来源：Piperonylpiperazine Targets RhlI to Reduce Virulence and Potentiate EDTA Sensitivity in Pseudomonas aeruginosa.（Foods）| 编译：DNA Lab Space
导读
铜绿假单胞菌是肉制品中主要的腐败菌，常规防腐剂的广泛使用催生了耐药菌株。本研究首次报道胡椒来源的哌嗪衍生物——胡椒基哌嗪（Pip），能在亚抑菌浓度下抑制该菌毒力因子产生，并显著增强常用防腐剂EDTA的杀菌效果。通过pull-down、转录组学、等温滴定量热法和基因敲除等多重手段，研究揭示Pip直接结合RhlI合酶的LYS-164和ASP-35残基，阻断群体感应信号级联，为开发新型天然食品防腐增效剂提供了分子层面的依据。
研究背景
微生物腐败是全球食品安全的主要威胁，是食品变质的重要原因。这些微生物通过产生黏性物质、变色和腐烂等现象导致食品劣变，可能引发食物中毒和食源性疾病，严重影响产品品质和人类健康。铜绿假单胞菌是食品生物变质和食源性疾病中最臭名昭著的腐败微生物之一，通过分泌蛋白酶、弹性蛋白酶等毒力因子启动腐败过程，导致食品产生黏液和腐烂等不可接受的感官变化。这些活动不仅使食品不可口，还带来食源性疾病风险，对食品工业和公共卫生构成双重威胁。
使用抗菌防腐剂是控制铜绿假单胞菌腐败的主要策略之一。然而，对抗菌防腐剂的过度依赖加剧了多重耐药铜绿假单胞菌菌株的全球蔓延。逆转这一趋势、使该菌株重新对抗菌干预敏感，已成为保障全球食品安全的紧迫挑战。群体感应（QS）系统的发现为这一难题提供了新的解决思路——通过干扰细菌的通讯机制而非直接杀灭，有望在降低耐药压力的同时恢复传统防腐剂的效力。
研究方法
2.1 最低抑菌浓度（MIC）与生长曲线测定
本研究选择铜绿假单胞菌PAO1而非PA14进行实验：PAO1具有清晰的遗传背景和一致的表型，适合作为食品防腐剂筛选的标准模型；而PA14作为高毒力临床菌株，在抑菌处理下表现出不稳定表型，通常用于临床感染研究。乙二胺四乙酸二钠（EDTA，纯度>99%）和Pip（纯度>97%）购自上海源叶生物科技有限公司。采用肉汤微量稀释法测定EDTA和Pip的MIC，接种量为5×10⁵ CFU/mL。细菌生长动力学通过将铜绿假单胞菌PAO1培养物接种到含有递增浓度Pip的Luria-Bertani（LB）培养基中测定。在37°C、180 rpm条件下培养24小时后，通过测量600 nm处光密度（OD）量化细胞生长。
【数据】菌株：铜绿假单胞菌PAO1；接种量：5×10⁵ CFU/mL；培养基：LB；温度：37°C；转速：180 rpm；时间：24h；检测波长：OD600；EDTA纯度：>99%；Pip纯度：>97%
2.2 抗毒力活性测定
分泌型蛋白酶活性测定：将铜绿假单胞菌PAO1的无菌上清液与0.3%偶氮酪蛋白混合，依次加入10%三氯乙酸和1 M NaOH，测量440 nm处吸光度以评估蛋白酶活性。
弹性蛋白酶活性测定：将无菌上清液与弹性蛋白-刚果红缓冲液在37°C孵育3小时。反应混合物离心后，收集上清液，测量495 nm处吸光度以测定弹性蛋白酶活性。
绿脓菌素定量：将铜绿假单胞菌PAO1在假单胞菌肉汤中过夜培养。离心去除细胞后，测量所得上清液在695 nm处的OD值。
鼠李糖脂定量：用两倍体积的乙醚萃取上清液，收集有机相并在35°C下蒸发。残渣溶于100 μL去离子水，加入900 μL地衣酚溶液。混合物在80°C孵育30分钟，读取OD421以测定鼠李糖脂含量。
【数据】蛋白酶检测：0.3%偶氮酪蛋白、10%三氯乙酸、1 M NaOH、OD440；弹性蛋白酶检测：弹性蛋白-刚果红缓冲液、37°C、3h、OD495；绿脓菌素检测：OD695；鼠李糖脂检测：乙醚萃取、35°C蒸发、80°C孵育30min、OD421
2.3 敏感性测定与生物膜抑制实验
敏感性测定：将铜绿假单胞菌PAO1接种到含递增浓度Pip和EDTA的LB培养基中，混合物在37°C、180 rpm条件下培养24小时，通过测量OD600评估协同抗菌活性。
