来源：Adaptive laboratory evolution of maltose utilization in wild Irish isolates of Saccharomyces eubayanus.（FEMS Yeast Res）| 编译：DNA Lab Space
导读
2022年，爱尔兰首次在欧洲发现酿酒酵母野生菌株（Saccharomyces eubayanus），这些菌株与杂合拉格酵母的亲本属于同一支系。本研究新增分离10株爱尔兰菌株，并聚焦麦芽糖代谢机制。尽管这些菌株携带完整的MAL基因座，却无法利用麦芽糖生长。通过适应性实验室进化，研究者获得了能够代谢麦芽糖的进化菌株，并锁定MalR转录因子中的两个关键氨基酸替换（I243N和W307L），利用CRISPR-Cas9编辑验证了W307L突变足以完全恢复麦芽糖利用表型。
研究背景
啤酒酿造依赖酵母将麦芽中的糖发酵为酒精。2024年全球啤酒产量估计达1880亿升。酿酒酵母（S. cerevisiae）与拉格酵母（S. pastorianus）是两大核心菌种，后者为异源多倍体杂交酵母，仅存在于酿造环境中。长期以来，S. cerevisiae被确认为杂交亲本之一，而另一亲本直到2011年才在阿根廷被鉴定为S. eubayanus。此后，该物种相继在北美、西藏、新西兰等地被发现。爱尔兰是目前欧洲唯一发现S. eubayanus的地区。麦芽糖是麦汁中的主要糖类，S. pastorianus能高效利用麦芽糖和麦芽三糖，而爱尔兰分离株尽管拥有完整的MAL基因簇，却表现出麦芽糖利用缺陷，其分子机制尚不清楚。
研究方法
土壤分离
土壤样本采集方法同前所述（Bergin et al. 2022）。为鉴定单菌落物种，使用引物ITS1和ITS4（补充表6）对rDNA位点的ITS区域进行PCR扩增。PCR扩增产物通过Eurofins Genomics Mix2Seq平台进行测序。
【数据】引物：ITS1/ITS4；测序平台：Eurofins Genomics Mix2Seq
短读长与长读长测序
所有菌株均采用Illumina短读长技术测序。UCD926、JS-1和JS-B的基因组还使用Oxford Nanopore Technologies（ONT）测序。Illumina测序的基因组DNA按前述方法（Bergin et al. 2022）通过苯酚-氯仿-异戊醇法提取。菌株UCD842的DNA由Novogene（英国）有限公司在NovaSeq 6000平台上使用Illumina 300-cycle v1.5试剂盒、S4流动池制备并测序，双端读长150 bp。菌株UCD926、UCD1102、UCD1004和UCD2002的DNA使用Nextera DNA Flex Library Prep试剂盒（货号20018704）和Illumina DNA/RNA UD Index Set A（货号20027213）制备Illumina文库，并在都柏林大学学院内部使用NextSeq2000测序。进化菌株JS-B和JS-1的文库使用Illumina DNA prep试剂盒（货号20060060/tagmentation）和Illumina DNA/RNA UD Indexes Set A（货号20091646）制备，使用Illumina NextSeq 2000仪器及NextSeq 1000/2000 P1 Reagents（货号20050264）内部测序。菌株UCD2256、UCD2377、UCD2381、UCD2390和UCD5150的文库使用TruSeq试剂盒制备，由Novogene（英国）有限公司使用NovaSeq X Plus系列机器测序。UCD926 DNA还使用TruSeq Nano试剂盒由Macrogen, Inc.在NovaSeq X机器上测序。所有短读长测序均产生2 × 150 bp双端读长。
