来源：Field-deployable, lyophilized cell-free biosensor for robust and selective detection of inorganic arsenic in complex seaweed matrices（Food Research International）| 编译：DNA Lab Space
导读
海藻虽为优质食物资源，却易富集环境中的重金属砷。传统检测依赖实验室精密仪器与冷链运输，难以满足现场筛查需求。本研究构建了一种基于ArsR调控元件的无细胞蛋白合成（CFPS）生物传感器，通过冻干策略实现室温稳定储存，并在真实海藻基质中完成验证。冻干过程意外将背景泄漏表达降低8倍，检测限达0.5 μM，为食品安全现场监测提供了新工具。
研究背景
海藻被全球公认为营养丰富的食物资源，有望成为可持续粮食安全的重要支柱。然而，海藻能从周围环境吸收并积累重金属等有害物质，其中砷（As）是剧毒元素，长期暴露可导致癌症、神经毒性和皮肤病等严重健康风险，被认定为海藻消费的主要食品安全风险之一。海洋生态系统中砷以多种化学形态存在，无机砷（如亚砷酸盐和砷酸盐）的毒性显著高于海洋生物中常见的有机砷形态。因此，选择性检测无机砷是当前分析化学的关键挑战。目前重金属分析主要依赖电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）和原子吸收光谱（AAS）等精密实验室方法，但这些方法需要昂贵设备、专业操作人员，且无法实现现场快速检测。
研究方法
本章节完整翻译自原文Materials and Methods部分，逐段保留全部实验细节。
2.1 菌株与培养条件
本研究所用菌株见表1。大肠杆菌DH5α用于克隆操作，大肠杆菌SHuffle T7用于表达ArsR蛋白。细胞提取物制备使用大肠杆菌BL21Star（DE3）菌株。使用Lysogeny肉汤培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）和2× YT培养基（10 g/L酵母提取物、16 g/L胰蛋白胨、5 g/L NaCl）培养细胞。需要时在培养基中添加50 μg/mL卡那霉素。
【数据】菌株：E. coli DH5α（克隆）、SHuffle T7（ArsR表达）、BL21Star（DE3）（细胞提取物）；培养基：LB（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）及2× YT（10 g/L酵母提取物、16 g/L胰蛋白胨、5 g/L NaCl）；抗生素：50 μg/mL卡那霉素
2.2 质粒与遗传回路构建
本研究所用质粒和引物分别列于表1和表S1。聚合酶链式反应（PCR）使用KOD One™ PCR Master Mix（TOYOBO Life Science，日本），按制造商说明书操作。寡核苷酸由Bionics（首尔，韩国）合成。质粒DNA使用FavorPrep™质粒提取Mini Kit（FAVORGEN，屏东，台湾）提取，PCR产物用FavorPrep™凝胶/PCR纯化Mini Kit（FAVORGEN，屏东，台湾）纯化。
构建pET28a-ArsR时，以pET28a(+)（Millipore Sigma，Billerica，MA，USA）为模板，使用引物His-pET28-F和His-pET28-R（表S1）扩增质粒骨架。编码砷抗性相关转录因子的arsR基因以pXWJ109As-gfp（Addgene质粒#123143）为模板，使用引物As-007和As-008扩增。扩增片段与质粒骨架使用自制的1.33× Gibson Assembly Master Mix组装，该混合液按已发表方案制备（Behle, 2018）。所得质粒用于ArsR蛋白的表达与纯化。
获得同时含有传感模块（ArsR结合位点，ABS）和报告模块（superfolder GFP）的质粒pJL1-ABS-sfGFP时，以pJL1-sfGFP为模板，使用包含ABS序列的引物pJL_ABS_F和pJL_ABS_R（表S1）进行PCR。扩增片段用T4 DNA连接酶（New England Biolabs，Ipswich，MA，USA）连接。
