来源：OmniEdit: A unified CRISPR/Cas9 platform for precise genome engineering and strain optimization of the Cordyceps militaris cell factory（Synthetic and Systems Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space
导读
蛹虫草（Cordyceps militaris）是生产虫草素等高值活性化合物的重要微生物细胞工厂，但缺乏通用高效的基因组编辑工具长期制约其代谢工程改造。本研究开发了OmniEdit——一个基于AMA1自主复制型CRISPR/Cas9系统的统一编辑平台，通过PEG介导转化，在单一标准化流程中实现了精确点突变、荧光蛋白标记、大片段基因簇删除、uORF调控元件编辑及一步法多基因敲除。该平台首次在蛹虫草中实现了CRISPR介导的精确点突变（约4–5%效率），并成功切除约26 kb的基因簇，为蛹虫草功能基因组学与菌株系统优化提供了标准化工具包。
研究背景
蛹虫草是一种著名的子囊菌真菌，既是传统药用蘑菇，也是重要的微生物细胞工厂，是虫草素和喷司他丁等具有显著药理活性的生物活性次级代谢产物的主要工业来源。随着生化工程的发展，系统优化蛹虫草菌株以提高产量、纯度和安全性的需求日益迫切。然而，缺乏多功能、高效率的遗传操作工具长期是代谢与功能基因组学研究的主要瓶颈。
近年来，基于CRISPR/Cas9的蛹虫草基因组编辑技术进展迅速。早期实现采用Cas9核酸内切酶、体外预合成RNA和单链DNA模板，成功实现了位点特异性删除和插入。随后核糖核蛋白（RNP）递送降低了基因组整合风险，但因缺乏选择标记而筛选工作量大。基于AMA1的自主复制型CRISPR/Cas9系统利用tRNAPro启动子提高了敲除效率，并可通过转化后质粒丢失实现无痕编辑。此后，有研究报道了可扩展的10 kb生物合成基因簇删除系统。尽管如此，统一的、多功能的精准编辑平台仍然缺失，这构成了本研究启动的直接动因。
研究方法
2.1 菌株与培养条件
野生型（WT）蛹虫草菌株CGMCC 3.16323在土豆葡萄糖琼脂（PDA）培养基上于20°C保存。用于质粒构建的大肠杆菌DH5α化学感受态细胞购自北京Genesand Biotech Co., Ltd.，保存于−80°C。大肠杆菌在添加氨苄青霉素（100 μg/mL）的Luria-Bertani培养基中培养筛选。
【数据】菌株：蛹虫草CGMCC 3.16323；培养基：PDA；温度：20°C；抗生素：氨苄青霉素100 μg/mL
2.2 质粒构建
所有基因组编辑构建体均以亲本CRISPR/Cas9载体pAMA1-Cas9-hyg为骨架，该载体表达密码子优化的Cas9和潮霉素B抗性标记（hph）。所有sgRNA使用Eukaryotic Pathogen CRISPR guide RNA/DNA Design Tool（http://grna.ctegd.uga.edu/）默认参数设计，靶向蛹虫草CM01参考基因组（GCF_000225605.1）中的特定核苷酸序列。使用DNA Assembly Mix Plus试剂盒（北京LABLEAD Trading Co., Ltd.）将所有DNA片段组装到载体中。
为向CmH3基因（CCM_07449）引入H3K9R（AAG-to-AGG）或H3K9Q（AAG-to-CAG）替换，设计了靠近靶位点的sgRNA。选定的sgRNA（sgRNA1，距突变位点112 bp）插入pAMA1-Cas9-hyg生成中间载体。通过PCR扩增生成含有预期点突变和约1 kb同源臂的HDR供体。值得注意的是，供体中省略了CmH3终止密码子下游紧接着的28 bp片段以利于筛选。将HDR片段克隆到中间载体中，得到最终编辑质粒。采用相同策略构建了第二个含距突变位点56 bp的近端sgRNA2的载体，用于效率比较。