Nanopore测序方面，使用MasterPure Yeast DNA Purification Kit（MPY80010；Biosearch Technologies）按制造商说明制备高分子量DNA。UCD926的测序文库从1 µg纯化高分子量DNA使用Native Barcoding Sequencing Kit（SQK-NBD114-24；ONT）制备。文库在MinION MK1C（ONT）设备上使用r10.4.1化学流动池（FLO-MIN114）测序，运行MinKnow v. 22.10.7，使用fast配置默认设置进行碱基识别。JS-1和JS-B的文库制备方式相同，但在MK1B（ONT）设备上使用MiniKNOW v 24.02.8中的super-accurate碱基识别配置测序。
本研究产生的所有测序数据可在登录号PRJNA1454724下获取。
【数据】读长：2 × 150 bp（双端）；ONT文库DNA量：1 µg；流动池：FLO-MIN114（r10.4.1化学）；设备：MinION MK1C/MK1B；碱基识别：fast/super-accurate配置；数据登录号：PRJNA1454724
基因组组装
UCD926 ONT MinION读长使用NanoFilt（De Coster et al. 2018）过滤，去除质量低于7且长度小于5 kb的读长。进化菌株JS-B和JS-1使用质量<7且长度<1 kb的截断值。三个菌株的过滤读长均使用Canu v2.2（Koren et al. 2017）以参数'genomesize = 13000000'组装。组装结果经人工筛选去除小重叠群。为减少错误率较高的MinION读长引入的误差，使用短读长数据通过五轮NextPolish（Hu et al. 2020）对组装进行抛光。UCD926组装经人工编辑，纠正了染色体XVI和VII上MALS和MALT拷贝中的四个移码错误，并通过GraphMap v0.5.2（Sović et al. 2016）比对长读长验证。组装注释使用YGAP（Proux-Wéra et al. 2012）完成。BUSCO v6.1.0使用saccharomycetes_odb12谱系数据集（补充表3）评估组装完整性（Tegenfeldt et al. 2025），QUAST v5.0.2生成组装汇总统计（Gurevich et al. 2013）。
【数据】组装软件：Canu v2.2；基因组大小参数：13000000；抛光轮数：5轮NextPolish；BUSCO数据集：saccharomycetes_odb12；过滤参数（UCD926）：质量≥7、长度≥5 kb；过滤参数（JS-B/JS-1）：质量≥7、长度≥1 kb
变异分析与系统发育树构建
短读长FASTQ文件使用Skewer v0.2.2（Jiang et al. 2014）以参数'-m pe -l 35 -q 30 -Q 30'进行质量修剪和接头去除。为鉴定S. pastorianus中属于S. eubayanus亚基因组的读长，将修剪后的读长使用Burrows–Wheeler比对工具比对到包含S. eubayanus UCD646基因组（GCA_946408725.1）和S. cerevisiae S288C基因组（GCA_000146045.2）的串联FASTA文件。比对到S288C基因组的读长以及与UCD646一致性<90%的读长均被去除。GATK（v4.2.0.0）用于标记重复读长并索引后续BAM文件（McKenna et al. 2010）。使用GATK HaplotypeCaller工具以'-ERC GVCF'模式进行变异检测，结合GATK CombineGVCFs合并，并用GATK GenotypeGVCFs进行基因分型。变异使用GATK VariantFiltration过滤，去除基因型质量<70、读深<15的调用，以及20 bp范围内五个及以上SNP的簇。
系统发育分析方面，使用GATK SelectVariants保留双等位SNP。使用自定义脚本（http://github.com/CMOTsean/HetSiteRando）为所有96个菌株生成SNP比对，包含基因组中至少一个菌株存在SNP调用的所有位点的等位基因调用。杂合位点按位点随机分配为参考或替代等位基因，确保在该位点杂合的所有菌株分配相同等位基因，并去除不变位点。使用RAxML版本8.2.12以SNP比对为输入构建系统发育树（Stamatakis 2014）。RAxML使用ASC_GTRGAMMA核苷酸替代模型，参数'–asc-corr lewis'，1000次bootstrap重复，随机种子'-# 54321 -p 54321'。