【数据】PCR酶：KOD One™ PCR Master Mix；组装：1.33× Gibson Assembly Master Mix；连接酶：T4 DNA连接酶；模板：pET28a(+)、pXWJ109As-gfp（Addgene #123143）、pJL1-sfGFP
2.3 ArsR蛋白纯化
将pET28a-ArsR质粒通过CaCl₂介导的热激转化导入大肠杆菌SHuffle T7。预培养：挑取单菌落接种于5 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37°C过夜培养。随后将1%（v/v）预培养物转接至500 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37°C培养。当细胞OD600达到0.6时，加入异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度0.1 mM，诱导arsR基因表达。细胞在18°C下培养18小时后，5000 xg离心20分钟收集。
细胞沉淀用缓冲液A（50 mM Tris-HCl、300 mM NaCl、2 mM β-巯基乙醇，pH 7.5）重悬，使用Nano分散器（NLM-100，ILSHIN AUTOCLAVE Co.，韩国大田）在1000 bar压力下破碎三个循环。裂解液4°C下5000 xg离心20分钟，上清液上样Ni²⁺-NTA树脂（Bio-Rad，Hercules，California，U.S.）进行亲和层析。ArsR用缓冲液B（50 mM Tris-HCl、300 mM NaCl、250 mM咪唑、2 mM β-巯基乙醇，pH 7.5）洗脱，并用截留分子量5 kDa的Vivaspin® 6离心浓缩器（Sartorius AG，德国）浓缩。浓缩过程中将缓冲液置换为磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）。纯化ArsR的浓度用Bradford法（Bio-Rad，Hercules，California，U.S.）测定。可溶性、不可溶性和纯化蛋白通过12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析，并用考马斯亮蓝染色显色。
【数据】诱导剂：IPTG（终浓度0.1 mM）；诱导条件：18°C、18h；离心：5000 xg、20min；破碎：1000 bar、3循环；层析：Ni²⁺-NTA亲和柱；洗脱液：250 mM咪唑；浓缩：5 kDa MWCO；缓冲液A：50 mM Tris-HCl、300 mM NaCl、2 mM β-巯基乙醇、pH 7.5
2.4 细胞提取物制备
细胞提取物按已报道方法（T.-W. Kim et al., 2006）从大肠杆菌BL21Star（DE3）（Novagen，Madison，WI）制备。细胞在150 mL带挡板摇瓶中的20 mL LB培养基中37°C、250 rpm过夜预培养。培养物转移至含2 L 2× YT培养基的5 L罐式生物反应器（Kobiotech，韩国仁川）中，37°C、400 rpm搅拌培养。当OD600达到0.6时，加入IPTG至终浓度1 mM，诱导T7 RNA聚合酶表达。诱导细胞在对数中期（OD600 ≈ 4.5）收获，每克湿细胞沉淀用15 mL缓冲液A悬浮洗涤三次，随后离心。
缓冲液A含10 mM Tris-醋酸盐缓冲液（pH 8.2）、14 mM醋酸镁、60 mM谷氨酸钾、1 mM二硫苏糖醇（DTT）及0.05%（v/v）2-巯基乙醇（2-ME）。湿细胞沉淀称重后于−80°C储存过夜。融化细胞按每克湿细胞1.27 mL缓冲液B（不含2-ME的缓冲液A）悬浮，使用Nano分散器在1000 bar压力下破碎三个循环。细胞裂解液4°C下21,000 xg离心30分钟，收集上清液并在37°C孵育30分钟。所得提取物分装后于−80°C保存备用。
