来源：Novel utilization of the seaweed-based deoxy sugars rhamnose and fucose by engineered Corynebacterium glutamicum.（Microb Cell Fact）| 编译：DNA Lab Space
导读
海藻是工业生物技术的潜在可持续碳源，但工业主力菌株谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）天然无法代谢绿藻和褐藻中丰富的脱氧糖L-鼠李糖与L-岩藻糖。本研究通过引入大肠杆菌的 rhaBADM 和 fucIKUA 操纵子，成功赋予该菌利用这两种糖作为唯一碳源的能力，并系统优化了转运系统与内源乳醛脱氢酶功能，最终在海藻水解物中实现生物量增长与L-赖氨酸生产。
研究背景
全球人口已超80亿，并以每年约7000万人的速度增长，对可持续原料的需求日益迫切。工业生物技术中，作物来源的D-葡萄糖被广泛用作微生物工厂的碳源，这引发了将粮食作物用于工业能源生产的伦理担忧。海藻（大型藻类）因生长速度快、资源需求低——无需耕地、淡水或肥料——而成为陆地作物的有力替代方案。2020年全球海藻产量超过3500万吨，主要产自印度尼西亚、中国和菲律宾，挪威的海藻产业也潜力巨大。海藻生物质含有D-葡萄糖、D-甘露醇、海藻酸盐和D-木糖等多种可发酵碳水化合物，通常占海藻干重的30–60%，但组成随物种、收获时间和地理位置显著变化。
研究方法
菌株、质粒与培养条件
本工作所用质粒和菌株分别列于表1和表2。除非另有说明，本研究中使用的所有化学品和耗材购自Sigma-Aldrich。本研究所用培养箱为New Brunswick Innova® 42（Eppendorf）。大肠杆菌DH5α作为常规克隆宿主，在Luria-Bertani（LB；10 g L⁻¹胰蛋白胨、5 g L⁻¹酵母提取物、5 g L⁻¹ NaCl）培养基中、225 rpm转速下培养，或在LB琼脂平板上于37°C培养；谷氨酸棒杆菌作为表达宿主，预培养在2TY培养基（16 g L⁻¹胰蛋白胨、10 g L⁻¹酵母提取物、5 g L⁻¹ NaCl）中，225 rpm、30°C条件下培养。主培养在带挡板的摇瓶中进行，使用250 mL或500 mL摇瓶，装液量为10%，150 rpm振荡、30°C培养。培养也在BioLector Pro（m2p Labs）微生物反应器中进行，1 mL培养物体积、30°C、1100 rpm，使用48孔FlowerPlate和透气密封箔（Beckman Coulter）。BioLector系统进行的生长实验通过测量620 nm处的背散射信号进行监测，该信号提供与培养物细胞密度相关的任意单位（a.u.）数值。补充了生物素（0.2 mg L⁻¹）和1 mL L⁻¹微量元素溶液的最低培养基（CGXII）按前述方法配制。CGXII盐溶液由(NH₄)₂SO₄（10 g L⁻¹）、KH₂PO₄（1 g L⁻¹）、K₂HPO₄（1 g L⁻¹）、尿素（5 g L⁻¹）、MOPS（42 g L⁻¹）、1 mL Mg储备液（MgSO₄·7H₂O，250 g L⁻¹）和1 mL Ca储备液（CaCl₂·2H₂O，13.25 g L⁻¹）组成。微量元素溶液由FeSO₄·7H₂O（16.4 g L⁻¹）、MnSO₄·H₂O（10 g L⁻¹）、ZnSO₄·7H₂O（1 g L⁻¹）、CuSO₄·5H₂O（0.31 g L⁻¹）和NiCl₂·6H₂O（0.02 g L⁻¹）组成，用HCl调pH至1。主培养以初始光密度（OD₆₀₀）约1接种。光密度通过分光光度计Biochrom Ultrospec 7500（Fisher Scientific）测量。细胞在接种最低培养基前用CGXII溶液洗涤一次。细胞干生物量（g L⁻¹）按0.343·x（OD₆₀₀_final − OD₆₀₀_initial）估算，其中0.343为本实验室针对谷氨酸棒杆菌的特定换算系数。生物量得率通过将生物量克数除以培养中消耗的碳源克数计算。碳源使用L-鼠李糖、L-岩藻糖、D-葡萄糖以及绿藻和褐藻水解物。必要时，向培养基中补充1 mM异丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、5 µg mL⁻¹四环素和/或25 µg mL⁻¹卡那霉素。本研究中使用的所有培养基均在121°C下高压灭菌20分钟，但微量元素溶液、抗生素、生物素和IPTG除外，这些通过0.22 μm孔径过滤器过滤灭菌。