为鉴定进化菌株中的新突变，考虑所有经过质量过滤的变异，包括SNP和插入缺失。对进化菌株中调用但相应亲本谱系中未调用的所有变异进行人工检查和过滤。在进化菌株或亲本菌株中具有'no-call'的变异被丢弃。
【数据】修剪参数：-m pe -l 35 -q 30 -Q 30；比对一致性阈值：<90%去除；变异过滤：基因型质量<70、读深<15、20 bp内≥5 SNP簇去除；系统发育模型：ASC_GTRGAMMA；bootstrap：1000次
UCD650和UCD926对麦芽糖利用的适应性进化
S. eubayanus分离株UCD926和UCD650从冻存物划线到YPD琼脂上，室温培养4天。每个菌株的单菌落接种到10 ml合成完全（SC）培养基肉汤中（0.17% Formedium酵母氮源基础（不含氨基酸和硫酸铵）、0.079% Formedium Complete Supplement Mixture、0.5%硫酸铵、2% D-麦芽糖一水合物和0.1% D-葡萄糖），在25°C、200 rpm振荡培养3天。
每3–4天测量培养物在600 nm处的吸光度（OD600），并将1 ml培养物传代到9 ml新鲜SC 2%麦芽糖/0.1%葡萄糖培养基中。当吸光度值达到平台期后——UCD650经过9次传代、UCD926经过11次传代——将1 ml培养物传代到不含葡萄糖的SC 2%麦芽糖肉汤中。培养物每3–4天在SC 2%麦芽糖中继续传代，直到UCD650达到第52次传代、UCD926达到第67次传代，此时将培养物稀释并涂布到YPD琼脂上。从每个亲本谱系中随机选择一个菌落（UCD926对应JS-1，UCD650对应JS-B）进行进一步分析和测序。
【数据】初始培养：10 ml SC培养基（含2%麦芽糖+0.1%葡萄糖）、25°C、200 rpm、3天；传代体积：1 ml→9 ml；平台期传代次数：UCD650为9次，UCD926为11次；总传代次数：UCD650为52次，UCD926为67次；培养条件：25°C、200 rpm
葡萄糖和麦芽糖上的生长速率
菌落接种到5 ml YPD肉汤中，室温、200 rpm培养48小时。每个培养物取3份1 ml体积，14 000 rpm离心1分钟，沉淀用PBS（磷酸盐缓冲液）洗涤三次，然后重悬于SC 2%麦芽糖或SC 2%葡萄糖中。培养物稀释至OD600为0.1，取200 μl加入96孔板。使用SYNERGY/H1酶标仪（BioTek），版本30.04.17，室温（约20°C至约24°C）双轨道连续振荡，每10分钟读取吸光度，持续72小时。使用R包GrowthCurver计算精确的曲线下面积（AUC）值进行比较（Sprouffske and Wagner 2016）。
【数据】预培养：5 ml YPD、室温、200 rpm、48小时；洗涤：PBS三次；起始OD600：0.1；孔板体积：200 μl/孔；读数间隔：10分钟；读数时长：72小时；温度：约20–24°C；分析工具：GrowthCurver（AUC）
高效液相色谱
S. eubayanus菌株（原文此段未完整呈现，具体HPLC方法细节原文未详述）。
【数据】原文未详述
研究结果
更多爱尔兰S. eubayanus菌株的分离与基因组测序
在前期研究中，S. eubayanus菌株UCD646和UCD650分离自都柏林大学学院校园土壤（Bergin et al. 2022）。后续分析（主要由本科生完成，Ryan et al. 2025）从爱尔兰七个地点的橡树附近土壤中鉴定出十个新菌株（图1A）。
全基因组测序（短读长）用于表征这些菌株与更大S. eubayanus数据集之间的遗传关系（补充表1）。使用单核苷酸多态性（SNP）比对的系统基因组学分析显示，12个爱尔兰分离株在更广泛的Holarctic支系内聚集为一个特定亚群，该支系也包含S. pastorianus（图1B）。爱尔兰菌株彼此非常相似，平均成对SNP差异为3020个位点（补充表2），并且发现新的分离株均不能在麦芽糖琼脂上生长。相比之下，任何爱尔兰菌株与巴塔哥尼亚型菌株CBS 12357T之间的平均SNP数为64 055。