生物膜抑制实验：将铜绿假单胞菌PAO1在含有Pip和EDTA的胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）培养基中培养。静置过夜后弃去培养基，形成的生物膜依次经过甲醇固定、结晶紫染色和乙醇脱色处理，读取OD570以定量生物膜。
为更直观地观察Pip与EDTA联用对生物膜形成的抑制效果，采用扫描电子显微镜（SEM）和共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察。简要步骤如下：在24孔板中的圆形盖玻片上培养铜绿假单胞菌PAO1生物膜。培养结束后，生物膜依次经过水洗、乙醇梯度脱水和冷冻干燥处理。冻干样品经喷金后，在SEM（Zeiss GeminiSEM 360，Carl Zeiss Microscopy GmbH，耶拿，德国）下观察。CLSM分析中，玻璃片上形成的生物膜先用磷酸盐缓冲液（PBS）洗去浮游细胞，然后用吖啶橙（AO）和溴化乙锭（EB）染色，通过CLSM（Zeiss LSM 700，Carl Zeiss Microscopy GmbH，耶拿，德国）观察。
【数据】敏感性检测：LB培养基、37°C、180 rpm、24h、OD600；生物膜定量：TSB培养基、OD570；SEM：Zeiss GeminiSEM 360；CLSM：Zeiss LSM 700；染色：AO/EB
2.4 Pull-Down实验
铜绿假单胞菌PAO1细胞裂解后离心收集蛋白上清液。蛋白样品分别用生物素和Pip-生物素处理，随后进行酶解生成肽段。真空干燥的肽段用0.1%甲酸水溶液复溶，通过Thermo Scientific EASY-nLC 1000系统（Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国）进行纳流液相色谱分离。质谱仪型号及详细检测条件参照Hu等人的实验方案。
【数据】裂解液复溶：0.1%甲酸水溶液；液相色谱：Thermo Scientific EASY-nLC 1000；质谱条件：参照Hu等（原文未详述）
2.5 转录组分析
采用TRIzol®法提取RNA。通过质量检测的RNA样品使用Illumina HiSeq×TEN仪器（Illumina，Inc.，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国）进行测序。读数比对至铜绿假单胞菌PAO1完整基因组序列，随后进行差异表达基因分析。
【数据】RNA提取：TRIzol®法；测序平台：Illumina HiSeq×TEN；比对参考：铜绿假单胞菌PAO1完整基因组
2.6 C4-HSL产生分析
细菌细胞在含或不含Pip的LB培养基中培养。培养结束后，离心培养液获得无菌上清液，用乙酸乙酯萃取。减压除去溶剂，残渣用甲醇复溶。采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）定量C4-HSL的产生量。
【数据】萃取溶剂：乙酸乙酯；复溶溶剂：甲醇；检测方法：LC-MS/MS
2.7 基因表达验证
RNA提取按照转录组学方案进行。采用RT-qPCR评估调控QS和毒力的关键基因的转录水平（表S1）。以gyrB基因作为内参，对基因表达数据进行归一化处理。
【数据】内参基因：gyrB；检测方法：RT-qPCR
2.8 分子对接分析
RhlI蛋白结构采用目前公认的最高精度预测模型AlphaFold2进行分析。预测结构可在https://www.uniprot.org/uniprotkb/P54291/entry#structure获取（访问日期：2024年9月28日，UniProt登录号：P54291）。使用Discovery Studio软件4.0进行受体和配体制备。所得对接分数用于评估Pip与其受体RhlI之间的结合亲和力。
【数据】结构预测：AlphaFold2；UniProt登录号：P54291；软件：Discovery Studio 4.0
2.9 RhlI蛋白纯化
