呤能信号通路的破坏
研究构建了PURI引导阵列靶向ENTPD1、NT5E、ADORA2A和ADORA2B，以破坏嘌呤能信号。第10天转录水平检测显示四个基因均相对NT显著下调。代谢物检测显示，MEGA HA-28ζ CAR T细胞培养基中ATP、AMP和ADO浓度发生变化。在20 μM ATP脉冲后，ATP和AMP浓度随时间变化，显示嘌呤代谢通路的改变。
与Nalm6-GD2肿瘤细胞共培养（1:1 E:T）24小时后，IFNγ和IL-2分泌水平与NT对照相比发生变化。肿瘤杀伤动力学和T细胞增殖动力学也显示PURI阵列的影响。
【数据】靶基因数：4（ENTPD1、NT5E、ADORA2A、ADORA2B）；ATP脉冲浓度：20 μM；共培养时间：24小时；E:T比：1:1
糖酵解途径的多重敲低
GLY阵列靶向HK1、HK2、AKT1和AKT2，第10天转录水平检测显示四个基因均相对NT显著下调。质量细胞计数数据经FlowSOM聚类和t-SNE降维分析显示，GLY表达细胞与NT对照在表型上明显分离。批量RNA-seq分析鉴定出差异表达基因，GSEA显示前5个显著基因集。
Cas9 RNP电穿孔生成四基因敲除（4KO：LAG3、PD-1、TIM3、CD46）HA-28ζ CAR T细胞，TIDE分析确认编辑效率。10天培养中，Cas13敲低和Cas9敲除的扩增倍数变化显示不同模式。48小时共培养后，Cas9 4KO组肿瘤细胞杀伤效果优于AAVS1对照。Cas13（GLY vs NT）与Cas9（4KO vs AAVS1）的差异表达基因比较显示部分重叠但非完全一致。
【数据】GLY靶基因数：4（HK1、HK2、AKT1、AKT2）；差异表达基因阈值：adj. p < 0.2，|l2fc| > 0.5；4KO编辑效率：TIDE确认；共培养时间：48小时；供者数：n = 2-4
GLY阵列增强CAR T细胞体内抗肿瘤活性
GLY阵列表达细胞培养上清pH与NT对照存在差异。与Nalm6-GD2共培养24小时后，IL-2和IFNγ分泌水平发生变化。重复肿瘤杀伤实验显示GLY阵列的杀伤动力学改善。
在Nalm6-GD2荷瘤NSG小鼠（每组n=4）中，MEGA HA-28ζ GLY组相比NT组在第3周肿瘤生物发光信号显著降低。第10天输注前MEGA HA-28ζ CAR T细胞表型分析显示效应/记忆亚群分布变化。CAR T细胞在第3周的丰度检测显示组间差异。
【数据】体内实验动物数：n = 4/组；检测时间点：第3周；肿瘤模型：Nalm6-GD2 NSG小鼠；统计方法：双因素重复测量ANOVA + 非配对t检验（终点BLI）
讨论与解读
多重基因沉默是下一代T细胞疗法开发的核心方向。与Cas9工具不同，MEGA不产生基因毒性和/或随plexity增加而出现的扰动异质性。研究展示了从单一引导阵列同时抑制原代人T细胞中近10个基因的能力，且不靶向或切割基因组DNA。MEGA未触发可检测的RfxCas13d collateral活性，这与先前研究一致——collateral活性取决于细胞类型和间隔区序列等因素。值得注意的是，所有哺乳动物Cas13 collateral活性研究均使用质粒转染，其拷贝数可超过慢病毒转导（本文方法）100至1,000倍。
RfxCas13d活性不干扰CAR信号传导，且与内源性T细胞功能兼容。MEGA平台在可扩展性、可逆性和安全性方面为合成生物学提供了独特的工具属性。
编译者解读
从合成生物学应用角度看，MEGA平台的真正价值在于"可编程性"的三个维度：定量（TMP剂量依赖）、可逆（药物去除后恢复）和多路复用（单阵列近10基因）。与Cas9永久敲除相比，RNA水平的干预保留了内源调控网络的灵活性，这对T细胞这种功能状态高度动态的细胞类型尤为重要。将代谢通路工程与CRISPR筛选结合的策略，体现了从"单基因编辑"向"系统级重编程"的范式转变。局限在于，高plexity阵列的间隔区位置效应仍需优化，且慢病毒多载体系统在临床转化中面临生产复杂性挑战。该平台为CAR-T疗法的"可调控化"提供了新思路。
参考来源
Tieu V. A versatile CRISPR-Cas13d platform for multiplexed transcriptomic regulation and metabolic engineering in primary human T cells. Cell, 2024.
DOI: 10.1016/j.cell.2024.01.035
DOI: 10.1016/j.cell.2024.01.035