【数据】爱尔兰菌株数量：12个；平均成对SNP差异：3020个位点；爱尔兰菌株与CBS 12357T平均SNP数：64 055
如前所述（Bergin et al. 2022），UCD650基因组在染色体XVI上的MAL基因座中携带完整的MAL基因补体，并在染色体II上有额外的MALS和MALT拷贝。原始UCD650组装中的移码错误（提示MALSII（即染色体II上的MALS基因）被提前截短）已被纠正。包括UCD650、CBS 12357T和其他Saccharomyces物种的MalS、MalT和MalR蛋白序列的系统发育分析表明，这三个MAL基因具有不同的进化历史（图2）。
对于MALS和MALT，UCD650染色体XVI上的基因编码的蛋白与CBS 12357T相同染色体的蛋白密切相关（图2）。相比之下，UCD650 MalRXVI与CBS 12357T染色体V上的MalR拷贝的亲缘关系比与染色体XVI上的拷贝更近（图2）。即使由同一基因座编码的蛋白也有不同的进化历史；在UCD650中，MalSII与MalSXVI高度相似，但MalTII与MalTXVI的亲缘关系较远（图2）。同样，在CBS 12357T中，染色体V的MalS和MalT蛋白与染色体XVI的几乎相同，而来自这些染色体的MalR蛋白在进化上更为疏远（图2）。这些数据凸显了MAL基因的动态特性，其中重复、缺失和基因转换是常见的。
有趣的是，CBS 12357T的MalS、MalR和MalT1蛋白与姐妹物种Saccharomyces uvarum的Mal蛋白的亲缘关系比与UCD650的更近（图2）。这表明在Holarctic支系分化后，巴塔哥尼亚S. eubayanus菌株与S. uvarum之间可能存在基因渗入或基因共享。另一种可能的解释是，S. eubayanus和S. uvarum最近共同祖先中可能存在多个旁系同源MAL基因簇，其中一些保留在CBS 12357和S. uvarum中，另一些保留在爱尔兰菌株中。
【数据】系统发育方法：Clustal Omega比对、Gblocks鉴定信息位点、PhyML构建、1000次bootstrap重复
我们还使用Oxford Nanopore技术结合短读长测序数据对S. eubayanus UCD926的基因组进行了测序，以创建准确的染色体长度基因组组装并表征其MAL基因组织（补充表3）。UCD926基因组与先前描述的爱尔兰分离株UCD646和UCD650的基因组大体共线（Bergin et al. 2022）。与UCD650一样，染色体XVI上有一个完整的（三基因）MAL基因座，染色体II上有MALS和MALT拷贝（图3），以及染色体V和XIII上的MALR假基因化拷贝。然而，此外，UCD926中来自染色体XVI左端的30 kb区域被重复，并替换了染色体VII右端的8 kb区域（图3）。这种重排导致UCD926染色体VII右端获得整个MALXVI基因座（全部三个基因）和六个邻近基因的拷贝，同时丢失一个YPS6假基因（图3）。该重排可能由两个染色体之间跨越SAM3和SAM4基因的2.3 kb高（98.8%）序列一致性区域介导（图3）。此外，与其他S. eubayanus基因组相比，UCD926还携带染色体XI和XIII之间的相互易位，断点发生在常见的Ty4元件处（补充图1）。该重排不改变基因拷贝数，也不造成任何开放阅读框的中断。
【数据】UCD926重复区域：30 kb（染色体XVI左端→替换染色体VII右端8 kb）；介导区域：2.3 kb、序列一致性98.8%（SAM3-SAM4）；额外重排：染色体XI-XIII相互易位（断点：Ty4元件）
UCD650和UCD926麦芽糖利用能力的进化
