来源：abCRISPR: deep learning-based design of abasic gRNA sequences for specific CRISPR-Cas9 genome editing.（Bioinformatics）| 编译：DNA Lab Space
导读
CRISPR-Cas9虽已成为主流基因组编辑工具，但其脱靶切割问题始终是临床转化的关键障碍。近期发展的无碱基gRNA（ØXØ）可提升靶向特异性，但效果受序列位置背景影响。本研究提出abCRISPR——一种基于深度神经网络（DNN）的框架，通过配对训练无碱基与未修饰gRNA数据集，实现对脱靶活性的精准预测（r ≥ 0.95）。在人类基因组规模应用中，abCRISPR设计了覆盖58,875,004个CRISPR可靶向位点的ØXØ序列，显著提升靶向特异性。
研究背景
CRISPR-Cas9系统通过设计gRNA中与靶位点互补的20核苷酸间隔序列，可编程切割任意DNA序列。然而，gRNA与基因组序列的部分碱基配对可导致多达6个错配（≤6MM）的脱靶切割，这是该技术面临的核心安全问题。近期研究发现，化脓性链球菌在噬菌体感染期间，CRISPR RNA的自然无碱基氧化可降低脱靶活性。受此启发，研究者开发了无碱基修饰gRNA（ØXØ）——将gRNA第18、19位（相对PAM位置）替换为dSpacer（缺乏1′羟基的无碱基脱氧核苷酸），并延伸至第22位。作为一种仿生策略，ØXØ在增强靶向特异性方面优于其他gRNA修饰和Cas9变体等人工策略。然而，ØXØ的效果因位置序列背景而异，缺乏系统性设计方法。
研究方法
本研究开发了abCRISPR框架，用于理性设计具有最小脱靶活性的ØXØ序列。abCRISPR利用信息丰富的少样本学习策略，基于配对的无碱基与未修饰gRNA数据集进行训练。训练数据来源于高质量的随机错配靶标文库，该文库通过汇集20条不同的"掺杂"合成DNA生成（图1B），并在体外CRISPR-Cas9切割实验中对错配脱靶底物（n = 97,583）进行穷尽测序（图1C）。训练集量化了ØXØ gRNA与未修饰gRNA对脱靶序列的耗竭程度，以底物丰度（SA；相对于无gRNA对照的log2比值）作为衡量指标。
abCRISPR模型采用基于多层感知器（MLP）的多任务回归架构，包含三个隐藏层。模型输入特征考虑20-nt间隔序列的二核苷酸背景（2-nt；n = 4 × 4 × 20）、四个碱基（4-base；n = 4 × 20）以及匹配/错配布尔值（mismatch；n = 2 × 20）。模型训练使用gRNA与脱靶序列，编码时考虑20-nt间隔序列内的转换/颠换错配类型，并以SA值作为训练标签（70%用于训练，20%用于验证，10%用于测试；共进行10次迭代）。
【数据】训练集：n = 97,583；特征维度：2-nt（n = 4 × 4 × 20）、4-base（n = 4 × 20）、mismatch（n = 2 × 20）；数据划分：70%训练/20%验证/10%测试；迭代次数：10
在模型评估方面，研究采用10折交叉验证，计算预测与实验SA值之间的Pearson相关系数。同时，研究使用Spearman相关系数评估预测排序一致性，并通过受试者工作特征（ROC）曲线分析比较不同模型的脱靶预测性能，脱靶定义采用SA阈值−2.17（由CRISPR-Cas9实验中切割比率为0.5时的线性回归推导）。此外，研究还进行了留一gRNA（LOO）评估以检验模型泛化能力——由于T2和EMX1分别代表最低和最高SA值分布，且两者重叠覆盖T3的SA值范围，因此使用T2和EMX1作为训练集、T3作为测试集。最终部署的abCRISPR模型通过顺序增量训练获得，并使用CIRCLE-seq实验获得的脱靶序列（≤6MM）进行独立评估，SA阈值通过10折交叉验证优化为−2.16（最大化F1分数）。
【数据】脱靶阈值：SA = −2.17；优化阈值：SA = −2.16；LOO评估：T2 + EMX1训练，T3测试
