来源：Enhanced heparosan biosynthesis in Corynebacterium glutamicum by systematic metabolic engineering and translation-level fine-tuning.（Bioresour Bioprocess）| 编译：DNA Lab Space
导读
肝素作为广泛应用抗凝血药物，其工业制备长期依赖动物组织提取，面临原料供应波动与安全隐患。肝素前体（heparosan）与肝素具有相似多糖骨架，可在温和酶催化下转化为肝素。本研究以安全性公认的谷氨酸棒状杆菌为底盘，通过基因组规模改造与核糖体结合位点（RBS）随机文库翻译水平微调双重策略，将肝素前体产量从226.37 mg/L提升至1161.37 mg/L，并在5 L生物反应器补料分批发酵中达到5.36 g/L。
研究背景
肝素是糖胺聚糖家族重要成员，具有抗凝血、抗病毒和抗肿瘤等多种生理功能，在医学、临床治疗及生物基材料领域应用广泛。然而，工业肝素仍主要从动物组织中提取，虽技术成熟，但受牲畜供应制约，且存在安全与质量风险。肝素药品一旦出现安全隐患，消费者和生产企业都将遭受严重且深远的负面影响。
肝素前体与肝素具有类似的多糖骨架，可通过级联酶促反应转化为生物工程肝素，为可持续肝素生产提供了有前景的绿色替代方案。近期研究还发现，肝素前体除作为肝素合成底物外，还具有维持细胞内环境稳定、参与细胞增殖与分化调控等多种生理活性。因此，高效、环保的肝素前体生物合成具有重要价值。
研究方法
菌株与试剂
本研究所用菌株列于补充表1。大肠杆菌DH5α用于质粒构建与保存，谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032及其衍生菌株用于肝素前体生物合成。质粒提取试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒购自生工生物（上海）。Phanta Flash Master Mix（Vazyme，南京）用于关键片段PCR扩增，Rapid Taq Master Mix（Vazyme，南京）用于菌落PCR。无缝克隆试剂盒购自碧云天生物技术（上海）。除非另有说明，本研究使用的所有试剂均购自生工生物（上海）。
【数据】菌株：E. coli DH5α、C. glutamicum ATCC 13032；试剂来源：生工生物（上海）、Vazyme（南京）、碧云天（上海）
重组质粒构建
pXMJ19质粒携带IPTG诱导型启动子，用作关键基因的表达骨架。本研究所用质粒见补充表2，相关引物见补充表3。质粒构建的所有遗传操作均按照标准方案进行。
肝素前体生物合成基因kfiA、kfiC及复合物稳定蛋白编码基因kfiB来源于大肠杆菌K5。UDP-GlcA和UDP-GlcNAc生物合成途径基因glmM、ugD、glmU、glmS、galU及相应同源臂序列均从谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032基因组克隆。在敲除和过表达质粒构建过程中，靶基因galE、pyrG、pta、ackA、pyrH、ndk及其同源臂序列均从谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032基因组扩增。
【数据】表达骨架：pXMJ19（IPTG诱导）；基因来源：kfiA/kfiB/kfiC来自E. coli K5，glmM/ugD/glmU/glmS/galU/galE/pyrG/pta/ackA/pyrH/ndk来自C. glutamicum ATCC 13032
培养基与培养条件
