来源：Sorting endosomes play key roles in presentation of Mycobacterium tuberculosis-derived ligands to MAIT cells.（Sci Rep）| 编译：DNA Lab Space
导读
结核分枝杆菌（Mtb）作为胞内病原体，其抗原呈递机制一直是免疫学研究的重点。MR1是一种保守的非经典抗原呈递分子，负责将微生物核黄素合成来源的配体呈递给黏膜相关恒定T（MAIT）细胞。本研究发现，分选内体通过Syntaxin 12（Stx12）和Syntaxin 16（Stx16）介导MR1在Mtb感染期间的抗原呈递。siRNA敲低Stx12或Stx16可显著降低MR1对Mtb抗原的呈递，而Stx6无此作用。Stx16与MR1囊泡的共定位程度显著高于Stx12，且二者阻断均增加MR1表面稳定性和总表达量。
研究背景
结核病由胞内病原体结核分枝杆菌引起，是全球感染性疾病发病和死亡的首要原因。控制Mtb依赖细胞免疫，包括CD4+和CD8+ T细胞。对胞内环境中Mtb的采样对于控制感染和预防活动性结核至关重要。MR1是一种保守的非经典抗原呈递分子，将微生物来源的代谢物呈递给MAIT细胞。MAIT细胞以表达恒定TRAV1-2 T细胞受体为特征，约占人类CD8+ T细胞的10%和血液总T细胞的5%，富集于口腔黏膜、消化道、皮肤、气道和肺等黏膜部位，具有即时效应功能。MAIT细胞在Mtb感染期间肺内富集，并释放IFN-γ等重要促炎细胞因子，在控制Mtb感染中发挥关键作用。
MR1维持细胞内分布，配体结合后才转运至细胞表面，提示存在严格调控MR1转位的机制。无外源配体时，MR1恒定存在于内质网（ER）中。小分子配体（如6-FP）结合后，诱导MR1细胞表面转位。然而，调控MR1呈递Mtb等胞内病原体来源配体的具体机制尚不清楚。分选内体利用Syntaxin 6、Stx12、Stx16和VAMP4等转运蛋白介导细胞内运输。既往研究已证明VAMP4对Mtb感染期间MR1呈递的重要性，本研究进一步探讨Stx12和Stx16在此过程中的作用。
研究方法
人类受试者
本研究按照《赫尔辛基宣言》所述原则进行。研究参与者、方案和知情同意书均经俄勒冈健康与科学大学（OHSU）机构审查委员会（IRB00000186）批准。遵循所有与人类研究参与者相关的伦理规定。所有捐献者均获得书面知情同意。使用人类受试者的外周血单个核细胞（PBMC）和人血清进行T细胞克隆扩增及ELISpot培养基配制，具体方法见方法部分。
细菌与细胞
结核分枝杆菌H37Rv（ATCC）在添加Middlebrook ADC、0.05% Tween-80和0.5%甘油的Middlebrook 7H9肉汤中培养。感染前，细菌通过27号结核菌素注射器传代10-20次。所有Mtb实验均使用感染复数（MOI）为8。所有Mtb实验均在生物安全三级实验室进行。废弃物用3% Wescodyne消毒并高压灭菌。所有其他实验在生物安全二级实验室进行。
BEAS-2B（ATCC）、在最小CMV启动子下组成性过表达MR1-GFP的BEAS-2B，以及转导有四环素诱导型GFP标记MR1A慢病毒构建体（TET-MR1GFP LV）的BEAS-2B，均在添加2% L-谷氨酰胺（Gibco）和10%热灭活胎牛血清（FBS，Gemini）的DMEM（Gibco）中培养。
使用以下人类T细胞克隆：TRAV1-2+ MR1限制性（D426-G11）、HLA-B45限制性（D466-A10，最小表位CFP10₂₋₉）和HLA-B45限制性（D466-D6，最小表位CFP10₂₋₁₂）。
试剂与抗体
植物血凝素（PHA，Sigma-Aldrich）以10 mg/mL浓度重悬于含L-谷氨酰胺和庆大霉素的RPMI（Gibco）10%人血清中。多聚甲醛（Electron Microscopy Sciences）以16%原液获得，用磷酸盐缓冲液（Corning）稀释至4%工作液。FBS（GeminiBio）在56°C热灭活45分钟。人血清从捐献者获得并在56°C热灭活45分钟。Golgin-97小鼠单克隆抗体（CDF4，ThermoFisher）以1.0 µg/µL浓度重悬，按1:100使用。Syntaxin 16兔单克隆抗体（ERP9156，Abcam）按1:100使用。