对于Cmgcn5a在天然位点的C末端mCherry标记，使用靶向终止密码子下游230 bp位点的sgRNA。HDR供体设计为去除天然终止密码子，替换为编码柔性接头（GSGGGGSGGGGS）后接mCherry编码序列的读框内序列。为防止Cas9重复切割，HDR供体中删除了从sgRNA靶位点到原始终止密码子的基因组区域。对于安全港整合，将包含Cmgcn5a编码序列（无终止密码子）、相同接头、mCherry和强组成型CmgpdA启动子的融合构建体克隆到靶向预定义基因组安全港位点的HDR供体中。
对于约26 kb的ustiloxin生物合成基因簇（BGC）删除，设计了靶向末端基因CCM_02054和CCM_02066的sgRNA，并将其表达 cassette 克隆到单一载体中。扩增BGC两侧各800 bp（上游）和828 bp（下游）的同源臂，组装到同一载体中作为供体。还构建了仅含一个sgRNA（靶向CCM_02054或CCM_02066）加相同供体的对照载体。
使用NCBI ORF finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/Paste/）和uORF light（http://uorflight.whu.edu.cn）预测推定uORF。为破坏CCM_08965的5′UTR中的uORF，设计了靶向uORF1和uORF3起始密码子邻近序列的sgRNA。通过将sgRNA表达cassette克隆到pAMA1-Cas9-hyg骨架中组装相应的CRISPR/Cas9编辑载体。
为生成Cmgcn5a和Cmgcn5b双基因敲除载体，采用一步法多重敲除策略。对每个基因，先将特异性sgRNA表达cassette（CmtRNApro-sgRNA-T6）克隆到亲本载体pAMA1-Cas9-hyg中，生成中间构建体（pAMA1-Cas9-hyg-Cmgcn5a和pAMA1-Cas9-hyg-Cmgcn5b）。随后，从WT基因组DNA扩增靶基因开放阅读框两侧各约1 kb的上游（左臂）和下游（右臂）同源序列，通过一步克隆策略组装到相应的中间载体中，得到最终敲除构建体：pAMA1-Cas9-sgRNA Cmgcn5a-ko和pAMA1-Cas9-sgRNA Cmgcn5b-ko。
【数据】载体骨架：pAMA1-Cas9-hyg；sgRNA设计工具：Eukaryotic Pathogen CRISPR guide RNA/DNA Design Tool；同源臂长度：约1 kb（点突变）、800 bp/828 bp（BGC删除）、约1 kb（基因敲除）；供体省略片段：28 bp（终止密码子下游）
2.3 原生质体介导的转化与筛选
原生质体制备和聚乙二醇（PEG）介导的转化按照先前描述的程序进行。蛹虫草菌株在100 mL PPDB（土豆葡萄糖肉汤添加1%蛋白胨）中于20°C静置培养4天。原生质体制备：0.2 g湿菌丝体在1 mL含2%溶壁酶（溶于0.8 mol/L KCl，pH 6.5；广东微生物菌种保藏中心，广州）的溶液中，于32°C、90 rpm温和振荡消化3小时。所得原生质体经四层擦镜纸过滤，用0.8 mol/L KCl在室温下3000 rpm离心10分钟洗涤两次，重悬于STC缓冲液（1 M山梨醇、10 mM Tris-HCl、25 mM CaCl2，pH 7.5）中至终密度3 × 10⁸ cells/mL。
转化：将2 μg质粒加入100 μL原生质体悬液中，冰上孵育5分钟后，加入50 μL PEG缓冲液（25% PEG、10 mM Tris-HCl、25 mM CaCl2，pH 7.5），冰上孵育30分钟。随后加入0.5 mL PEG缓冲液，于28°C孵育20分钟，再用1 mL STC缓冲液稀释。室温3000 rpm离心10分钟收集细胞，重悬于200–400 μL STC缓冲液，涂布于含1 M甘露醇和500 μg/mL潮霉素的PPDA培养基上，25°C培养。4–7天后获得菌落，转移至新鲜选择平板（含500 μg/mL潮霉素的PPDA）。
基因敲除突变体的筛选使用位于同源臂外侧和缺失区域内的引物。对于点突变和大片段基因组删除，采用两步PCR筛选策略：第一次PCR确认WT位点的丢失，第二次PCR使用侧翼引物验证精确编辑。所有验证引物的具体位置见相应图示，所有引物序列见表S1。
【数据】培养体积：100 mL PPDB；温度：20°C；时间：4天；溶壁酶浓度：2%；消化温度：32°C；转速：90 rpm；消化时间：3h；STC缓冲液：1 M山梨醇/10 mM Tris-HCl/25 mM CaCl2（pH 7.5）；原生质体密度：3×10⁸ cells/mL；质粒用量：2 μg；PEG浓度：25%；潮霉素浓度：500 μg/mL；筛选时间：4–7天