【数据】诱导剂：IPTG（终浓度1 mM）；收获时机：OD600 ≈ 4.5（对数中期）；洗涤：每克湿细胞15 mL缓冲液A、3次；破碎：1000 bar、3循环；离心：21,000 xg、30min、4°C；孵育：37°C、30min；缓冲液A组成：10 mM Tris-醋酸盐（pH 8.2）、14 mM醋酸镁、60 mM谷氨酸钾、1 mM DTT、0.05% 2-ME
2.5 无细胞蛋白合成（CFPS）
无细胞蛋白合成（CFPS）反应混合物按已报道方法略作修改制备（T.-W. Kim et al., 2006; Sun et al., 2013）。每个15 μL反应在384孔板（Greiner，货号#781091）中进行，各组分终浓度如下：57.6 mM HEPES-KOH（pH 7.5）、12 mM醋酸镁、90 mM谷氨酸钾、80 mM醋酸铵、1.76 mM DTT、1.4 mM ATP、1.0 mM CMP/GMP/UMP各一种、66 μg/mL亚叶酸、19种氨基酸各2.4 mM并额外添加6 mM L-半胱氨酸、60 mM磷酸肌酸、0.01 mg/mL肌酸激酶、2%（w/v）聚乙二醇、25 nM质粒pJL1-ABS-sfGFP、27%（v/v）细胞提取物。
磷酸肌酸购自Roche Diagnostics（Mannheim，德国），ATP、UMP和CMP由Beams Bio（京畿道，韩国）提供。GMP、L-半胱氨酸和L-赖氨酸购自东京化学工业（东京，日本）。HEPES、DTT和IPTG购自GoldBio（St. Louis，MO，USA）。聚乙二醇8000购自Promega（Madison，WI，USA）。亚砷酸钠由Fisher Scientific（Waltham，MA，USA）提供，单甲基砷酸（MMA；以二钠甲基胂酸六水合物形式提供）由Chem Service Inc（West Chester，PA，USA）提供，砷胆碱溴化物（AsC）由FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation（大阪，日本）提供。硫酸锰购自Daejung Chemicals & Metals（京畿道，韩国）。氯化铜、氯化锌、氯化钴、氯化亚铁、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸和L-丙氨酸购自Duksan Pure Chemical（京畿道，韩国）。其余试剂均购自Sigma-Aldrich（St. Louis，MO，USA）。
CFPS反应在30°C下进行2小时。随后使用微板读取器（Tecan Spark®，Tecan Group Ltd.，Männedorf，瑞士）测量反应混合物的荧光，激发和发射波长分别设为485 nm和535 nm。评估砷传感能力时，将稀释的砷溶液加入CFPS反应混合物中，终浓度范围为0.25至100 μM，监测荧光增加。为确定生物传感器的灵敏度，在线性响应范围内构建校准曲线。检测限（LOD）采用3σ/斜率法计算，其中σ为空白对照的标准差，斜率来自校准曲线的线性范围。
【数据】反应体积：15 μL；温度：30°C；时间：2h；质粒浓度：25 nM pJL1-ABS-sfGFP；细胞提取物：27%（v/v）；As浓度范围：0.25–100 μM；荧光检测：激发485 nm/发射535 nm；LOD计算：3σ/斜率法
2.6 生物传感器对无机砷和有机砷物种的选择性检测评估
（原文此节内容在节选中止于"Q"，后续内容未提供完整文本，以下按原文已有内容忠实呈现）
【数据】原文未详述
研究结果
3.1 基于CFPS的砷生物传感器的构建
为开发基于CFPS的砷生物传感器，研究采用了基于转录因子（TF）的遗传回路，该回路已在微生物细胞平台（Wan et al., 2019）和可检测纤维二糖的无细胞生物传感器（T. Kim et al., 2025）中建立。砷生物传感器平台由整合了ArsR调控遗传回路的大肠杆菌CFPS系统组成（Gahlaut et al., 2022; Jia, Bu, Zhao, & Wu, 2019）。具体而言，反应混合物包含粗提取物、带有ABS-sfGFP盒的报告DNA、ArsR蛋白以及ATP、氨基酸和各种盐类等代谢辅因子（图1）。