将PET28a-rhlI转化至BL21（DE3）细胞，在含50 μg/mL卡那霉素的培养基中培养至OD值达到0.3。随后加入1 mM IPTG诱导蛋白表达。培养物在16°C下持续振荡过夜。离心收集菌体，重悬于含0.1 mM苯甲基磺酰氟（PMSF）的50 mM PBS中，在4°C下超声破碎。离心后收集上清液，与Ni-NTA琼脂糖珠混合1小时。用含300 mM咪唑的PBS洗脱蛋白。通过SDS-PAGE验证目标蛋白的存在，以蛋白分子量标准品（Blue Plus Protein Marker，TransGen Biotech，北京，中国）作为参照，随后用微量分光光度法检测蛋白浓度。
【数据】表达菌株：BL21（DE3）；载体：PET28a-rhlI；卡那霉素：50 μg/mL；IPTG：1 mM；诱导温度：16°C；超声：4°C；Ni-NTA结合：1h；洗脱：300 mM咪唑；PBS：50 mM；PMSF：0.1 mM
2.10 结合亲和力测定
等温滴定量热法（ITC）实验在PEAQ-ITC仪器上于25°C下进行，使用50 mM PBS（pH 7.2）。蛋白和Pip的初始浓度分别设定为26 μM和2 mM。
【数据】仪器：PEAQ-ITC；温度：25°C；缓冲液：50 mM PBS（pH 7.2）；蛋白浓度：26 μM；Pip浓度：2 mM
2.11 基因敲除与氨基酸位点突变
基因敲除采用同源重组法，以pK18质粒为载体。以铜绿假单胞菌PAO1基因组DNA为模板，PCR扩增靶基因侧翼区域。产物纯化后用限制性内切酶消化。庆大霉素抗性标记及其启动子从pBBR1MCS-5质粒中PCR扩增获得。所得PCR产物纯化后用限制性内切酶消化。PCR产物与pK18载体经限制酶消化后用T4 DNA连接酶连接。连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞中。随后，转化混合物涂布于含四环素的LB琼脂平板上，37°C过夜孵育，筛选重组克隆。提取质粒并测序验证。
氨基酸位点突变实验中，根据分子对接预测的氨基酸结合位点设计cDNA引物序列。详细步骤原文未详述。
【数据】敲除载体：pK18；抗性标记来源：pBBR1MCS-5（庆大霉素）；筛选：四环素LB琼脂、37°C过夜；连接酶：T4 DNA连接酶
研究结果
3.1 MIC与生长曲线
EDTA和Pip对铜绿假单胞菌PAO1的MIC分别为2 mg/mL和大于2 mg/mL。生长分析显示，50、100和200 μg/mL的Pip处理对细胞生长无抑制效果（图1A）。然而，400 μg/mL的Pip处理表现出显著的生长抑制作用（图1A）。由于真正的群体感应抑制剂（QSI）不应阻碍细菌生长，因此选择50、100和200 μg/mL的亚抑菌浓度来评估其抗毒力活性。
【数据】EDTA的MIC：2 mg/mL；Pip的MIC：>2 mg/mL；无生长抑制浓度：50、100、200 μg/mL；生长抑制浓度：400 μg/mL
3.2 Pip对毒力因子产生的影响
如图1B、C所示，Pip处理后蛋白酶和弹性蛋白酶的活性显著降低。200 μg/mL Pip处理后，蛋白酶残留活性约为47%。与DMSO处理组相比，50至200 μg/mL的Pip处理分别使弹性蛋白酶降低25%、36%和49%。Pip还以剂量依赖方式抑制绿脓菌素的分泌（图1D）。值得注意的是，50、100和200 μg/mL的Pip处理分别使绿脓菌素产量减少43%、71%和81%。Pip对鼠李糖脂产生的影响如图1E所示。Pip处理后，鼠李糖脂水平分别降低36%、42%和56%。
【数据】蛋白酶残留活性（200 μg/mL Pip）：约47%；弹性蛋白酶降低率：25%（50 μg/mL）、36%（100 μg/mL）、49%（200 μg/mL）；绿脓菌素降低率：43%（50 μg/mL）、71%（100 μg/mL）、81%（200 μg/mL）；鼠李糖脂降低率：36%、42%、56%
3.3 Pip与EDTA对生长和生物膜形成的协同抑制
如图2A所示，EDTA对铜绿假单胞菌PAO1的MIC为2 mg/mL。然而，添加Pip后其抗菌活性显著增强。具体而言，在50、100和200 μg/mL Pip存在下，EDTA的MIC分别降至0.5、0.25和0.125 mg/mL。此外，OD值的降低表明，Pip尽管未进一步降低EDTA的MIC，但在低浓度下显著增强了其抗菌效果。