表1 本工作所用质粒清单
| 质粒名称 | 描述 | 来源 |
|---|---|---|
| pECXT99a | Tetʳ，谷氨酸棒杆菌/大肠杆菌穿梭质粒（Ptrc lacI，pGA1 oriVCg） | Kirchner和Tauch |
| pVWEx1 | Kanʳ，谷氨酸棒杆菌/大肠杆菌穿梭质粒（Ptrc lacI，pBL1 oriVCg） | Peters-Wendisch等 |
| pSH1 | Kanʳ，谷氨酸棒杆菌表达穿梭质粒，Ptuf，pHM519 oriVCg | Henke等 |
| pVWEx1-rhaBADM | Kanʳ，pVWEx1过表达大肠杆菌MG1655的rhaBADM基因 | 本研究 |
| pVWEx1-fucIKUA | Kanʳ，pVWEx1过表达大肠杆菌MG1655的fucIKUA基因 | 本研究 |
| pECXT99a-fucP | Tetʳ，pECXT99a过表达大肠杆菌MG1655的fucP基因 | 本研究 |
| pECXT99a-rhaT | Tetʳ，pECXT99a过表达大肠杆菌MG1655的rhaT基因 | 本研究 |
| pECXT99a-iolT1 | Tetʳ，pECXT99a过表达谷氨酸棒杆菌ATCC13032的iolT1基因 | Brito等 |
| pECXT99a-iolT2 | Tetʳ，pECXT99a过表达谷氨酸棒杆菌ATCC13032的iolT2基因 | Brito等 |
| pSH1-fucIKUA | Kanʳ，pSH1过表达大肠杆菌MG1655的fucIKUA基因 | 本研究 |
| pSH1-rhaBADM | Kanʳ，pSH1过表达大肠杆菌MG1655的rhaBADM基因 | 本研究 |
| pSH1-rhaBADM-rhaT | Kanʳ，pSH1过表达大肠杆菌MG1655的rhaBADM和rhaT基因 | 本研究 |
| pSH1-rhaBADM-fucP | Kanʳ，pSH1过表达大肠杆菌MG1655的rhaBADM和fucP基因 | 本研究 |
| pSH1-rhaBADM-iolT2 | Kanʳ，pSH1过表达大肠杆菌MG1655的rhaBADM基因和谷氨酸棒杆菌ATCC13032的iolT2基因 | 本研究 |
| pSH1-fucIKUA-fucP | Kanʳ，pSH1过表达大肠杆菌MG1655的fucIKUA和fucP基因 | 本研究 |
| pSH1-fucIKUA-iolT2 | Kanʳ，pSH1过表达大肠杆菌MG1655的fucIKUA基因和谷氨酸棒杆菌ATCC13032的iolT2基因 | 本研究 |
| pVWEx1-rhaBADM-fucP | Kanʳ，pVWEx1过表达大肠杆菌MG1655的rhaBADM和fucP基因 | 本研究 |
| pVWEx1-fucIKUA-iolT2 | Kanʳ，pVWEx1过表达大肠杆菌MG1655的fucIKUA基因和谷氨酸棒杆菌ATCC13032的iolT2基因 | 本研究 |
| pECXT99a-aldA | Tetʳ，pECXT99a过表达大肠杆菌MG1655的aldA基因 | 本研究 |
| pECXT99a-ald | Tetʳ，pECXT99a过表达谷氨酸棒杆菌ATCC13032的ald基因 | 本研究 |
Kanʳ：卡那霉素抗性，Tetʳ：四环素抗性
表2 本工作所用菌株清单
| 菌株名称 | 描述 | 来源 |
|---|---|---|