Silencer Select siRNAs（ThermoFisher）以50 µM浓度重悬：Silencer Select Negative Control #1（目录号#4390843）、Syntaxin 6（S19958）、Syntaxin 12（S24307）和Syntaxin 16（S16528）。蛋白质印迹使用一抗：Anti-Syntaxin 16单克隆兔抗体EPR9156（Abcam，ab134945）和Actin Loading Control小鼠单克隆抗体BA3R（Invitrogen，MA5-15739）。使用抗小鼠（Li-Cor IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG）和抗兔（Li-Cor IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG）二抗。
酶联免疫斑点（ELISpot）检测
ELISpot MSHA 96孔板（Millipore）用抗IFN-γ抗体（Mabtech；#1-D1K）在4°C包被过夜。PBS洗涤后，用RPMI（Gibco）+ 10%人血清+ 2% L-谷氨酰胺（Gibco）+ 0.1%庆大霉素（Gibco）在室温封闭至少1小时。经脂质转染的BEAS-2B接种于6孔板（Corning）。24小时后，收获细胞、计数、重新铺板，在37°C贴壁至少4小时。随后根据冻存滴度板以MOI 8感染细胞。感染后的抗原呈递细胞在过夜孵育后用含人血清的RPMI收获，以2×10⁵细胞/mL重悬；随后进行系列稀释，产生1:2、1:4和1:8稀释度。细胞稀释液以100 µL/孔双孔加入MSHA板。PHA作为所有ELISpot检测的阳性对照（1 µg/孔）。1小时后，以1×10⁴细胞/孔（50 µL/孔）加入T细胞，终体积为150 µL/孔。在37°C、5% CO₂过夜孵育后，板用PBS + Tween洗涤，与碱性磷酸酶偶联二抗（Mabtech；#7-B6-1-ALP）室温孵育2小时，PBS + Tween洗涤，PBS洗涤，然后与BCIP/NBT底物（Mabtech）室温孵育10分钟。底物用去离子水洗去，干燥后在AID ELISpot读数器上测量IFN-γ斑点形成单位（SFU）。技术重复的平均值用于汇总不同实验的数据。
【数据】细菌：Mtb H37Rv；培养基：Middlebrook 7H9 + ADC + 0.05% Tween-80 + 0.5%甘油；MOI：8；传代：27号针头10-20次；细胞培养基：DMEM + 2% L-谷氨酰胺 + 10%热灭活FBS；FBS灭活：56°C、45min；人血清灭活：56°C、45min；抗体稀释：golgin-97 1:100、Stx16 1:100；siRNA浓度：50µM；ELISpot包被：4°C过夜；封闭：室温≥1h；T细胞：1×10⁴细胞/孔；孵育：37°C、5% CO₂、过夜；BCIP/NBT底物：室温10min
流式细胞术
在最小CMV启动子下组成性过表达MR1-GFP的BEAS-2B接种于6孔板（Corning）并进行脂质转染。次日，细胞用100 µM 6-FP（Schirks Laboratories）或等体积0.01 M NaOH（Sigma）处理。次日，收获细胞，在流式缓冲液（PBS + 2%山羊血清、2%人血清、0.5% FBS）中洗涤，然后用APC偶联小鼠IgG2a、κ同型对照抗体（克隆MOPC-173；BioLegend，#400220）、APC偶联抗MR1抗体（克隆26.5；BioLegend，#361108）或APC偶联抗人HLA-A,B,C抗体（克隆W6/32；BioLegend，#311410）在4°C染色至少30分钟。细胞随后用PBS洗涤，在1%多聚甲醛（Electron Microscopy Sciences）中室温固定至少20分钟。样本在OHSU流式细胞术核心的BD LSR II细胞仪上采集，数据使用FlowJo v10.8.1软件（BD Life Sciences）分析。细胞基于前向散射（FSC）面积和侧向散射（SSC）面积设门，随后基于（1）FSC宽度对FSC高度和（2）SSC宽度对SSC高度进行两个单细胞门控。
【数据】6-FP浓度：100µM；NaOH浓度：0.01M；染色：4°C、≥30min；固定：1% PFA、室温、≥20min；仪器：BD LSR II；分析软件：FlowJo v10.8.1