生物膜抑制实验结果显示，50、100和200 μg/mL的Pip处理分别使生物膜形成减少约12%、24%和33%，而单独使用EDTA未显示显著的抑制活性（图2B）。然而，在Pip存在下，EDTA的抑制活性显著增强。当0.25 mg/mL EDTA与50、100和200 μg/mL Pip联合使用时，生物膜形成分别减少43%、61%和73%。将EDTA浓度提高至1 mg/mL，与200 μg/mL Pip联用时生物膜形成抑制率达92%，表明两者具有协同作用。
SEM分析显示，DMSO处理组细胞呈现高度致密的网状结构，嵌入丰富的胞外基质中（图2C(a)）。然而，Pip处理导致生物膜外观分散、完整性被破坏（图2C(b,c)）。尽管EDTA单药在定量上未显示显著的生物膜减少，但所得生物膜呈现多孔、疏松的形态，表面定植明显减少（图2C(d)）。当EDTA与Pip联合处理时，观察到生物膜的大规模降解。特征性的致密蘑菇状结构消失，取而代之的是稀疏的细胞层，膜受损且胞外基质可忽略不计（图2C(e,f)），突显了该化合物组合强大的协同抗生物膜活性。
此外，CLSM观察显示，EDTA和Pip联合给药时表现出类似的生物膜减少表型。Pip处理后，生物膜厚度从13.1±0.46 μm（图2D(a)）降至5.14±1.02 μm（图2D(c)）。此外，EDTA-Pip组合与直接的抗菌渗透和随之而来的大量细胞死亡相关，广泛的红色荧光（对应死细胞）提供了确凿证据（图2D(e,f)）。
【数据】EDTA单用MIC：2 mg/mL；EDTA+50 μg/mL Pip的MIC：0.5 mg/mL；EDTA+100 μg/mL Pip的MIC：0.25 mg/mL；EDTA+200 μg/mL Pip的MIC：0.125 mg/mL；生物膜减少率（Pip单用）：12%、24%、33%；生物膜减少率（0.25 mg/mL EDTA+Pip）：43%、61%、73%；生物膜抑制率（1 mg/mL EDTA+200 μg/mL Pip）：92%；生物膜厚度：13.1±0.46 μm→5.14±1.02 μm
3.4 RhlI被鉴定为Pip的潜在靶蛋白
为阐明Pip降低毒力和增强药效的机制，采用了生物素-pull-down-MS策略（图3B）。化学合成了Pip-生物素（图3A），并通过NMR和MS光谱分析进行表征（图S1）。pull-down实验后经MS分析，共鉴定出1663种可能与Pip-生物素相互作用的蛋白。富集程度最高的前15条KEGG通路主要与吩嗪合成、谷氨酸代谢和能量代谢相关（图3C）。pull-down实验和毒力减弱协同实验的结果均表明，Pip可能结合RhlI（覆盖率=50%，Unique肽段=27）（表S3），因为该蛋白在铜绿假单胞菌的毒力因子产生中起关键作用。
为进一步阐明作用机制并揭示Pip的潜在细胞靶点，进行了转录组分析。结果表明，Pip处理显著重编程了铜绿假单胞菌的基因表达谱（图4A），导致272个基因上调和159个基因下调（图4B）。GO富集分析表明，Pip暴露对抗生素代谢、毒力因子合成和膜转运产生显著影响（图4C）。为对差异表达基因（DEGs）进行功能注释，还进行了KEGG分析以描绘其相关的生物学过程和通路。共431个DEGs成功映射到相应的KEGG通路，显著富集于156个不同类别。筛选出前20条显著富集的KEGG通路以识别关键候选基因，其中多个DEGs被证明参与QS、毒力因子合成和耐药性（图4D）。详细的DEGs及其相应的表达水平变化见表S4。
如表S4所示，Pip处理显著降低了毒力基因lasA、lasB、rhlA、rhlB和phzB2的转录，这些基因分别编码蛋白酶、弹性蛋白酶、鼠李糖脂和绿脓菌素。这种转录抑制与观察到的实际毒力因子产生减少一致，从而证实了Pip的抗毒力活性。鉴于这些基因受QS调控，其表达受抑提示QS系统可能被破坏。这一假设得到rhlI特异性下调的进一步支持，表明Pip可能通过靶向rhlI发挥其抗毒力作用。
【数据】Pull-down鉴定蛋白数：1663种；RhlI覆盖率：50%；Unique肽段：27；上调基因：272个；下调基因：159个；KEGG映射DEGs：431个；富集类别：156个
3.5 基因表达验证与C4-HSL产生分析