| 大肠杆菌DH5α | DH5α菌株：ΔlacU169（φ80lacZ ΔM15），supE44，hsdR17，recA1，endA1，gyrA96，thi-1，relA1 | Hanahan |
| 谷氨酸棒杆菌野生型 | ATCC13032菌株，生物素营养缺陷型 | Abe等 |
| GSL-A | 谷氨酸棒杆菌ATCC13032，含以下修饰：Δpck，pycP458S，homV59A，2拷贝lysCT311I，2拷贝asd，2拷贝dapA，2拷贝dapB，2拷贝ddh，2拷贝lysA，2拷贝lysE，原噬菌体CGP1（cg1507-cg1524）、CGP2（cg1746-cg1752）、CGP3（cg1890-cg2071）、sugR（cg2115）、ldhA（cg3219）、snaA（cg1722）框内缺失 | Pérez-García等 |
| WTΔald | 谷氨酸棒杆菌野生型ATCC13032，缺失乙醛脱氢酶基因（ald） | Lessmeiser等 |
| WTΔfadH | 谷氨酸棒杆菌野生型ATCC13032，缺失甲醛脱氢酶基因（fadH） | Lessmeiser等 |
| WTΔaldΔfadH | 谷氨酸棒杆菌野生型ATCC13032，缺失ald和fadH基因 | Lessmeiser等 |
| CgCon1 | 谷氨酸棒杆菌（pVWEx1） | 本研究 |
| CgCon2 | 谷氨酸棒杆菌（pSH1） | 本研究 |
| CgCon3 | 谷氨酸棒杆菌（pECXT99a） | 本研究 |
| CgCon4 | 谷氨酸棒杆菌（pSH1）（pECXT99a） | 本研究 |
| CgRha1 | 谷氨酸棒杆菌（pVWEx1-rhaBADM） | 本研究 |
| CgRha1C | 谷氨酸棒杆菌（pVWEx1-rhaBADM）（pECXT99a） | 本研究 |
| CgRha2 | 谷氨酸棒杆菌（pVWEx1-rhaBADM）（pECXT99a-rhaT） | 本研究 |
| CgRha3 | 谷氨酸棒杆菌（pVWEx1-rhaBADM）（pECXT99a-fucP） | 本研究 |
| CgRha4 | 谷氨酸棒杆菌（pVWEx1-rhaBADM）（pECXT99a-iolT1） | 本研究 |
| CgRha5 | 谷氨酸棒杆菌（pVWEx1-rhaBADM）（pECXT99a-iolT2） | 本研究 |
| CgRha6 | 谷氨酸棒杆菌（pVWEx1-rhaBADM-fucP） | 本研究 |
| CgRha7 | 谷氨酸棒杆菌（pSH1-rhaBADM-fucP） | 本研究 |
| CgRha8 | 谷氨酸棒杆菌（pSH1-rhaBADM-fucP）（pECXT99a） | 本研究 |
| CgRha9 | 谷氨酸棒杆菌（pSH1-rhaBADM-fucP）（pECXT99a-ald） | 本研究 |
| CgFuc1 | 谷氨酸棒杆菌（pVWEx1-fucIKUA） | 本研究 |
| CgFuc1C | 谷氨酸棒杆菌（pVWEx1-fucIKUA）（pECXT99a） | 本研究 |
| CgFuc2 | 谷氨酸棒杆菌（pVWEx1-fucIKUA）（pECXT99a-rhaT） | 本研究 |
| CgFuc3 | 谷氨酸棒杆菌（pVWEx1-fucIKUA）（pECXT99a-fucP） | 本研究 |
| CgFuc4 | 谷氨酸棒杆菌（pVWEx1-fucIKUA）（pECXT99a-iolT1） | 本研究 |
| CgFuc5 | 谷氨酸棒杆菌（pVWEx1-fucIKUA）（pECXT99a-iolT2） | 本研究 |
| CgFuc6 | 谷氨酸棒杆菌（pVWEx1-fucIKUA-iolT2） | 本研究 |
| CgFuc7 | 谷氨酸棒杆菌（pSH1-fucIKUA-iolT2） | 本研究 |
| CgFuc8 | 谷氨酸棒杆菌（pSH1-fucIKUA-iolT2）（pECXT99a） | 本研究 |
| CgFuc9 | 谷氨酸棒杆菌（pSH1-fucIKUA-iolT2）（pECXT99a-ald） | 本研究 |