LB培养基（5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨、10 g/L NaCl，需要时加20 g/L琼脂）用于大肠杆菌常规培养和平板筛选。LBB培养基（5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨、18.5 g/L脑心浸液、5 g/L NaCl，需要时加20 g/L琼脂）用于谷氨酸棒状杆菌常规培养和平板筛选。感受态培养基（5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨、18.5 g/L脑心浸液、5 g/L NaCl、30 g/L L-甘氨酸、4 g/L异烟肼、1 mL/L吐温80）用于制备感受态细胞，LBHIS培养基（5 g/L酵母提取物、5 g/L胰蛋白胨、2.5 g/L NaCl、18.5 g/L脑心浸液、91 g/L山梨醇）用于电转化后谷氨酸棒状杆菌的恢复培养。
所有大肠杆菌菌株在37°C、220 rpm振荡培养12–16小时，或静置过夜。需要时添加卡那霉素（50 mg/L）和氯霉素（34 mg/L）。所有重组谷氨酸棒状杆菌菌株在30°C、220 rpm振荡培养14–18小时，或静置培养48小时。需要时添加卡那霉素（25 mg/L）和氯霉素（17 mg/L）。
摇瓶发酵时，所有重组菌株先在种子培养基（20 g/L玉米浆干粉、1 g/L KH₂PO₄、0.5 g/L (NH₄)₂SO₄、1.25 g/L尿素、25 g/L葡萄糖，用KOH调pH至7.0）中于30°C、220 rpm预培养18–22小时。种子培养液随后接种至发酵培养基（15 g/L玉米浆干粉、1 g/L KH₂PO₄、40 g/L (NH₄)₂SO₄、0.18 g/L Fe₂(SO₄)₃、100 g/L葡萄糖、1 g/L MgSO₄，用KOH调pH至7.0），初始OD₆₀₀为1.6，随后在30°C、220 rpm培养72小时。种子和发酵培养基中添加氯霉素（17 mg/L）以维持质粒稳定性，发酵启动后2小时加入0.5 mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）。
补料分批发酵时，种子培养约20小时，以5%接种量转接至发酵培养基。补料分批发酵培养基含：15 g/L玉米浆干粉、1 g/L KH₂PO₄、40 g/L (NH₄)₂SO₄、0.18 g/L Fe₂(SO₄)₃、50 g/L葡萄糖、1 g/L MgSO₄，用KOH调pH至7.0。发酵过程中，用2 M KOH控制pH为7.0，500 g/L葡萄糖溶液作为补料碳源，需要时添加10%消泡剂。
【数据】LB培养基：5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨、10 g/L NaCl；LBB培养基：5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨、18.5 g/L脑心浸液、5 g/L NaCl；感受态培养基含30 g/L L-甘氨酸、4 g/L异烟肼、1 mL/L吐温80；LBHIS培养基含91 g/L山梨醇；大肠杆菌培养：37°C、220 rpm、12–16 h；谷氨酸棒状杆菌培养：30°C、220 rpm、14–18 h；抗生素：卡那霉素50/25 mg/L、氯霉素34/17 mg/L；种子培养基含25 g/L葡萄糖；发酵培养基含100 g/L葡萄糖；IPTG浓度：0.5 mM；初始OD₆₀₀：1.6；摇瓶发酵：30°C、220 rpm、72 h；补料分批发酵：5%接种量、pH 7.0（2 M KOH控制）、500 g/L葡萄糖补料
谷氨酸棒状杆菌基因组编辑
谷氨酸棒状杆菌的基因组编辑，包括基因敲除和强启动子（Ptac）或RBS插入，使用pK18mobsacB质粒进行。首先，从谷氨酸棒状杆菌基因组PCR扩增靶区域两侧的上、下游同源序列，各约1000 bp。增强元件（Ptac和RBS）通过引物序列引入，构建相应的基因编辑载体。值得注意的是，仅将Ptac启动子核心区域（不含诱导调控区）插入各靶基因上游以驱动组成型过表达。此外，为尽量减少混杂实验因素，在插入Ptac启动子时保留各靶基因的内源RBS序列，不进行删除或替换。
随后，将相应质粒电转化至谷氨酸棒状杆菌感受态细胞，孵育2–3小时后，将混合物涂布于含抗生素培养基上，30°C静置培养48小时。然后，挑取所有单菌落，划线于含100 g/L蔗糖的无抗生素平板上以消除质粒。最后，通过菌落PCR和DNA测序筛选并验证阳性克隆。
