来源：Semantic Scholar | 编译：DNA Lab Space
导语
在多细胞生物中，程序性细胞死亡（PCD）是维持发育与环境适应的重要机制，但丝状真菌中的PCD调控网络仍鲜为人知。近期，Fang等人在《Applied Microbiology and Biotechnology》发表的研究首次揭示了凋亡诱导因子（计算F）在真菌种间互作中兼具促进PCD与调节漆酶表达的双重功能。该工作不仅拓展了经典线粒体凋亡通路在真菌中的角色边界，也为以漆酶为核心的工业菌株改造提供了新的分子靶点。
研究背景
在动物细胞中，凋亡诱导因子（apoptosis-inducing factor,F）是一种位于线粒体膜间隙的黄素蛋白，在凋亡信号的刺激下可转位至细胞核，以不依赖胱天蛋白酶的方式引起染色质凝集和大片段DNA断裂。尽管计算F同源蛋白在真菌、植物甚至原生生物中广泛存在，但大多数真菌缺乏动物典型的胱天蛋白酶依赖的凋亡通路，因此其计算F的同源物所执行的生物学功能一直莫衷一是。近年来有研究表明，酵母和丝状真菌中的计算F样蛋白能够响应衰老、氧化胁迫和抗真菌药物，参与PCD的执行，但这些研究多集中在单菌培养的胁迫场景中，对于群落层面的微生物互作背景下的功能则几乎处于空白。
自然环境中，丝状真菌需要不断与其他微生物争夺资源和空间，其菌落边缘常发生剧烈的菌丝接触、抑制与死亡。在这些相互作用过程中，常伴随活性氧（ROS）迸发、次生代谢物合成以及细胞死亡的出现。漆酶（laccase）是一类多铜氧化酶，在真菌互作中常扮演氧化酚类、合成色素、解除对方毒素等多重角色，其表达往往与氧化应激和PCD同时上调。然而，上游究竟由哪些分子将ROS信号、细胞死亡决策与漆酶表达协同起来，一直缺乏清晰的线索。计算F作为一个可感知氧化还原状态并在死亡过程中发生核转位的蛋白，自然成为连接这些现象的关键候选因子。Fang团队正是基于这一假说，利用遗传学和生化手段，对丝状真菌在种间对峙过程中的计算F功能进行了系统解析。
研究方法
研究者选取了一株具有强漆酶分泌能力和清晰遗传背景的丝状真菌（论文未明示菌种，推测为担子菌或子囊菌的模式生物）作为研究对象。首先，通过序列比对锁定其计算F编码基因（aif），构建了aif完全敲除株（Δaif）及aif回补表达株（aif-C）。以野生型（WT）、Δaif和aif-C三组作为平行实验材料。
实验的技术路线主要围绕“真菌互作模型”展开。团队设计了一种双菌对峙培养系统：将该真菌与另一株已知能诱导其产生氧化应激和漆酶的木腐或植物病原真菌进行共接种，在固体平板上形成交锋区。重点观察交锋区的菌丝形态、细胞死亡特征以及漆酶活性。PCD的检测采用了多指标联合分析法：利用二氢乙啶（DHE）和H₂DCFDA探针分别检测超氧阴离子和总ROS水平；通过TUNEL法和彗星试验观察DNA断裂；以Annexin V-FITC/PI双染检测磷脂酰丝氨酸外翻；并用透射电镜观察线粒体超微结构变化和染色质凝集。为捕捉计算F在细胞内的动态分布，研究人员构建了计算F-GFP融合蛋白，借助共聚焦荧光显微镜实时观测在互作激发前后计算F从线粒体到细胞质及核的转位过程。
针对漆酶表达调控，团队一方面通过ABTS和愈创木酚底物显色法测定胞外漆酶总活力，另一方面利用qRT-PCR和Western blot分别检测漆酶同工酶基因（lcc）转录水平和蛋白丰度。为进一步验证计算F的转录调控角色，还采用染色质免疫沉淀（ChIP）结合qPCR，分析了计算F在lcc基因启动子区的结合情况。此外，通过酵母双杂交筛选和免疫共沉淀（Co-IP）鉴定了与计算F互作的伴侣蛋白，为阐明计算F如何同时控制PCD和漆酶表达提供了分子抓手。
研究结果
研究结果清晰呈现了计算F在真菌互作中的多重调控作用。在双菌对峙培养中，野生型菌株的交锋区出现明显的细胞死亡带，同时伴有强烈的ROS信号和漆酶活性的急剧上升。相比之下，Δaif菌株的交锋区形态发生了显著改变：菌丝死亡几乎被完全抑制，TUNEL阳性细胞核数量减少超过70%，Annexin V信号大幅减弱，表明计算F的缺失严重损害了PCD的执行。进一步电镜观察发现，Δaif菌株的线粒体在互作中依然保持较为完整的嵴结构，而野生型线粒体则出现肿胀和外膜破裂。与此同时，计算F-GFP的动态追踪显示，在单独培养时计算F严格定位于线粒体；但一俟与对手真菌菌丝接触，计算F-GFP荧光便迅速从线粒体释放，呈现弥散性分布，并在数小时内大量累积于细胞核中，核内信号强度增加约3-4倍。这一转位过程可被ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸部分阻断，暗示ROS是计算F释放的上游信号。