麦芽糖和麦芽三糖是啤酒麦汁中的主要糖类（Otter and Taylor 1967, He et al. 2014）。S. pastorianus能代谢两者，S. eubayanus型菌株CBS 12357T和许多野生分离株能利用麦芽糖（Mardones et al. 2020）。如前所述，S. eubayanus UCD650尽管拥有完整的MAL基因补体，但在以麦芽糖为唯一碳源的培养基中生长不良（Bergin et al. 2022）。S. eubayanus UCD926尽管拥有额外的MAL基因座拷贝，在麦芽糖培养基中也生长不良。
采用适应性实验室进化来研究爱尔兰S. eubayanus群体麦芽糖代谢缺陷，并产生具有酿造潜力的菌株（图4A）。简言之，UCD650和UCD926的培养物在含有麦芽糖作为唯一碳源的培养基中连续传代，直到获得代谢麦芽糖的能力。
【数据】原始菌株：UCD650（完整MAL补体）、UCD926（额外MAL拷贝）；两菌株均麦芽糖生长不良
进化菌株获得了MALR序列和MAL基因座拷贝数的变化。UCD650衍生谱系在MalR中获得I243N替换，以及30 kb MAL基因座重复。UCD926亲本具有类似的MAL基因座重复，其进化谱系在MalR中获得W307L替换。进化分离株中MALT和MALS的表达增加。
【数据】UCD650进化谱系突变：MalR I243N + 30 kb MAL重复；UCD926进化谱系突变：MalR W307L；进化菌株中MALT/MALS表达：增加
CRISPR-Cas9编辑验证突变功能
将W307L突变引入UCD926背景中，完全重现了麦芽糖利用表型。I243N变体单独对麦芽糖基因表达影响很小。麦芽糖利用同时受MAL基因拷贝数和MalR功能获得性突变的影响。
通过CRISPR-Cas9编辑将W307L突变引入UCD926，完全重现了进化后的表型。I243N变体单独对麦芽糖基因表达影响甚微。麦芽糖利用受MAL基因拷贝数和MalR功能获得性突变共同影响。
【数据】W307L编辑菌株：完全重现麦芽糖利用表型；I243N编辑菌株：对麦芽糖基因表达影响很小
讨论与解读
迄今为止，爱尔兰仍是欧洲唯一发现S. eubayanus的地方。前期研究表征了两个爱尔兰分离株UCD646和UCD650，显示它们与Holarctic支系其他成员及杂交拉格酵母S. pastorianus基因组中的S. eubayanus组分密切相关。本研究新增报道了来自爱尔兰其他地点的十个菌株。系统发育上，全部12个爱尔兰菌株在S. eubayanus的Holarctic支系内形成一个亚支。爱尔兰分离株彼此非常相似，这与深分支巴塔哥尼亚支系中的S. eubayanus分离株形成鲜明对比。这表明爱尔兰群体源于该物种更近期的岛屿扩张事件，与"出巴塔哥尼亚"迁移假说一致。
原始分离株UCD650和新鉴定分离株UCD926均含有完整的麦芽糖酶（MALS）和麦芽糖转运蛋白（MALT）基因拷贝，没有移码或无义突变。这表明它们在麦芽糖上生长不良的表型源于这些基因的表达失调，尽管这些菌株中的麦芽糖调控基因（MALR）也是完整的。有趣的是，菌株UCD646（与UCD650同时、几乎同地点采集）没有任何完整的MALR基因；其染色体XVI MAL基因座中的拷贝获得了移码突变。
编译者解读
本研究以爱尔兰野生S. eubayanus为材料，巧妙地将"自然变异+实验室进化+CRISPR验证"串联起来：先利用全基因组测序锁定爱尔兰群体的系统发育位置和MAL基因座结构差异，再通过适应性进化实验在短短52–67次传代内获得麦芽糖利用能力，最终用基因编辑精确验证了单个氨基酸替换足以驱动表型转变。这种从群体基因组学到功能验证的研究路径值得借鉴。局限在于，I243N突变的单独效应微弱，提示麦芽糖利用是多基因协同的结果，未来可进一步探究拷贝数变异与调控突变之间的上位互作。该研究也为拉格酵母育种提供了具有酿造潜力的野生菌株资源。
参考来源
Bergin S, Scully J, Hession C, da Silveira J, Osborne M. Adaptive laboratory evolution of maltose utilization in wild Irish isolates of Saccharomyces eubayanus. FEMS Yeast Res. PMID: 42570227.
PMID: 42570227