【数据】基因组编辑工具：pK18mobsacB；同源臂长度：约1000 bp；Ptac启动子：仅核心区域（不含诱导调控区）；电转化后孵育：2–3 h；抗生素平板筛选：30°C、48 h；质粒消除：100 g/L蔗糖平板
重组谷氨酸棒状杆菌生长曲线测定
为考察基因组编辑对重组菌株生长的影响，监测了生长曲线。简言之，挑取单菌落，在4 mL LBB液体培养基中于30°C、220 rpm活化14–18小时。随后，将活化培养液以1%接种量接种至含50 mL新鲜LBB液体培养基的250 mL摇瓶中，于30°C、220 rpm培养。接种后每2小时取样测定600 nm处光密度（OD₆₀₀），直至所有重组菌株达到稳定期。
【数据】活化条件：4 mL LBB、30°C、220 rpm、14–18 h；接种量：1%；培养体积：50 mL/250 mL摇瓶；取样间隔：每2 h
补料分批发酵中的生物量测定与细胞形态分析
细胞生长通过紫外-可见分光光度计测定OD₆₀₀监测。干细胞重（DCW）测定时，取10 mL发酵液离心收集菌体。菌体沉淀用去离子水洗涤三次，随后在65°C干燥至恒重。冷却至室温后，称重测定DCW。发酵残留葡萄糖用葡萄糖试纸测定。不同发酵阶段的细胞形态变化通过结晶紫染色后用Olympus CX33显微镜（Olympus，日本）观察，配备WHSZ15X-H目镜（10×）和CXPL100XO油浸物镜（100×）。显微照片用LIOO软件（LIOO software，德国）拍摄，并使用内置校准功能校准所有细胞图像的标尺。
【数据】DCW测定：10 mL发酵液、65°C干燥至恒重；显微镜：Olympus CX33，目镜10×，油浸物镜100×；染色：结晶紫
肝素前体的分离纯化
肝素前体按此前报道的方法分离纯化。首先，取30–50 mL发酵液，7000 rpm离心10分钟收集菌体沉淀。沉淀随后重悬并用去离子水洗涤三次，以去除培养基杂质。洗涤后，将菌体重悬于去离子水中，用高压匀浆机在1000 bar破碎4分钟。处理后的混合物在65°C加热2小时使蛋白质变性，然后12,000 rpm离心10分钟收集上清液。上清液与三倍体积乙醇混合，4°C孵育过夜。之后，混合物12,000 rpm离心10分钟收集不溶性沉淀。所得沉淀在65°C干燥，重新溶解于去离子水中，乙醇沉淀重复三次，以尽量减少胞内小分子碳水化合物类似物的干扰。
【数据】发酵液体积：30–50 mL；离心：7000 rpm、10 min；洗涤：3次；高压匀浆：1000 bar、4 min；蛋白变性：65°C、2 h；离心：12,000 rpm、10 min；乙醇沉淀：3倍体积乙醇、4°C过夜、重复3次
研究结果
谷氨酸棒状杆菌中肝素前体生物合成途径的构建
分析谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032的代谢网络后，发现肝素前体生物合成不可或缺的两个关键前体UDP-GlcA和UDP-GlcNAc可内源产生（图1）。然而，催化UDP-GlcA和UDP-GlcNAc下游转化为肝素前体的内源酶缺失。因此，首先将大肠杆菌K5糖基转移酶编码基因kfiA和kfiC克隆并插入pXMJ19，构建质粒pXMJ19-kfiA-kfiC和pXMJ19-kfiC-kfiA（图2A），然后分别转化至Cg0，产生菌株Cg1和Cg2。结果显示（图2B），Cg2（179.86 mg/L）比Cg1（139.17 mg/L）具有轻微产量优势，表明关键基因的不同表达框可能影响目标产物的生物合成。这一现象可归因于不同表达框改变了KfiA和KfiC的相对表达强度，从而干扰功能性催化复合物KfiA-KfiC的组装。经肝素酶III解聚后，鉴定到不饱和二糖ΔUA-GlcNAc（m/z = 378.10），确认Cg2中成功合成了肝素前体（图2C）。
