来源：Genomic and Functional Characterization of the Calcite-Precipitating Bacterium Bacillus paralicheniformis ITBMC36: A Promising Agent for Self-Healing Concrete.（Microorganisms）| 编译：DNA Lab Space
导读
混凝土开裂是结构劣化的主要诱因。微生物诱导方解石沉淀（MICP）为裂缝修复提供了绿色方案。本研究从越南石灰岩环境分离到一株高效产碳酸钙菌株ITBMC36，其沉淀产量达26.73 g/L，脲酶活性35.71 U/mL。通过Nanopore+Illumina混合测序获得完整环状基因组（4.41 Mb），结合矿物学表征与砂浆裂缝修复实验，证实该菌株为Bacillus paralicheniformis，具备显著的自修复混凝土应用潜力。
研究背景
混凝土是应用最广的建筑材料，但天然易开裂。 shrinkage、热应力、机械荷载和环境波动都会导致裂缝产生。即使微小裂缝也会让水和氯离子、硫酸根等侵蚀性离子渗入，加速钢筋锈蚀和化学劣化。传统修复方法——环氧注浆或人工修补——成本高、劳动密集且效果短暂，促使研究者寻求更可持续的修复策略。
微生物诱导方解石沉淀（MICP）是其中颇具前景的途径。细菌通过代谢活动促进碳酸钙形成，在水泥基材料中可封堵裂缝、降低渗透性。脲解是最受关注的MICP机制之一：细菌脲酶水解尿素产生氨和二氧化碳，氨提升局部pH，使碳酸盐平衡向CO₃²⁻移动，与Ca²⁺结合沉淀。此外，碳酸酐酶（CA）催化代谢CO₂水合为HCO₃⁻，胞外多糖（EPS）形成生物被膜基质，可为方解石晶体提供成核位点。本研究从越南石灰岩采石场分离到一株高效产碳酸钙菌株ITBMC36，对其进行了系统的表型、矿物学、基因组学表征及砂浆裂缝修复效果评估。
研究方法
2.1 碳酸钙诱导菌株的分离
采集自越南广宁省石灰岩采石场（GPS坐标：20°58′05.4″ N 107°10′38.8″ E）的骨料样本运送至实验室，用于分离产矿物微生物。采用改良B4琼脂（酵母提取物4 g/L；葡萄糖5 g/L；醋酸钙2.5 g/L；琼脂15 g/L）进行初筛。单菌落转接至B4肉汤中培养，筛选沉淀活性；在肉汤中观察到可见晶体形成即视为具有生物矿化能力。
矿物沉淀物经Whatman No.1滤纸过滤收集，60°C干燥至恒重，研磨成粉末。通过盐酸（HCl）溶解/冒泡反应验证碳酸钙生成。Sporosarcina pasteurii DSM33购自德国DSMZ微生物与细胞培养物保藏中心（Braunschweig, Germany），在指定实验中用作参考菌株。
2.2 酶活性测定
2.2.1 粗酶提取物制备
菌株在50 mL营养肉汤（牛肉提取物1 g/L；酵母提取物2 g/L；蛋白胨5 g/L；氯化钠5 g/L）中培养至OD₆₀₀ = 1。离心收集菌体（6000 rpm，4°C，10 min），用50 mM HEPES缓冲液（pH 7.5）洗涤两次。冰浴超声破碎细胞（3次脉冲，每次30 s）。裂解液离心（6000 rpm，4°C，10 min）澄清，收集上清液作为粗酶提取物。
2.2.2 脲酶活性测定（酚-次氯酸盐法）
采用酚-次氯酸盐法测定脲酶活性。反应体系含500 µL粗酶提取物和500 µL脲酶缓冲液（50 mM HEPES，25 mM尿素），37°C孵育20 min。加入1.5 mL溶液A（苯酚10 g/L；硝普钠50 mg/L）和1.5 mL溶液B（NaOH 5 mg/mL；NaClO 0.044%）终止反应。混匀后37°C孵育30 min，用酶标仪测定620 nm处吸光度。以氯化铵（NH₄Cl）标准溶液（10 µM至1 mM）生成标准曲线定量铵产量。脲酶活性定义为测定条件下每分钟产生的µmol NH₄⁺。
2.2.3 碳酸酐酶活性测定
粗酶提取物中碳酸酐酶（CA）活性使用碳酸酐酶活性测定试剂盒（Abcam, Cambridge, UK）按制造商说明书测定。同时制备硝基苯酚标准曲线（8–40 nM）。CA活性表示为每分钟释放的nmol硝基苯酚。
2.3 形态学表征与生化试验
候选产CaCO₃菌株划线接种于营养琼脂（牛肉提取物1 g/L；酵母提取物2 g/L；蛋白胨5 g/L；氯化钠5 g/L；琼脂15 g/L）。培养后记录菌落形态，包括大小、形状、颜色和质地。细胞形态通过光学显微镜下革兰氏染色和芽孢染色观察。培养中形成的矿物沉淀物使用扫描电子显微镜（SEM）检查。
代谢和生化特性使用API 50 CH和20 E试纸条及CH B/E培养基（bioMérieux）评估，按制造商说明操作。接种试纸条37°C孵育48 h，根据推荐的颜色判读标准记录阳性/阴性反应。
2.4 基因组DNA提取、测序与组装
使用EZ-10 Spin Column Soil DNA Miniprep Kit（BioBasic, Markham, ON, Canada）从ITBMC36纯培养物中提取基因组DNA。DNA浓度和纯度用NanoDrop分光光度计（Thermo Scientific, Waltham, MA, USA）评估，完整性通过琼脂糖凝胶电泳检查。建库前使用dsDNA BR Qubit检测试剂盒（Q32850, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）进一步定量DNA浓度。