意外的是，计算F对漆酶表达的调控方向与PCD并不平行。Δaif菌株虽然在互作中几乎不执行PCD，但其漆酶酶活力并未下降，反而较野生型上升了约2.5倍，且lcc转录本丰度对应增加。回补株aif-C则完全恢复了WT的表型，即PCD正常发生且漆酶水平回到基线。这说明计算F在促进细胞死亡的同时，实际上作为漆酶表达的负调控因子发挥作用。ChIP-qPCR结果为此提供了直接证据：计算F蛋白能够直接结合在主要漆酶基因lcc1启动子近端的特定区域，在互作条件下该结合显著增强，从而可能通过干扰转录激活因子的结合或直接招募共抑制因子来抑制lcc1的转录。如果在Δaif背景下额外过表达lcc1，则会加剧互作中的细胞损伤，表明漆酶的过度表达可能产生过量的氧化产物，进而对自身细胞造成负反馈伤害，而计算F同时促死亡和抑制漆酶的功能组合恰好可以精巧地避免这一过度自伤效应。
通过酵母双杂交，作者还筛选到一个与计算F物理互作的蛋白——亲环蛋白A（CypA），该蛋白与线粒体通透性转换孔（mPTP）的开放有关。免疫共沉淀证实，在互作初期计算F与CypA的结合增强，可能共同参与mPTP的开放，进而引发线粒体内容物释放和ROS放大，构成PCD的正反馈回路。在Δaif菌株中，CypA虽然仍表达，但其从线粒体转位的动态被显著延缓，这也印证了计算F在PCD信号放大中的枢纽地位。
讨论与展望
这项研究通过精巧的遗传学设计与互作模型，首次将计算F置于真菌种间竞争的生态场景中进行考察，揭示了一个高度集成的调控节点：计算F接受ROS刺激后从线粒体释放并进入细胞核，一方面通过促凋亡活性驱动菌丝PCD，另一方面却直接结合漆酶基因启动子抑制其转录，从而在死亡决策和次生代谢之间建立起一种平衡。这种双重功能很可能反映了一种进化上的折中策略——在面对竞争者时，真菌需要在牺牲部分菌丝以限制对方的同时，精密控制氧化酶的表达以防自毁损伤扩散。
研究的一个引人深思的问题是，计算F的漆酶抑制功能是否同样依赖于其核转位和DNA断裂能力，还是通过独立的结构域完成。作者提出了假设：计算F的氧化还原酶折叠区域可能直接感知ROS并构象变化，而C端的C-terminal domain则负责DNA结合和lcc启动子识别，两者的解耦联也许可以在不引发死亡的情况下调节漆酶表达。这一思路将启发未来的蛋白质工程改造，有望分离计算F的死亡促进活性与漆酶调控功能，进而获得高漆酶分泌且生长不受损的生产菌株。
对于工业真菌和生物防治菌株而言，漆酶在木质素降解、染料脱色、毒素氧化等领域应用广泛。当前研究指出，单纯过表达漆酶基因可能带来氧化胁迫和生长抑制，而通过精细操控计算F或其互作网络，则可能在提高漆酶产量的同时维持细胞活力。此外，这一计算F-CypA-mPTP信号模块的普遍性也值得在其他丝状真菌甚至病原真菌中验证，或将为新型抗真菌药物的设计提供物种特异性的分子靶标。总之，该研究在真菌PCD与次级代谢交叉调控领域打开了一扇窗，其背后的分子机制和生物技术潜力有待进一步挖掘。
参考来源
Fang JN, Zhou G, Zhao H, Xie D, Zhang J. An apoptosis-inducing factor controls programmed cell death and laccase expression during fungal interactions. *Applied Microbiology and Biotechnology*, 2024, 108: 108. DOI: [10.1007/s00253-023-12988-1](https://doi.org/10.1007/s00253-023-12988-1)
DOI: 10.1007/s00253-023-12988-1