2.4 转录起始位点预测与RT-PCR验证
对CCM_08965翻译起始密码子（ATG）上游1865 bp区域进行计算机启动子分析，使用Promoter 2.0（https://services.healthtech.dtu.dk/services/Promoter-2.0/）和BDGP网络预测器（https://fruitfly.org/seq_tools/promoter.html）鉴定推定转录起始位点（TSS）。为实验验证这些预测TSS的转录起始，使用位于ATG上游−79 bp（F1）、−342 bp（F2）和−609 bp（F3）的三个正向引物，搭配位于CCM_08965第二个外显子内的共同反向引物（R），进行逆转录PCR（RT-PCR）分析。
使用E.Z.N.A.® Total RNA Kit I（Omega Bio-tek Inc.，Norcross，GA，USA）从WT蛹虫草菌株菌丝体中提取总RNA。使用HiScript III RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）试剂盒（南京Vazyme Biotech Co., Ltd.）合成第一链cDNA。分别以cDNA和基因组DNA（gDNA）为模板进行PCR扩增。cDNA特异性PCR产物经胶纯化并测序，确认第一个内含子的正确剪接。
【数据】启动子分析区域：ATG上游1865 bp；RT-PCR引物位置：−79 bp、−342 bp、−609 bp（正向）；RNA提取试剂盒：E.Z.N.A.® Total RNA Kit I；cDNA合成试剂盒：HiScript III RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）
2.5 荧光显微镜
菌丝体使用Calcofluor White（CFW）真菌荧光染色试剂盒（北京Solarbio Science & Technology Co., Ltd.）和DAPI（2-4-Amidinophenyl-6-indolecarbamidine dihydrochloride）染色液（上海Beyotime Biotech Inc.）在室温下染色。CFW染色按照制造商说明进行。DAPI溶于0.01 mol/L PBS缓冲液（pH 7.0）中至终浓度20 μg/mL。染色时，取5 μL……
【数据】DAPI浓度：20 μg/mL；溶剂：0.01 mol/L PBS（pH 7.0）；染色温度：室温
研究结果
3.1 CRISPR/Cas9介导的精确点突变
为研究组蛋白H3赖氨酸9乙酰化的作用，在蛹虫草CmH3基因（CCM_07449）中引入了赖氨酸到精氨酸（K9R）点突变。该替换保留了残基的正电荷但消除了其乙酰化潜力，从而模拟组成型不可乙酰化状态。选择距靶核苷酸112 bp的sgRNA1进行基因组编辑，构建了携带AAG-to-AGG替换的HDR供体（图1A）。为便于高效筛选，供体中特意省略了CmH3终止密码子下游紧接着的28 bp序列（图1A和B）。
PEG介导转化后，转化子经过两步PCR筛选策略。缺少与省略下游区域对应的预期扩增片段的菌落被选入二次验证（图1C）。Sanger测序确认了预期的AAG-to-AGG点突变（对应赖氨酸到精氨酸（K-to-R）替换）被精确引入，无任何额外序列改变（图1D和E）。在独立实验中，编辑效率稳定，平均成功率约为5%（图1F和G）。一个转化子在靶位点表现出杂合性（图1E），可能源于混合原生质体再生。
由于Cas9介导的切割发生在PAM序列上游3′ bp处，减少DSB与预期编辑位点之间的距离在某些系统中与提高HDR效率相关。为评估切割邻近性是否影响蛹虫草的编辑效率，设计了位于突变位点56 bp处的第二个sgRNA2（近端sgRNA），并使用相同实验框架进行评估（图1F和G）。然而，与远端sgRNA相比，未观察到编辑效率的统计学显著改善（图1G）。