| CgAld | 谷氨酸棒杆菌（pECXT99a-ald） | 本研究 |
| CgAldA | 谷氨酸棒杆菌（pECXT99a-aldA） | 本研究 |
| CgLysRha | 谷氨酸棒杆菌GSL-A（pSH1-rhaBADM-fucP）（pECXT99a-ald） | 本研究 |
| CgLysFuc | 谷氨酸棒杆菌GSL-A（pSH1-fucIKUA-iolT2）（pECXT99a-ald） | 本研究 |
分子遗传技术与质粒构建
采用已建立的标准分子遗传技术。使用CloneAmp™ HiFi PCR Premix（Takara Bio Inc.）进行特定基因的扩增。引物见补充材料（表S1）。基因rhaBADM（NCBI GeneIDs：948399、948400、948401、948402）、rhaT（NCBI GeneID：948398）、fucIKU（NCBI GeneIDs：946195、946022、945842）、fucA（NCBI GeneID：947282）、fucP（NCBI GeneID：947487）和aldA（NCBI GeneID：945672）从大肠杆菌基因组DNA中扩增获得。
【数据】培养基：LB/2TY/CGXII；温度：30°C/37°C；转速：150/225/1100 rpm；OD₆₀₀初始值：约1；生物量换算系数：0.343；IPTG浓度：1 mM；四环素：5 µg mL⁻¹；卡那霉素：25 µg mL⁻¹；灭菌条件：121°C、20 min
研究结果
在谷氨酸棒杆菌中实现L-鼠李糖和L-岩藻糖的消耗
利用大肠杆菌中负责脱氧糖利用的遗传元件，使谷氨酸棒杆菌能够代谢这些糖作为碳源。因此，通过质粒pVWEx1在谷氨酸棒杆菌中过表达L-鼠李糖利用基因rhaBADM，获得菌株CgRha1。类似地，在谷氨酸棒杆菌中过表达L-岩藻糖利用基因fucIKUA，获得菌株CgFuc1。新构建的菌株以及对照菌株谷氨酸棒杆菌（pVWEx1）（命名为CgCon1）在补充了1% L-鼠李糖或L-岩藻糖作为唯一碳源的CGXII最低培养基中培养。空质粒对照菌株CgCon1不能在L-鼠李糖或L-岩藻糖上生长，而菌株CgRha1能在L-鼠李糖上生长（图2A），菌株CgFuc1能够以L-岩藻糖作为唯一碳源生长（图2B）。此外，为评估底物特异性，将CgRha1在含1% L-岩藻糖的CGXII培养基中培养，CgFuc1在含1% L-鼠李糖的CGXII培养基中培养。然而，在测试条件下未观察到生长（数据未显示）。
此外，评估了碳源浓度逐渐增加对工程化谷氨酸棒杆菌菌株生长的影响。将CgRha1和CgFuc1菌株分别在补充了0.5%、1%、2%或4%浓度L-鼠李糖和L-岩藻糖的CGXII培养基中培养。同时使用相同浓度的D-葡萄糖作为对照碳源。对于D-葡萄糖，在1%至4%浓度范围内，各测试菌株的生长速率值相似（图2C）。在4% D-葡萄糖培养中获得的生物量得率显示所有菌株CgCon1、CgRha1和CgFuc1均有所下降，与2% D-葡萄糖相比分别降低了0.18 ± 0.02、0.16 ± 0.02和0.15 ± 0.04 g g⁻¹（图2D）。相比之下，在不同浓度的L-鼠李糖和L-岩藻糖培养中，生物量得率保持恒定，从2%到4%时L-鼠李糖和L-岩藻糖均仅小幅下降0.06 ± 0.02 g g⁻¹（图2F和H）。然而，对于L-鼠李糖和L-岩藻糖，糖浓度的增加与更高的生长速率相关。具体而言，在含4% L-鼠李糖的CGXII培养基中培养的CgRha1达到0.11 ± 0.01 h⁻¹的生长速率（图2E），而在含4% L-岩藻糖中培养的CgFuc1表现出相似的生长速率0.13 ± 0.01 h⁻¹（图2G）。通过培养上清液的HPLC分析确认，菌株CgCon1、CgRha1和CgFuc1消耗了所测试糖的96–100%。