显微镜检查
Missense对照和敲低BEAS-2B：TET-MR1GFP LV细胞在不含多西环素处理的8孔Nunc #1.5玻片上铺板。细胞在4% PFA中固定30分钟。随后，用含0.2%皂苷的流式缓冲液透化30分钟。用golgin-97和Syntaxin 16抗体按1:100染色45分钟。使用山羊抗小鼠Alexa 568（Invitrogen）和山羊抗兔Alexa 647（Invitrogen）二抗，按1:1000孵育45分钟。最后，细胞用DAPI染色，加入Fluoromount G封片剂（SouthernBiotech）。细胞在DeltaVision宽场反卷积显微镜上用60×物镜和Nikon Coolsnap ES2 HQ成像。每张图像以1024 × 1024格式采集Z-stacks。两个独立实验中，Missense对照组共采集11张图像、18个细胞，Stx16敲低组采集14张图像、30个细胞。图像在Imaris（Bitplane）上使用"Surface"功能处理，生成Stx16和golgin-97的表面。绘制每个细胞特定通道的荧光强度总和。
活细胞成像中，BEAS-2B：TET-MR1GFP LV细胞用Amaxa Nucleofector（Kit T，程序G-016）以每1.0×10⁶细胞1.5 µg质粒瞬时转染。转染后，细胞铺板于4孔1.5 mm玻璃底腔室玻片（Nunc）。加入多西环素1.0 µL/mL（2.0 mg/mL储存液）。次日，细胞在DeltaVision宽场反卷积显微镜上用60×物镜和Nikon Coolsnap ES2 HQ成像。成像前30分钟加入Hoechst。每张图像以1024 × 1024格式采集Z-stacks。图像在Imaris（Bitplane）上处理，使用"Spots"功能分析共定位，距离阈值设为0.5 μm。Stx12-RFP在两个独立实验中采集36张图像，Stx16-RFP在三个独立实验中采集26张图像。
【数据】固定：4% PFA、30min；透化：0.2%皂苷、30min；一抗：1:100、45min；二抗：1:1000、45min；成像：DeltaVision宽场、60×物镜、1024×1024；转染：1.5µg质粒/1.0×10⁶细胞；多西环素：1.0µL/mL（2.0mg/mL储存液）；Hoechst：成像前30min；共定位阈值：0.5μm；图像数量：Stx12-RFP 36张（2次实验）、Stx16-RFP 26张（3次实验）
候选基因表达敲低
BEAS-2B以70%融合度接种于6孔组织培养板（Corning），用50 nM Silencer Select siRNA使用HiPerFect（Qiagen）或Lipofectamine RNAimax转染试剂（Invitrogen）进行转染。细胞在37°C孵育48小时。对于功能检测，敲低细胞感染Mtb，次日用于IFN-γ ELISpot检测。
【数据】siRNA浓度：50nM；转染试剂：HiPerFect或Lipofectamine RNAimax；孵育：37°C、48h
研究结果
Stx12和Stx16阻断特异性损害Mtb感染期间MR1呈递
既往研究对Stx16在Mtb感染期间MR1抗原呈递中的作用进行了有限分析。为进一步表征Stx16的作用并确定其他VAMP4转运伙伴是否也对MR1呈递Mtb抗原至关重要，我们在气道上皮（BEAS-2B）细胞中对Stx6、Stx12和Stx16进行了siRNA抑制。Mtb感染后，检测这些细胞激活MAIT细胞克隆的能力。Stx6敲低在48小时内将Stx6转录本降低80%（图1A）。功能上，与Missense对照相比，Stx6敲低对MR1向MAIT细胞克隆呈递Mtb抗原无显著影响（图1B，p = 0.7413）。Stx12敲低在48小时内将Stx12转录本降低80%（图1C）。与Missense对照相比，Stx12敲低显著降低MR1向MAIT细胞克隆呈递Mtb抗原，最大反应从平均664 ± 56降至455 ± 115 IFN-γ斑点形成单位（SFU），下降31%（图1D，p = 0.0333）。为确定Stx12敲低对MR1抗原呈递的特异性，我们还使用对Mtb CFP10来源表位特异的HLA-B45限制性T细胞克隆检测了Stx12敲低对HLA-B45抗原呈递的影响。