该基于转录因子的砷生物传感器的工作原理是：在无砷条件下，ArsR阻遏蛋白结合到ArsR结合位点（ABS）上，有效阻断sfGFP基因的转录（X. Chen et al., 2019）。当砷存在时，金属离子与ArsR蛋白结合，触发其从DNA上解离，从而诱导sfGFP表达并产生可测量的荧光信号（S. Y. Chen et al., 2022）。报告质粒pJL1-ABS-sfGFP与在大肠杆菌SHuffle T7中表达并纯化的ArsR蛋白一同加入CFPS系统。反应混合物补充了通过高压匀浆从BL21Star（DE3）细胞制备的粗提取物，其余所有必需组分均购自商业来源。
【数据】报告质粒：pJL1-ABS-sfGFP；ArsR来源：E. coli SHuffle T7表达；细胞提取物：BL21Star（DE3）高压匀浆制备
3.2 CFPS砷生物传感器操作参数优化
为提高无细胞生物传感器的检测灵敏度和信噪比，研究系统优化了报告DNA（含ABS和GFP基因）的浓度（图2A）。CFPS反应在15 μL终体积中滴定DNA模板，浓度从5 nM至50 nM。在无报告DNA的条件下，未观察到可检测的荧光，证实模板是信号产生的绝对必要条件。荧光强度在初始范围内随DNA浓度成比例增加，但在25 nM及以上浓度时信号达到饱和平台。这表明CFPS系统的转录和翻译机器已达到其功能容量。因此，确定25 nM为最佳报告DNA浓度，以确保后续所有实验获得最大信号输出。
CFPS生物传感器的响应动力学与sfGFP报告基因偶联转录和翻译所需时间密切相关（Thakur et al., 2022; Wang & Lu, 2022）。为确定最佳检测时间窗，研究监测了砷生物传感器随时间变化的荧光信号。与预期一致，在无报告DNA条件下，无论孵育时间长短，均未检测到显著荧光。然而，在存在报告DNA的条件下，荧光强度逐渐增加，约1.5小时后达到饱和平台。该动力学特征表明，转录和翻译机器至少需要90分钟才能产生足量的报告蛋白用于稳定检测。因此，后续所有实验均标准化采用2小时反应时间，以确保信号完全成熟和分析性能一致（图2B）。
传统微生物细胞生物传感器的关键瓶颈在于其固有权衡——对目标分析物毒性的固有脆弱性（Moraskie et al., 2021）。高浓度无机砷通常会在活生物体中诱发严重的代谢应激或细胞死亡，导致生物传感性能显著下降（Wan et al., 2019）。如图2C所示，基于CFPS的系统克服了这些生物学限制，即使在广泛的亚砷酸盐（As³⁺）浓度范围内也未表现出可检测的毒性或信号衰减。由于无细胞环境独立于细胞活力和生长相关需求运行，蛋白质合成机器在那些对全细胞平台而言致命的条件下仍保持稳健和功能。这种韧性有利于稳定的信号产生，并显著拓宽了传感器的动态范围。此外，ArsR在ABS位点调节的稳健性能通过基线背景与砷诱导荧光之间的鲜明对比得到证实。这些观察结果强调了这种基于无细胞TF的平台作为监测复杂实际样品中高浓度砷污染的可靠高灵敏工具的潜力。
【数据】DNA模板浓度范围：5–50 nM；最佳DNA浓度：25 nM；饱和时间：约1.5h；标准化反应时间：2h；As³⁺耐受范围：原文未详述具体上限数值
3.3 性能表征：灵敏度、动态范围和检测限
为表征无细胞生物传感器对阻遏蛋白的响应，进行了ArsR的剂量-反应分析。如图3A所示，GFP表达被增加的ArsR浓度强烈抑制，证实其作为转录调节因子在无砷分析物时维持严格"关闭状态"的有效性。后续实验表明，砷的添加有效缓解了ArsR介导的阻遏，从而诱导报告基因表达，验证了CFPS砷生物传感器的配体诱导能力（图3B）。在所有测试的ArsR浓度（25–150 ng/μL）下，不断升高的砷水平逐步增强荧光，反映了靶基因的渐进性去阻遏。
特别值得注意的是，生物传感器的性能高度依赖于ArsR水平。较低的ArsR浓度导致对砷的灵敏度较高，但在无砷时基线信号增加且动态范围收窄。相反，较高的ArsR值可最小化背景噪声，但限制了最大荧光输出，压缩了动态范围。这些观察结果凸显了基于TF的生物传感器设计中的基本权衡：平衡灵敏度和信号强度以实现最佳系统性能。在评估这些竞争因素后，确定100 ng/μL的ArsR浓度为该生物传感平台的最佳值。这一特定浓度提供了最有效的平衡，维持足够低的基线以确保宽动态范围，同时保持对砷诱导的高分析灵敏度。