将最终部署的abCRISPR模型应用于人类基因组（hg19），研究首先使用CRISPOR程序筛选高效CRISPR可靶向位点（效率 > 55，特异性 > 50；n = 61,761,658），随后预测这些gRNA的推定脱靶序列（≤3MM；n = 747,063,488）的SA值，并比较ØXØ gRNA与未修饰gRNA的脱靶活性差异。统计分析采用配对单侧t检验（以每条gRNA为阈值，P < .05），并确认对多重检验校正的稳健性。
【数据】基因组：hg19；gRNA筛选阈值：效率 > 55，特异性 > 50；候选gRNA：n = 61,761,658；推定脱靶位点：n = 747,063,488（≤3MM）；统计检验：配对单侧t检验，P < .05
研究结果
在10折交叉验证中，abCRISPR准确预测了无碱基（ØXØ）和未修饰gRNA脱靶位点的SA值，预测分布与观测分布紧密匹配（图1E），与实验数据高度相关（Pearson相关系数；r = 0.95–0.96）。由于abCRISPR同样预测未修饰gRNA的脱靶活性，研究者将其相关性值（Spearman相关系数；r = 0.95）与其他深度学习方法进行对比，这些方法表现出明显不同的预测模式（图1F）。结果显示，abCRISPR优于CRISPR-Net、DeepCRISPR、CRISPR-DIPOFF、CNN_std和CrisprDNT（Spearman相关系数分别为r = 0.34、0.17、−0.01、−0.02和−0.13）。
【数据】Pearson r = 0.95–0.96；Spearman r = 0.95（abCRISPR）；对比方法r = 0.34、0.17、−0.01、−0.02、−0.13
在ROC曲线分析中（脱靶定义为SA阈值−2.17），abCRISPR的AUC值（0.98）显著超越其他预测方法（AUC = 0.45–0.68；图1G）。为提供无阈值比较，研究还评估了测试集中前k个实验验证脱靶位点（按SA值排序）的召回率，abCRISPR在所有k值下均表现出最高召回率（最高前90%；0.52–0.97对0.01–0.89），优于所有对比方法。
【数据】AUC：0.98（abCRISPR）对0.45–0.68（其他方法）；召回率：0.52–0.97对0.01–0.89
在留一gRNA（LOO）评估中，abCRISPR展现优于其他方法的性能（AUC = 0.78对0.53–0.72），表明其学习模型即使在有限数量的gRNA序列训练条件下，只要提供穷尽错配序列，仍具备良好的泛化能力。
【数据】LOO评估AUC：0.78（abCRISPR）对0.53–0.72（其他方法）
独立于训练集，研究使用CIRCLE-seq实验获得的脱靶序列（≤6MM）评估最终部署的abCRISPR模型。在按读段数排序的预测脱靶累积比率分析中（图1H），abCRISPR在每个排序位置均稳健优于其他深度学习方法（开发者使用阈值：0.5），尽管这些方法部分使用了该测试集进行训练。abCRISPR持续保持高阳性预测值（abCRISPR、CNN_std、CRISPR-DIPOFF、DeepCRISPR、CRISPR-Net和CrisprDNT的平均比率：0.63、0.42、0.26、0.21、0.02和0.00；总比率：0.53、0.28、0.14、0.12、0.00和0.00）。使用与SITE-Seq重叠的高置信度CIRCLE-seq数据（图1I）时，abCRISPR表现一致（平均比率：0.60、0.27、0.22、0.19、0.02和0.02；总比率：0.49、0.13、0.12、0.14、0.01和0.01），表明其优越的准确性和敏感性。仅在高排名区间（3%–5%），CNN_std的阳性预测值与abCRISPR相当。
【数据】CIRCLE-seq评估平均比率：0.63（abCRISPR）对0.42、0.26、0.21、0.02、0.00；总比率：0.53对0.28、0.14、0.12、0.00、0.00；SITE-Seq重叠集平均比率：0.60对0.27、0.22、0.19、0.02、0.02