发现Stx12敲低对HLA-B45向HLA-B45限制性T细胞克隆呈递Mtb无显著影响（图1E，p = 0.3375），表明Stx12敲低不改变抗原摄取、胞内感染性或引起细胞毒性。Stx16敲低在48小时内将Stx16转录本降低74%（图1F）。与Stx12敲低类似，Stx16敲低显著降低MR1向MAIT细胞克隆呈递Mtb抗原，最大反应从平均716 ± 37降至393 ± 58 SFU，下降45%（图1G，p < 0.0001），但对HLA-B45向HLA-B45限制性T细胞克隆呈递Mtb无显著影响（图1H，p = 0.2345）。综合来看，这些数据表明Stx12和Stx16（而非Stx6）在MR1向MAIT细胞呈递Mtb中发挥作用。
【数据】Stx6敲低效率：转录本降低80%（48h）；Stx6敲低对MR1呈递影响：p = 0.7413；Stx12敲低效率：转录本降低80%（48h）；Stx12敲低后MAIT细胞最大反应：664 ± 56 → 455 ± 115 SFU（下降31%，p = 0.0333）；Stx12敲低对HLA-B45呈递影响：p = 0.3375；Stx16敲低效率：转录本降低74%（48h）；Stx16敲低后MAIT细胞最大反应：716 ± 37 → 393 ± 58 SFU（下降45%，p < 0.0001）；Stx16敲低对HLA-B45呈递影响：p = 0.2345；ELISpot数据：n = 3次独立实验
Stx16定位于TGN
Stx16是一种尾部锚定膜蛋白，主要定位于TGN。为确认Stx16在气道上皮细胞中的定位，我们在BEAS-2B中进行了免疫荧光染色，同时用抗golgin-97抗体染色TGN膜。发现Stx16染色与golgin-97重叠（图2A）。接下来观察Stx16敲低如何影响TGN的分布，在siRNA抑制Stx16后48小时对BEAS-2B进行Stx16和golgin-97免疫荧光染色。Stx16敲低导致Stx16染色显著减少（图2B，2C）。此外，Stx16敲低导致高尔基体弥散，但golgin-97的整体强度不变（图2B，2D）。这种高尔基体弥散与既往研究一致——Stx16和其他TGN SNAREs（如VAMP4）是维持TGN带状结构所必需的。虽然已知Stx12定位于分选内体及与分选内体相关的管状囊泡网络，但本研究未能找到合适的Stx12抗体来确认BEAS-2B中的这种定位模式。
【数据】Stx16敲低后Stx16染色总荧光强度：显著降低（p = 0.0018）；Stx16敲低后golgin-97染色总荧光强度：无显著变化（p = 0.2441）；图像数量：Missense对照11张/18个细胞、Stx16敲低14张/30个细胞；独立实验：n = 2
Stx12和Stx16与MR1囊泡共定位
接下来，我们试图表征MR1与Stx12和Stx16之间的相互作用。为此，我们构建了红色荧光蛋白标记的Stx12和Stx16构建体（Stx12-RFP和Stx16-RFP）。首先将Stx16-RFP瞬时转染到稳定转导有多西环素诱导型MR1-GFP构建体的BEAS-2B（BEAS-2B：TET-MR1GFP LV）中，用Stx16抗体通过蛋白质印迹评估Stx16蛋白表达。蛋白质印迹分析显示，与非靶向对照转染细胞相比，天然Stx16和Stx16-RFP均有染色（图3A）。为测量MR1与Stx12和Stx16之间的关联，将BEAS-2B：TET-MR1GFP LV细胞瞬时转染RFP标记构建体，用多西环素处理以诱导MR1-GFP合成，次日通过活细胞荧光显微镜成像。我们发现51%（最小20%，最大74%）的MR1囊泡与Stx16共定位，而31%（最小10%，最大53%）与Stx12共定位（图3B）。Stx16与MR1之间的共定位程度显著高于Stx12与MR1之间的共定位（图3B，p < 0.0001）。这些发现表明，虽然Stx12和Stx16都位于MR1囊泡附近，提示它们在MR1运输中发挥作用，但Stx16与MR1表现出更高的共定位程度。
【数据】MR1囊泡与Stx16共定位：51%（范围20%-74%）；MR1囊泡与Stx12共定位：31%（范围10%-53%）；Stx16与Stx12共定位差异：p < 0.0001；图像数量：Stx12-RFP 36张（2次实验）、Stx16-RFP 26张（3次实验）
Stx12和Stx16阻断增加MR1表面稳定性和总表达量