【数据】L-鼠李糖浓度：0.5–4%；L-岩藻糖浓度：0.5–4%；D-葡萄糖浓度：0.5–4%；CgRha1在4% L-鼠李糖下生长速率：0.11 ± 0.01 h⁻¹；CgFuc1在4% L-岩藻糖下生长速率：0.13 ± 0.01 h⁻¹；4% D-葡萄糖生物量得率降低：0.18 ± 0.02、0.16 ± 0.02、0.15 ± 0.04 g g⁻¹；2%至4%脱氧糖生物量得率降低：0.06 ± 0.02 g g⁻¹；糖消耗率：96–100%
过表达通透酶以改善谷氨酸棒杆菌在脱氧糖上的生长
为评估非天然脱氧糖L-鼠李糖和L-岩藻糖的摄取并提高微生物生长速率，评估了四种不同的通透酶。所研究的转运蛋白为RhaT和FucP（均来自大肠杆菌gDNA），以及IolT1和IolT2（均来自谷氨酸棒杆菌gDNA）。因此，将质粒pECXT99a、pECXT99a-rhaT、pECXT99a-fucP、pECXT99a-iolT1和pECXT99a-iolT2转入菌株CgRha1，获得菌株CgRha1C、CgRha2、CgRha3、CgRha4和CgRha5；转入菌株CgFuc1，获得菌株CgFuc1C、CgFuc2、CgFuc3、CgFuc4和CgFuc5（表2）。新构建的菌株在微生物反应器中的1 mL CGXII培养物中于30°C、1100 rpm条件下培养（图3）。在培养基中补充终浓度为1 mM、0.1 mM或0.01 mM的IPTG以提供不同的诱导水平（图3）。菌株CgRha1C和CgFuc1C作为对照（图3A和F）。
对于在L-鼠李糖上的生长，过表达rhaT的菌株CgRha2在1和0.1 mM IPTG下均仅在约70小时的滞后期后才开始生长（图3B）。相比之下，过表达iolT1的菌株CgRha4在任何测试的IPTG诱导水平下均不生长（图3D）。对于过表达fucP和iolT2的CgRha3和CgRha5，0.01 mM IPTG诱导导致最终生物量低于较高IPTG浓度诱导的菌株（图3C和E）。对于fucP过表达，在1 mM或0.1 mM IPTG诱导时，约50小时后达到最终生物量（图3C）。相比之下，iolT2过表达在1 mM IPTG诱导时约70小时后达到最终生物量（图3E）。值得注意的是，0.1 mM和1 mM IPTG均产生相同的最终生物量（图3C和E）。
至于在L-岩藻糖上的生长，过表达rhaT和iolT1的菌株（图3G和I）无论IPTG水平如何均生长缓慢，最终生物量低于CgFuc1C。对于过表达fucP的CgFuc3菌株，在1 mM诱导下30小时后达到最终生物量（图3I）。相比之下，对于过表达iolT2的CgFuc5菌株，同样在1 mM诱导下，生长24小时后达到最终生物量（图3J）。
这些培养分别延长至95小时和45小时（针对L-鼠李糖和L-岩藻糖的生长），以检查不同诱导水平下的最终生物量（图3）。延长的培养使我们得出结论：对于CgFuc5，1 mM IPTG优于0.1 mM IPTG（图3J）。基于最终生物量和达到平台期所需的时间，我们选择CgRha3（过表达fucP用于L-鼠李糖转运）和CgFuc5（过表达iolT2用于L-岩藻糖转运）继续后续实验，因为它们与对照菌株CgRha1C和CgFuc1C相比，生长速度分别加快了3.1倍和2.8倍（图3A和F）。
【数据】培养体积：1 mL；温度：30°C；转速：1100 rpm；IPTG浓度：1/0.1/0.01 mM；CgRha2滞后期：约70 h；CgRha3达最终生物量时间：约50 h（1或0.1 mM IPTG）；CgRha5达最终生物量时间：约70 h（1 mM IPTG）；CgFuc3达最终生物量时间：30 h（1 mM IPTG）；CgFuc5达最终生物量时间：24 h（1 mM IPTG）；CgRha3生长加速倍数：3.1倍；CgFuc5生长加速倍数：2.8倍
利用操纵子和优选转运蛋白基因被组合到pVWEx1和pSH1质粒中，后者携带组成型Ptuf启动子系统以实现持续基因表达（表1）。因此，构建了质粒pVWEx1-rhaBADM-fucP、pVWEx1-fucIKUA-iolT2、pSH1-rhaBADM-fucP和pSH1-fucIKUA-iolT2，并转入野生型谷氨酸棒杆菌，获得菌株CgRha6、CgFuc6、CgRha7和CgFuc7（表2）。