基于前期研究，推测KfiB——一种稳定KfiA-KfiC复合物并在大肠杆菌K5肝素前体合成和转运中发挥重要功能蛋白——可能有助于提高谷氨酸棒状杆菌胞内肝素前体含量。为验证这一推测，构建了三个新质粒pXMJ19-kfiB-kfiC-kfiA、pXMJ19-kfiC-kfiB-kfiA和pXMJ19-kfiC-kfiA-kfiB，并转化至Cg0，产生重组菌株Cg3、Cg4和Cg5。如图2B所示，重组菌株Cg3、Cg4和Cg5的肝素前体产量分别为226.37、172.46和136.00 mg/L，表明kfiB-kfiC-kfiA表达框可能具有更强的肝素前体生物合成增强潜力，尽管该差异无统计学显著性。这一结果表明，平衡KfiA、KfiB和KfiC的表达可能是提高肝素前体产量的可行策略。
【数据】Cg1产量：139.17 mg/L；Cg2产量：179.86 mg/L；Cg3产量：226.37 mg/L；Cg4产量：172.46 mg/L；Cg5产量：136.00 mg/L；ΔUA-GlcNAc m/z：378.10；统计学：ns（p ≥ 0.05）；生物学重复：n = 3
提高胞内UDP-GlcA和UDP-GlcNAc含量以改善肝素前体产量
为进一步提高肝素前体生物合成，克隆了UDP-GlcA和UDP-GlcNAc生物合成中不可或缺的五个基因glmM、ugD、glmU、glmS和galU，构建质粒pXMJ19-kfiB-kfiC-kfiA-X（X = glmM、ugD、glmU、glmS或galU）（图3A）。这些质粒随后转化至Cg0，分别产生Cg6–Cg10。遗憾的是，这些基因的引入并未提高肝素前体产量（图3B），部分原因可能是在现有三基因表达框中插入额外基因导致载体增大和结构不稳定。
为稳定提高胞内UDP-GlcA和UDP-GlcNAc含量，在基因组水平上调靶基因表达。简言之，在Cg3中glmM、ugD、glmU、glmS或galU上游插入强启动子Ptac（补充图1），构建重组菌株Cg11、Cg12、Cg13、Cg14和Cg15。首先评估了这些重组菌株的生长曲线（图3C）。与对照相比，仅Cg13生长性能略有下降。此外，除Cg13外，几乎所有重组菌株的肝素前体合成效率均高于Cg3（图3D）。与Cg3相比，重组菌株Cg12、Cg14和Cg15的肝素前体产量显著提高，分别达到447.97、328.61和278.34 mg/L，分别为对照的2.67、1.96和1.66倍。随后将三个优良菌株通过两两组合构建重组菌株Cg16、Cg17和Cg18。生长曲线（图3C）证实该强化策略未对细菌生长产生不利影响。然而，仅Cg16（486.72 mg/L）在肝素前体生物合成方面表现出轻微改善（图3D），这可能与重组菌株中的碳源重新分配有关。
【数据】Cg12产量：447.97 mg/L（2.67倍）；Cg14产量：328.61 mg/L（1.96倍）；Cg15产量：278.34 mg/L（1.66倍）；Cg16产量：486.72 mg/L；Cg13：生长和产量均受负面影响；统计学：p < 0.05，p < 0.01，p < 0.001，ns（p ≥ 0.05）；生物学重复：n = 3
代谢途径策略性调控以高效积累胞内UDP-GlcA和UDP-GlcNAc
微生物生理代谢类似一个复杂网络，涉及众多代谢物的通量和转化。消除冗余代谢分支并增强核心途径可能有助于将更多碳通量引入目标生物合成途径。例如，arcA和iclR双敲除不仅减少了有毒代谢物乙酸的积累，还显著增强了大肠杆菌中N-乙酰神经氨酸的生物合成。敲除EMP途径中的pfkA减少了碳源分流，将碳通量重新导向软骨素合成，显著提高了软骨素产量。
【数据】参考案例：arcA/iclR双敲除增强N-乙酰神经氨酸合成；pfkA敲除提高软骨素产量（引自参考文献）
RBS随机序列文库的构建
基因表达在多个层面受到调控，包括转录水平、翻译水平和翻译后水平。翻译水平调控直接控制蛋白质合成速率，在代谢工程中具有巨大潜力。RBS是mRNA上核糖体结合的位点，其序列决定翻译起始效率。通过构建RBS随机文库，可在翻译水平对靶基因表达进行精细调控。本研究构建了高覆盖度RBS随机文库，用于kfiB-kfiC-kfiA表达框中各基因的翻译水平微调。
【数据】RBS文库构建方法：携带随机序列的引物扩增初始报告载体pXMJ19-M；筛选菌落数：384个
不同RBS序列对mCherry表达的相对荧光强度