为进一步确定Stx12和Stx16如何影响MR1抗原呈递，我们通过流式细胞术表征了在最小CMV启动子下组成性过表达MR1-GFP的BEAS-2B（MR1-GFP BEAS-2B）中Stx12和Stx16敲低的效果。用100 µM 6-FP（一种已知的MR1配体）或0.01 M NaOH溶剂对照处理细胞。与Missense对照相比，Stx12敲低在NaOH溶剂对照处理下增加MR1表面表达（p = 0.0051），在6-FP处理下也增加MR1表面表达（p = 0.0002）（图4A）。Stx12敲低在NaOH处理下增加HLA-A,B,C表面表达（p = 0.0207），在6-FP处理下也增加（p = 0.0006）（图4B）。Stx12敲低在NaOH处理下增加总MR1表达（GFP gMFI，p = 0.0261），在6-FP处理下也增加（p = 0.0091）（图4C）。Stx16敲低在NaOH处理下增加MR1表面表达（p = 0.0020），在6-FP处理下也增加（p = 0.0008）（图4D）。Stx16敲低在NaOH处理下增加HLA-A,B,C表面表达（p = 0.0273），但在6-FP处理下无显著变化（p = 0.5967）（图4E）。Stx16敲低在NaOH处理下增加总MR1表达（p = 0.0068），在6-FP处理下也增加（p = 0.0014）（图4F）。RT-qPCR分析显示Stx12敲低不影响Stx16或Mr1基因表达，Stx16敲低也不影响Stx12或Mr1基因表达（图4G-I）。
【数据】6-FP浓度：100µM；NaOH浓度：0.01M；Stx12敲低+NaOH：MR1表面p = 0.0051、HLA-A,B,C表面p = 0.0207、总MR1 p = 0.0261；Stx12敲低+6-FP：MR1表面p = 0.0002、HLA-A,B,C表面p = 0.0006、总MR1 p = 0.0091；Stx16敲低+NaOH：MR1表面p = 0.0020、HLA-A,B,C表面p = 0.0273、总MR1 p = 0.0068；Stx16敲低+6-FP：MR1表面p = 0.0008、HLA-A,B,C表面p = 0.5967、总MR1 p = 0.0014；流式数据：n = 4次独立实验；统计方法：双尾配对t检验
讨论与解读
MR1是一种根本性新颖的抗原呈递分子，其呈递的是微生物代谢物。基础条件下细胞表面MR1极少，MR1仅在捕获抗原后才转运至细胞表面，因此MR1的运输可能是一个严格调控的过程。阐明这些机制对于更完整地理解MR1运输和抗原呈递的调控方式，以及免疫系统如何采样微量胞内配体至关重要。可溶性外源MR1配体（如6-FP）加载于ER驻留MR1上，诱导MR1细胞表面转位。然而，也存在调控MR1呈递Mtb等胞内病原体的独特途径。理解HLA-I和HLA-II抗原呈递的机制已被证明对改进疫苗和诊断方法的设计有价值。本研究为增强对MR1呈递Mtb抗原需求的理解奠定了基础，可能导向旨在增强Mtb感染期间MAIT细胞产生的治疗策略——这是结核疫苗设计尚未探索的途径。
既往研究已证明Mtb感染的上皮细胞能够刺激MAIT细胞产生IFN-γ。利用核黄素代谢途径的Mtb缺失突变体，可以进一步解析MR1配体产生的代谢途径。
编译者解读：本研究从合成生物学视角看，巧妙运用siRNA敲低和荧光标记共定位两大工具，系统解析了MR1抗原呈递的囊泡运输网络。Stx16与MR1高达51%的共定位率是核心定量证据，而Stx12/16敲低后MR1表面表达增加的现象提示了一条"内化-降解"调控轴。该工作为设计增强MAIT细胞应答的疫苗策略提供了新的分子靶点，但Stx12抗体的缺失和体外细胞系模型仍是局限——体内巨噬细胞中该通路的验证将是后续转化的关键。
参考来源
Tammen AE, Peterson JC, Worley A, Lewinsohn DM, Karamooz E. Sorting endosomes play key roles in presentation of Mycobacterium tuberculosis-derived ligands to MAIT cells. Sci Rep. PMID: 42215548. DOI: 10.1038/s41598-026-50843-1.
PMID: 42215548