这些新构建的菌株在250 mL带挡板摇瓶中的CGXII培养基中培养，补充1%碳源，即L-鼠李糖或L-岩藻糖。根据统计分析，比较CgFuc6和CgFuc7时，最终生物量和生长速率均无显著差异（图4）。然而，比较CgRha6和CgRha7时，观察到CgRha7的最终生物量（2.69 g L⁻¹ ± 0.10 g L⁻¹）高于CgRha6（2.05 g L⁻¹ ± 0.01 g L⁻¹），使用pSH1载体时对应约31%的增加（p = 0.019）（图4）。因此，选择pSH1载体用于后续实验。
【数据】碳源浓度：1%；CgRha7最终生物量：2.69 ± 0.10 g L⁻¹；CgRha6最终生物量：2.05 ± 0.01 g L⁻¹；生物量增加：约31%；p值：0.019；CgFuc6 vs CgFuc7：无显著差异
L-乳醛对谷氨酸棒杆菌生长的影响
在L-鼠李糖和L-岩藻糖利用过程中，L-乳醛作为副产物形成。为评估L-乳醛对谷氨酸棒杆菌生长的影响，将野生型谷氨酸棒杆菌在补充了0、1.56、3.13、6.25、25、50或100 mM L-乳醛的1%葡萄糖最低培养基中培养（图5A和B）。L-乳醛浓度低于25 mM时对生长速率没有显著影响（图5A）。然而，在50和100 mM L-乳醛浓度下，与对照相比生长速率下降了约50%（图5A）。最终OD₆₀₀值在25 mM及以上浓度时下降（图5B和C）。使用NADH测定法和以D-葡萄糖为唯一碳源培养的谷氨酸棒杆菌野生型粗提物测定乳醛脱氢酶活性（图5D）。反应中包含L-乳醛时观察到NADH依赖性活性，而不含L-乳醛时未观察到该活性（图5D）。此外，将野生型谷氨酸棒杆菌在20 mM D-葡萄糖、20 mM L-乳醛和无碳源条件下培养（图5E）。菌株仅在D-葡萄糖上生长，在L-乳醛上未观察到生长（图5E）。
为研究L-乳醛代谢涉及的基因，将野生型（WT）、WTΔald、WTΔfadH和WTΔaldΔfadH菌株在20 mM D-葡萄糖、20 mM L-乳醛和无碳源条件下培养（图6A–D）。所有菌株均在D-葡萄糖上生长，但无一能在L-乳醛上生长（图6A–D）。此外，构建了过表达内源ald基因的菌株CgAld和过表达大肠杆菌aldA基因的菌株CgAldA，并将其与对照菌株CgCon3在20、30和40 mM L-乳醛作为唯一碳源的条件下进行比较（图6E–G）。所有菌株均不能在L-乳醛上生长，无论L-乳醛浓度如何（图6E–G）。
【数据】L-乳醛浓度：0–100 mM；葡萄糖浓度：1%；生长速率下降：约50%（50和100 mM L-乳醛）；D-葡萄糖浓度：20 mM；L-乳醛浓度：20/30/40 mM；NADH测定：含L-乳醛时检测到活性
过表达ald对脱氧糖生长的影响
由于L-乳醛是L-鼠李糖和L-岩藻糖分解代谢的副产物，研究了内源ald基因的过表达对脱氧糖利用的影响。构建了菌株CgFuc8和CgFuc9（pSH1-fucIKUA-iolT2分别含pECXT99a和pECXT99a-ald）以及CgRha8和CgRha9（pSH1-rhaBADM-fucP分别含pECXT99a和pECXT99a-ald）。将这些菌株在含1% L-岩藻糖或1% L-鼠李糖的CGXII培养基中培养（图7）。对于L-岩藻糖生长，CgFuc8和CgFuc9之间无显著差异（图7A）。对于L-鼠李糖生长，CgRha8和CgRha9之间也未发现显著差异（图7B）。单因素ANOVA检验未发现显著差异（p = 0.052）。
【数据】碳源浓度：1%；p值：0.052；CgFuc8 vs CgFuc9：无显著差异；CgRha8 vs CgRha9：无显著差异
海藻水解物作为碳源的培养
为评估工程菌株利用海藻来源碳源的能力，使用从绿藻Ulva lactuca和褐藻Saccharina latissima制备的海藻水解物进行培养。将菌株CgCon4（对照）和CgRha9在不同浓度的U. lactuca水解物中培养（图8A和B）。在含25%和50%绿藻水解物的培养基中，CgRha9的生物量分别比CgCon4高1.9倍和3.0倍（图8A），生长速率分别高1.5倍和2.3倍（图8B）。类似地，将CgCon4和CgFuc9在不同浓度的S. latissima水解物中培养（图8C和D）。在含25%和50%褐藻水解物的培养基中，CgFuc9的生物量分别比CgCon4高1.5倍和1.7倍（图8C），生长速率分别高1.4倍和1.8倍（图8D）。