值得注意的是，尽管abCRISPR仅使用≤3MM序列训练，但对包含>3MM（4–6MM）脱靶的CIRCLE-seq数据集表现出泛化预测能力。当分别评估1–3MM和4–6MM的零样本推断时，abCRISPR展现优越性能，尤其在仅含零样本情况（4–6MM）下，跨不同排名阈值均表现突出。
【数据】训练错配范围：≤3MM；零样本推断范围：4–6MM
最后，研究将最终部署的abCRISPR模型应用于人类基因组中高效CRISPR可靶向位点集合（效率 > 55，特异性 > 50；61,761,658条gRNA；图1J），这些位点最初通过CRISPOR程序筛选。然而，这些gRNA序列中99.1%（n = 61,181,580）平均每条含有约12个基因组范围内的脱靶位点（≤3MM；n = 747,063,488）。abCRISPR预测，在96.2%的案例中，无碱基gRNA的脱靶位点SA值显著增加（n = 58,875,004；图1K），该结果基于与相应未修饰gRNA的脱靶活性比较（P < .05，配对单侧t检验，每条gRNA为阈值，并确认对多重检验校正的稳健性），表现为SA值差异增加（ΔSA，相对于未修饰gRNA；图1L）。其中，研究者实验验证了靶向VEGFA的两个无碱基gRNA（ØXØ）在4个脱靶位点的切割减少（体外CRISPR-Cas9切割实验）。需要指出的是，无碱基gRNA预测的验证具有支持性，但实验上（n = 2）和计算上（仅对未修饰gRNA评估）均有限。尽管这些结果可作为原理验证，但用户应注意，这些证据尚不足以支持泛化和大规模应用，尤其对于这些非常广泛的基因组规模声明。总体而言，abCRISPR提供了全面的 bona fide 无碱基gRNA（ØXØ）序列数据集，预测其可增强编辑人类基因组的靶向特异性（n = 58,875,004）。
【数据】人类基因组应用：61,761,658条gRNA；含脱靶gRNA比例：99.1%（n = 61,181,580）；平均脱靶位点数：~12个/gRNA；SA显著增加比例：96.2%（n = 58,875,004）；实验验证：2个ØXØ gRNA、4个脱靶位点
讨论与解读
abCRISPR通过配对训练无碱基与未修饰gRNA数据集，利用穷尽错配序列库（n = 97,583）提供稳健的ground-truth负样本，实现了高精度脱靶预测（r ≥ 0.95，AUC = 0.98）。与其他深度学习方法相比，abCRISPR在Spearman相关性（r = 0.95对−0.13至0.34）、AUC（0.98对0.45–0.68）和召回率等指标上全面领先。其核心优势在于：训练数据覆盖穷尽错配序列空间，避免了基因组范围内检测限导致的假阴性问题。此外，abCRISPR从≤3MM训练数据泛化至4–6MM脱靶预测的能力，展现了模型对序列特征的深层学习能力。人类基因组规模应用表明，96.2%的ØXØ设计可显著提升靶向特异性，为安全精准的CRISPR-Cas9编辑提供了系统化设计资源。
编译者解读：abCRISPR的独特价值在于将仿生修饰（无碱基gRNA）与深度学习预测相结合，从"修饰策略"跃升为"理性设计平台"。其少样本学习策略——用有限gRNA序列配合穷尽错配序列训练——为合成生物学中数据稀缺场景提供了方法论借鉴。但需注意，实验验证规模有限（n = 2 gRNA），且预测主要基于未修饰gRNA的评估框架，ØXØ的体内广谱适用性仍需更多验证。从应用角度看，该平台可直接嵌入现有gRNA设计流程，为基因治疗和细胞工程中的脱靶管控提供实用工具。
参考来源
Kim GD, Gu D, Park M, Chi SW. abCRISPR: deep learning-based design of abasic gRNA sequences for specific CRISPR-Cas9 genome editing. Bioinformatics. PMID: 42525385. DOI: 10.1093/bioinformatics/btaf159.
PMID: 42525385