从RBS文库中筛选得到32个不同强度的RBS序列（R1–R32），根据相对荧光强度分为五个翻译强度组：极强、强、中强、中弱和弱。R_B、R_C和R_A分别代表质粒pXMJ19-kfiB-kfiC-kfiA中kfiB、kfiC和kfiA的RBS序列。
【数据】RBS变体数量：32个（R1–R32）；分组：极强、强、中强、中弱、弱
不同p19BCA-rbsX质粒重组菌株的肝素前体产量
将不同组合的RBS序列引入kfiB-kfiC-kfiA表达框，构建系列p19BCA-rbsX质粒并转化至Cg0，评估不同RBS组合对肝素前体产量的影响。色块表示各重组质粒中三个基因（kfiB、kfiC、kfiA）的RBS强度。
【数据】统计学：p < 0.05，p < 0.01，p < 0.001，****p < 0.0001，ns（p ≥ 0.05）；生物学重复：n = 3
重组菌株Cg24-11在5 L生物反应器中的补料分批发酵
在5 L生物反应器中，采用两阶段生长-生产调控策略进行补料分批发酵。IPTG在发酵20小时时添加以触发重组蛋白表达和产物生物合成。粉色柱表示不同时间点的胞内肝素前体滴度，肉色柱表示胞外肝素前体滴度。深色曲线表示发酵过程中的OD₆₀₀。发酵过程中还进行了形态学观察：诱导前（左）和诱导后晚期（右），细胞在1000×放大倍数下用光学显微镜观察。
【数据】反应器：5 L生物反应器；IPTG添加时间：20 h；显微镜放大倍数：1000×；标尺：10 μm
讨论与解读
本研究将生物安全菌株谷氨酸棒状杆菌开发为高效生产肝素前体的微生物细胞工厂。首先通过优化kfiA、kfiB和kfiC的表达框架，在谷氨酸棒状杆菌中建立了基础肝素前体生物合成途径。结果表明，不同功能相关基因的相对表达强度可能影响目标产物的合成，为后续工程改造提供了基础。
为促进UDP-GlcA和UDP-GlcNAc的胞内积累，利用质粒分别过表达glmM、ugD、glmU、glmS和galU，但相应重组菌株未能提高肝素前体产量，可能归因于过大载体固有的不稳定性。为稳定上调这些基因的表达，在基因组水平通过插入强启动子Ptac对相关基因进行修饰。重组菌株Cg11、Cg12、Cg14和Cg15均表现出肝素前体产量提高，其中Cg12、Cg14和Cg15的增强更为显著，分别达到对照的2.67、1.96和1.66倍。然而，Cg13的生长和产物合成均受到负面影响，表明glmU过表达导致生物量和产物积累同时减少。
通过基因组规模改造（稳定上调ugd、glmS和ndk基因），重组菌株Cg24的肝素前体产量从226.37 mg/L提高至595.39 mg/L。进一步通过构建高覆盖度随机RBS文库，在翻译水平对kfiB-kfiC-kfiA表达框中各基因的表达进行精细调控，将肝素前体产量进一步提升至1161.37 mg/L。在5 L生物反应器中采用两阶段生长-生产调控策略进行补料分批发酵，重组菌株Cg24-11产生5.36 g/L肝素前体，展示了其在高效肝素前体生物合成方面的巨大潜力。
编译者解读
本研究提供了一条值得借鉴的组合策略——将基因组层面的"粗调"与翻译层面的"微调"有机结合，系统性解决异源多糖合成中的前体供给与通量平衡问题。RBS随机文库的构建尤其亮眼，为多基因表达框中各基因的翻译强度匹配提供了高通量筛选工具。这种策略不仅适用于肝素前体，对氨基糖、糖胺聚糖等复杂化合物的微生物合成同样具有参考价值。值得注意的是，从摇瓶到5 L反应器的产量跃升（1.16 g/L到5.36 g/L）暗示两阶段调控策略的工业应用潜力，但胞内产物占比较高可能增加下游纯化成本，未来若能强化产物分泌将更具经济性。
参考来源
Zhang J, Cui Y, Zhang P, Zhao M, Fan L. Enhanced heparosan biosynthesis in Corynebacterium glutamicum by systematic metabolic engineering and translation-level fine-tuning. Bioresources and Bioprocessing. DOI: 10.1186/s40643-026-01113-5. PMCID: PMC13478042.
PMCID: PMC13478042