为进一步评估该精准编辑策略的普适性，还在相同残基处引入了赖氨酸到谷氨酰胺（K-to-Q）突变，以模拟CmH3的组成型乙酰化状态（图1H和S1）。使用相同的设计、转化和筛选流程，成功获得了K9Q突变体，效率约为4%。这些结果表明，OmniEdit能够在蛹虫草中实现精确的、位点特异性的点突变。
【数据】点突变类型：K9R（AAG→AGG）、K9Q（AAG→CAG）；sgRNA1距离：112 bp；sgRNA2距离：56 bp；K9R效率：约5%；K9Q效率：约4%；供体省略片段：28 bp
3.2 CmGCN5a的原位与安全港驱动荧光标记
为研究CmGCN5a蛋白的亚细胞定位，采用两种不同的CRISPR/Cas9介导策略生成C末端mCherry融合蛋白：天然位点的原位标记和融合构建体整合到预定义基因组安全港位点（图2）。对于原位标记，使用靶向Cmgcn5a终止密码子下游230 bp位点的sgRNA和HDR供体（图2A）。使用所示引物对（图2A和B，橙色箭头）通过诊断PCR确认了天然位点的正确整合。
荧光显微镜显示所得菌株中mCherry信号可检测但较弱（图2C），与内源Cmgcn5a启动子驱动的有限表达一致。为获得更强且组成型的荧光信号，将由强组成型CmgpdA启动子驱动的Cmgcn5a-mCherry融合cassette整合到预定义基因组安全港位点（图2D）。使用侧翼插入位点的引物通过PCR筛选确认成功整合（图2E）。
与原位标记菌株相比，安全港整合株表现出强烈的mCherry荧光，主要定位于细胞核，细胞质中也有额外信号（图2C）。这些观察确认了CmGCN5a的主要核定位，并证明了通过安全港驱动表达实现的信号强度增强。这表明OmniEdit平台能够在蛹虫草中实现灵活的荧光蛋白标记，既可通过原位标记保留天然调控环境，也可通过安全港驱动表达增强信号强度。
【数据】原位标记sgRNA位置：终止密码子下游230 bp；定位结果：主要核定位，细胞质有信号；荧光强度：原位标记弱，安全港表达强
3.3 大片段生物合成基因簇（BGC）的靶向删除
大基因组片段（特别是完整BGC）的高效删除一直是真菌功能基因组学中的重大挑战。为此，应用CRISPR/Cas9介导的OmniEdit策略在食用真菌蛹虫草中实现精确的大片段基因组删除。通过靶向完全去除约26 kb的ustiloxin BGC来评估该方法的有效性。Cas9切割被引导至末端基因CCM_02054和CCM_02066（图3A）。
PEG介导转化后，使用两步PCR策略筛选转化子以鉴定携带预期基因簇删除的菌株（图3B）。第一次PCR筛选使用跨越5′侧翼区和CCM_02054编码序列的引物。缺少相应扩增片段的转化子被选入二次验证（图3C）。第二次PCR使用侧翼整个删除接点的引物，在候选菌株中产生约1 kb的预期产物（图3D）。这些PCR产物的Sanger测序确认了完整基因簇的精确删除以及上下游同源臂的准确连接（图3E）。
在独立实验中，删除效率可重复，平均成功率约为10%。序列分析显示，尽管使用了两个sgRNA在基因座两端产生双DSB，所有验证的敲除突变体完全通过HDR产生（图3A和E）。这一观察表明，在存在外源供体的情况下，成功的大片段删除事件优先利用HDR。
为进一步检验双sgRNA是否为高效基因簇删除所必需，构建了仅含单个sgRNA（靶向CCM_02054或CCM_02066）加相同供体的额外载体并进行评估（图3F和G）。使用这些单sgRNA载体转化成功产生了完整BGC删除（图S2），效率与双sgRNA策略相当（图3H）。这些结果表明，单个Cas9诱导的DSB配合适当设计的同源臂足以驱动蛹虫草中约26 kb大基因组片段的精确删除。此外，约800 bp的同源臂足以支持该生物中大基因簇的重组介导移除。总之，OmniEdit平台能够在蛹虫草中实现高效精确的CRISPR/Cas9介导的大片段基因组删除。
【数据】BGC大小：约26 kb；靶基因：CCM_02054和CCM_02066；同源臂：800 bp（上游）/828 bp（下游）；删除效率：约10%；二次PCR产物：约1 kb
3.4 5′UTR-uORF的靶向编辑
CCM_08965和CCM_08966是蛹虫草γ-氨基丁酸（GABA）生物合成基因簇中的关键基因（图4A）。为探索可用于增强GABA产生的转录后调控机制，选择CCM_08965的5′非翻译区（5′UTR）中的uORF进行靶向编辑。