【数据】绿藻水解物浓度：25%、50%；CgRha9生物量倍数变化：1.9倍（25%）、3.0倍（50%）；CgRha9生长速率倍数变化：1.5倍（25%）、2.3倍（50%）；褐藻水解物浓度：25%、50%；CgFuc9生物量倍数变化：1.5倍（25%）、1.7倍（50%）；CgFuc9生长速率倍数变化：1.4倍（25%）、1.8倍（50%）
海藻水解物上的L-赖氨酸生产
为评估海藻水解物上增值化合物的生产，将菌株CgLysRha（GSL-A（pSH1-rhaBADM-fucP）（pECXT99a-ald））和CgLysFuc（GSL-A（pSH1-fucIKUA-iolT2）（pECXT99a-ald））在含50%绿藻水解物（GSH）或50%褐藻水解物（BSH）的培养基中培养，以2% L-鼠李糖或2% L-岩藻糖作为对照碳源（图9）。使用50% GSH作为碳源时，CgLysRha产生约8 g L⁻¹的L-赖氨酸，而使用2% L-鼠李糖时产生约5 g L⁻¹。使用50% BSH作为碳源时，CgLysFuc产生约9 g L⁻¹的L-赖氨酸，而使用2% L-岩藻糖时产生约5 g L⁻¹（图9）。
【数据】GSH浓度：50%；BSH浓度：50%；L-鼠李糖浓度：2%；L-岩藻糖浓度：2%；CgLysRha在50% GSH上L-赖氨酸产量：约8 g L⁻¹；CgLysRha在2% L-鼠李糖上L-赖氨酸产量：约5 g L⁻¹；CgLysFuc在50% BSH上L-赖氨酸产量：约9 g L⁻¹；CgLysFuc在2% L-岩藻糖上L-赖氨酸产量：约5 g L⁻¹
讨论与解读
本研究首次将大肠杆菌来源的rhaBADM和fucIKUA两个异源操纵子成功引入谷氨酸棒杆菌，使其分别获得利用L-鼠李糖和L-岩藻糖的能力。与大肠杆菌相比，谷氨酸棒杆菌缺乏严格的分解代谢物阻遏系统，可同时消耗多种碳源，且已被用于百万吨级的L-谷氨酸和L-赖氨酸生产，展示了其作为大规模生物催化剂的稳健性。工程菌株在脱氧糖上的生长速率显著低于D-葡萄糖——CgRha1在L-鼠李糖上的生长速率降至0.11 ± 0.01 h⁻¹——但通过通透酶筛选（FucP用于L-鼠李糖摄取、IolT2用于L-岩藻糖摄取）使生长速度分别提高了3.1倍和2.8倍。研究还鉴定了内源乙醛脱氢酶（由ald编码）具有乳醛脱氢酶活性。在海藻水解物培养中，工程菌株的生物量较对照提高1.5–3.0倍，并实现了L-赖氨酸生产（50%海藻水解物下约8–9 g L⁻¹）。
编译者解读
该研究的策略清晰：通路引入—转运优化—副产物代谢强化，三步递进式解决非天然底物利用的瓶颈。值得注意的是，作者没有止步于证明"能生长"，而是将最终验证放在真实海藻水解物和L-赖氨酸生产上，这使工作具有明确的产业指向。ald基因功能的重新鉴定也提示，工业菌株中可能隐藏着未被充分挖掘的代谢潜力。局限在于，脱氧糖上的生长速率仍远低于葡萄糖，且ald过表达在合成培养基中未表现出显著表型——副产物代谢的贡献或许只有在更复杂的真实底物中才得以体现。后续若能将脱氧糖利用与谷氨酸棒杆菌成熟的产物合成网络深度耦合，海藻生物炼制的前景将更加明朗。
参考来源
Stephansen IM, Brito LF, Auran OS, Lande SS, Pérez-García F. Novel utilization of the seaweed-based deoxy sugars rhamnose and fucose by engineered Corynebacterium glutamicum. Microb Cell Fact. PMID: 42277824. DOI: 10.1186/s12934-026-03035-5.
PMID: 42277824