为定量评估生物传感器的灵敏度和动态范围，将剂量-响应曲线拟合到基于Hill方程的生化模型（Kurganov, Lobanov, Borisov, & Reshetilov, 2001）。在该模型中，Hill常数（Kₘ）代表激活传感器至半数最大响应所需的砷浓度，k代表报告基因表达的最大水平。因此，Kₘ与生物传感器的灵敏度呈负相关，k与其信号强度正相关。如图3C（蓝线）所示，Kₘ随ArsR浓度增加而增加。这些结果表明，较高的阻遏蛋白水平降低了系统对砷的表观亲和力，从而将检测阈值移至更高浓度并降低灵敏度。相比之下，最大报告基因输出（k）相对于ArsR浓度呈现非单调趋势（图3C，红线）。最高荧光输出在ArsR浓度为100 ng/μL时实现，而较低和较高浓度均导致k值降低。基于这些结果，选择100 ng/μL ArsR作为最佳浓度，因为其在该平台中提供了信号强度和检测灵敏度之间的优越权衡。
最后，通过在无细胞系统中滴定As(III)（浓度范围0.25至100 μM），评估了砷生物传感器的分析检测限（LOD）。
【数据】ArsR测试范围：25–150 ng/μL；最佳ArsR浓度：100 ng/μL；As(III)滴定范围：0.25–100 μM；LOD：0.5 μM（据讨论部分）
3.4 分析特异性与交叉反应性
（原文此节内容在节选中未完整呈现，以下按原文已有内容忠实呈现）
【数据】原文未详述
3.5 无机砷的形态分析与选择性鉴别
（原文此节内容在节选中未完整呈现，以下按原文已有内容忠实呈现）
【数据】原文未详述
3.6 复杂海藻基质中砷检测的分析验证
（原文此节内容在节选中未完整呈现，以下按原文已有内容忠实呈现）
【数据】原文未详述
3.7 冻干无细胞蛋白合成系统的现场砷检测
（原文此节内容在节选中未完整呈现，以下按原文已有内容忠实呈现）
【数据】原文未详述
讨论与解读
本研究成功开发了一种针对海藻中砷快速准确检测的新型无细胞生物传感器平台，有效消除了对冷链储存的传统依赖。本工作的主要成就在于成功实现了CFPS传感机器的冻干化。该策略不仅解决了无细胞系统固有的生化脆弱性——延长了其在环境温度下的功能保存期限——还显著抑制了基因表达泄漏，将背景噪声降低8倍以上。这种基础活性的显著降低是提高平台信噪比（SNR）和整体分析清晰度的关键驱动因素。
从性能角度看，该生物传感器表现出0.5 μM的检测限，并对高毒性无机砷表现出严格的选择性，有效防止了海洋生物中常见有机砷物种引起的假阳性信号。在真实海藻提取物（羊栖菜Sargassum fusiforme和紫菜Porphyra sp.）中优异的回收率验证表明，全细胞系统和常规液体CFPS传感器的实际限制已被有效克服。虽然在过高的非靶标金属浓度下仍需进一步优化交叉反应性，但该冻干无细胞检测系统为分散式食品安全监测和环境筛查建立了稳健且创新的范式。
编译者解读
从合成生物学应用视角看，本研究的核心亮点在于"冻干抑制泄漏表达"这一意外发现——将储存稳定性与信号本底优化两个问题一并解决，体现了无细胞系统在实际部署中的独特优势。ArsR调控回路的设计沿用了经典的转录因子阻遏机制，但通过无细胞平台规避了全细胞传感器的毒性耐受瓶颈，拓宽了动态范围。0.5 μM的检测限虽不及实验室ICP-MS的灵敏度，但足以覆盖海藻中无机砷的监管限量需求。值得关注的是，冻干策略为其他基于无细胞系统的生物传感器提供了通用化改造思路，尤其适用于资源有限地区的现场筛查场景。未来若能在多金属交叉反应性和复杂基质抗干扰方面进一步优化，该平台有望成为食品安全监控的标准化工具。
参考来源
Jeong, D.-S. (2026). Field-deployable, lyophilized cell-free biosensor for robust and selective detection of inorganic arsenic in complex seaweed matrices. Food Research International, 2026.
DOI: 10.1016/j.foodres.2026.119766
DOI: 10.1016/j.foodres.2026.119766