对CCM_08965翻译起始位点（ATG）上游1865 bp区域的计算机启动子分析鉴定出两个推定转录起始位点（TSS）（图4B）。使用位于ATG上游−79 bp（F1）、−342 bp（F2）和−609 bp（F3）的引物搭配位于CCM_08965第二个外显子内的共同反向引物（R）进行RT-PCR分析，结果显示引物对F1/R和F2/R有cDNA特异性扩增。cDNA来源扩增产物的胶回收和测序确认了第一个内含子的正确剪接，表明5′UTR至少延伸至翻译起始位点上游342 bp处（图S3）。该转录的5′UTR区域随后被用于……
【数据】启动子分析区域：ATG上游1865 bp；预测TSS位置：−765（Promoter 2.0）和−609（BDGP）；RT-PCR阳性引物对：F1/R和F2/R；5′UTR最小长度：342 bp
3.5 PEG介导共转化实现一步法多重基因敲除
（注：原文结果部分3.5节未在节选范围内完整呈现，但根据图6及讨论内容，该节描述了使用PEG介导的共转化策略实现Cmgcn5a和Cmgcn5b双基因的一步法敲除。）
图6展示了用于Cmgcn5a基因敲除和Cmgcn5b基因敲除的CRISPR/Cas9策略示意（图6A和B）。PCR验证显示：a-1为ΔCmgcn5a单基因敲除突变体，b-1为ΔCmgcn5b单基因敲除突变体，ab-1和ab-2为ΔCmgcn5ab双基因敲除突变体（图6C）。RT-PCR分析以rpb1为内参基因，检测了转化子中的基因转录水平（图6D）。图6E示意了PEG介导的载体共转化蛹虫草原生质体的流程，不同质粒以颜色区分。
【数据】敲除基因：Cmgcn5a、Cmgcn5b；突变体类型：单敲（a-1、b-1）和双敲（ab-1、ab-2）；内参基因：rpb1
讨论与解读
本研究建立了OmniEdit——一个统一的基于CRISPR/Cas9的蛹虫草基因组编辑框架，克服了蘑菇形成真菌功能遗传学和代谢重构中长期存在的瓶颈。通过将多种基因组编辑操作整合到单一标准化工作流程中，OmniEdit实现了从点突变、蛋白质标记、大片段删除、调控性uORF靶向破坏到多重基因敲除的灵活而精确的基因、调控元件和代谢位点操作。这种统一设计减少了对特定任务编辑流程的依赖，为蛹虫草及相关真菌物种中基因功能和次级代谢的系统解析提供了可扩展平台。
本研究首次在蘑菇形成真菌中实现了CRISPR/Cas9介导的精确点突变（K9R和K9Q），平均效率约4–5%。一个关键技术贡献是实施了简化的筛选策略——在修复模板中故意排除一个短的下游同源区域，从而快速富集正确编辑的转化子，大幅减少测序负担。值得注意的是，将Cas9诱导的DSB与预期突变之间的距离从112 bp缩短至56 bp并未显著提高编辑效率，这一观察与距离依赖性HDR效率的某些系统报道形成对比。
编译者解读：OmniEdit平台的亮点在于"统一"二字——将点突变、大片段删除、蛋白标记、uORF编辑和多重敲除整合到同一套载体系统与操作流程中，显著降低了真菌基因编辑的技术门槛。尤为实用的是其"省略同源区段"的筛选设计：通过故意在供体中缺失一段序列，使正确编辑的转化子PCR呈阴性，巧妙规避了测序筛选的繁重工作。约26 kb BGC的删除仅需单个sgRNA加约800 bp同源臂即可完成，这一发现对大型真菌基因簇的精准删除具有直接参考价值。uORF编辑为代谢通量调控提供了转录后水平的操作维度，而一步法双基因敲除展示了多基因叠加改造的可行性。局限在于点突变效率仍偏低（约4–5%），且杂合体的出现提示原生质体再生过程中的混合现象需进一步控制。总体而言，该平台为蛹虫草从"天然产物来源"向"工程化细胞工厂"的转化提供了关键工具支撑。
参考来源
Liu M. OmniEdit: A unified CRISPR/Cas9 platform for precise genome engineering and strain optimization of the Cordyceps militaris cell factory. Synthetic and Systems Biotechnology, 2026. DOI: 10.1016/j.synbio.2026.04.015
DOI: 10.1016/j.synbio.2026.04.015