为验证转录组数据，选取富集于特定KEGG通路的6个DEGs进行RT-qPCR相对表达定量。结果表明，Pip处理后rhlI、PA1930、rhlB、lasA、phzB2和fabH2的表达显著下调（图4E）。RT-qPCR结果与RNA-seq数据之间观察到高度一致性，证实了转录组测序的可重复性。
此外，由于C4-HSL自诱导物的合成直接受rhlI调控，推测rhlI的转录抑制将导致相应信号分子的缺乏。为验证这一假设，对铜绿假单胞菌分泌的C4-HSL浓度进行了定量。数据显示，Pip处理后C4-HSL合成显著减弱（图4F、G），从而在机制上证实了Pip作为rhlI基因特异性抑制剂的模型。
【数据】验证基因：rhlI、PA1930、rhlB、lasA、phzB2、fabH2（均显著下调）；检测方法：RT-qPCR；C4-HSL定量：LC-MS/MS
3.6 Pip通过直接结合RhlI的LYS-164和ASP-35位点抑制RhlI
进行计算机对接模拟以预测Pip与RhlI之间的潜在相互作用，包括结合亲和力和结合位点。如图5A、B所示，小分子Pip对接至RhlI上结合沟槽的中间位置。结合细节的进一步分析显示，Pip与RhlI的Lys164和Asp35形成氢键相互作用（图5C、D），结合能为−6.13 kcal/mol。
【数据】结合能：−6.13 kcal/mol；结合位点：Lys164、Asp35；相互作用类型：氢键
3.7 rhlI缺失及LYS-164/ASP-35突变对毒力因子和EDTA敏感性的影响
（此部分结果原文节选未完整提供，以下基于可获得的原文信息进行编译）
基因敲除和氨基酸位点突变实验进一步验证了Pip通过结合RhlI的LYS-164和ASP-35位点发挥作用的机制。rhlI缺失及LYS-164/ASP-35突变对蛋白酶（A）、弹性蛋白酶（B）、绿脓菌素（C）和鼠李糖脂（D）的产生以及EDTA敏感性（E）和生物膜抑制（F）的影响如图7所示。
【数据】原文未详述具体数值
3.8 Pip在氧化应激、膜通透性及线虫模型中的评估
Pip在氧化应激（A）、膜通透性（B）、蛋白泄漏（C）、核酸泄漏（D）、对秀丽隐杆线虫的毒性（E）以及对线虫的抗感染效果（F）方面的评估结果如图8所示。
【数据】原文未详述具体数值
讨论与解读
EDTA是一种重要、安全且经济高效的氨基多羧酸，对多种食源性病原菌具有抗菌活性，被广泛用作食品添加剂。然而，EDTA单独使用的抗菌效果相对较弱，主要通过螯合二价阳离子和 destabilizing 革兰氏阴性菌外膜来发挥抗菌增效作用。这一局限性限制了其在食品保藏中的独立应用，迫切需要增强其抗菌活性的策略。胡椒基哌嗪（Pip）是胡椒的主要生物活性成分，具有已证实的抗肿瘤和神经保护特性，但其对食源性铜绿假单胞菌的抗毒力活性及增强EDTA的潜力此前尚未被探索。
本研究表明，Pip通过直接结合RhlI合酶的LYS-164和ASP-35残基，阻断QS信号级联，从而减少毒力因子的产生并在秀丽隐杆线虫模型中减弱致病性。受损的QS系统随后诱导氧化应激，破坏细胞膜完整性和通透性，从而增强EDTA的抗菌作用。Pip作为天然来源的群体感应抑制剂，与传统防腐剂联用有望降低耐药压力并提高食品保藏效果。
编译者解读
本研究巧妙运用"抗毒力而非杀菌"的策略，从天然产物中筛选出可逆转耐药困局的活性分子。方法学上的亮点在于多维度验证闭环——从pull-down钓靶、转录组锁定通路、ITC量化结合，到点突变功能验证，层层递进地确证了Pip与RhlI的直接相互作用。值得肯定的是，研究将群体感应抑制与防腐剂增效两大目标统一于同一分子机制，为食品保鲜提供了"一石二鸟"的方案。不过，Pip在真实食品基质中的效果、长期安全性及法规审批路径仍需进一步验证，从实验室到餐桌尚有距离。
参考来源
Zhou JW, Qiu YX, Wang HY, Chen M, Li JW. Piperonylpiperazine Targets RhlI to Reduce Virulence and Potentiate EDTA Sensitivity in Pseudomonas aeruginosa. Foods. PMID: 42587919.
PMID: 42587919