采用双平台测序策略。短读长测序（2 × 150 bp双端）由KTest Science Co., Ltd.（越南胡志明市）在Illumina平台上完成。长读长测序使用Oxford Nanopore Technologies（ONT）MinION设备配R9.4.1流动池（FLO-MIN106, ONT, Oxford, UK）在实验室内部进行。ONT测序前，2 µg提取DNA用AMPure XP磁珠（A63880, Beckman Coulter, Brea, CA, USA）纯化。使用NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing模块（E7546, New England Biolabs, Ipswich, MA, USA）和Ligation Sequencing Kit SQK-LSK109（ONT, Oxford, UK）从1 µg纯化DNA制备文库。
Illumina读长用FastQC（https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/，访问日期2024年6月14日）进行质量检查，使用Trimmomatic v.0.39去除低质量碱基和接头序列。原始ONT数据（FAST5格式）用Guppy v.3.1.5高精度模式进行碱基识别。ONT FASTQ读长用NanoFilt v.3.8.0过滤，去除长度<1000 bp和平均Q值<7的读长。过滤后的Illumina和ONT长读长使用Unicycler v0.5.1进行混合组装。组装完整性和污染用CheckM2评估，核心基因含量用BUSCO v5配合Bacillales_odb10数据库评估。
2.5 分类与系统发育分析
基于全基因组的分类学分析：使用Type (Strain) Genome Server（TYGS）进行Genome Blast Distance Phylogeny（GBDP）分析。为确认物种界定，分别使用JspeciesWS在线服务器和Genome to Genome Distance Calculator（GGDC）计算ITBMC36与其近缘菌株之间的平均核苷酸一致性（ANI）和数字DNA-DNA杂交（dDDH）值。
2.6 基因组注释
完整基因组首先使用原核基因组注释管道（PGAP；v6.7）注释用于GenBank提交。功能注释进一步使用Bakta v1.11.3、Rapid Annotation Using Subsystem Technology（RASTtk）服务器（https://rast.theseed.org，访问日期2025年12月15日）和eggNOG-mapper v2进行Clusters of Orthologous Groups（COG）功能分类。最终环状基因组图谱用GenoVi v0.4.3可视化。
本研究报告的所有基因标识符对应Bakta注释（如GMDLPC_000123），并一致用于基因定位、操纵子分析和功能解读。基因名称和功能描述使用eggNOG-mapper v2基于直系同源的注释进行交叉验证。EggNOG和Bakta注释以位点标签为唯一标识符进行解析和合并。
2.7 功能基因挖掘与比较分析
对注释基因组进行人工挖掘，寻找与MICP和水泥环境适应性相关的基因。基于关键词搜索鉴定编码脲酶、尿素转运蛋白、碳酸酐酶、EPS生物合成蛋白、芽孢形成因子、离子转运蛋白和应激反应基因。选定的MICP相关蛋白序列进一步用InterProScan检查保守结构域和蛋白家族，为关键酶和转运蛋白功能提供结构域水平验证。为验证脲酶操纵子和所有候选CA的注释，提取预测蛋白序列并用BLASTp搜索UniProtKB/Swiss-Prot数据库。次级代谢产物谱使用antiSMASH v8.0松弛检测模式和BAGEL4（http://bagel4.molgenrug.nl/，访问日期2025年11月16日）评估。
为鉴定ITBMC36特异性基因，使用8个公开可用的B. paralicheniformis基因组进行了泛基因组分析。
研究结果
3.1 产方解石菌株ITBMC36的分离与初步表征
从石灰岩样本中分离的细菌菌株中，ITBMC36在B4培养基中表现出最强的生物矿化能力（图1）。该菌株产生26.73 ± 0.81 g/L矿物沉淀物。回收材料经HCl处理后剧烈冒泡，确认存在碳酸盐矿物（CaCO₃）。
相同条件下比较，参考菌株Sporosarcina pasteurii DSM33产生22.60 ± 0.81 g/L沉淀物（图1A）。随后使用粗酶提取物测定脲酶和碳酸酐酶活性。ITBMC36与DSM33的碳酸酐酶活性无显著差异，而ITBMC36的脲酶活性（35.71 ± 1.24 U/mL）高于DSM33（28.27 ± 1.57 U/mL）（图1B,C）。综合结果表明，ITBMC36具有强脲解活性和高矿物沉淀能力。
营养琼脂上，ITBMC36菌落呈不透明白色、湿润、圆形，边缘不规则，中央环状隆起（图2A,B）。培养24 h后，平均菌落直径为1.51 ± 0.19 mm。B4肉汤中生长的细胞SEM分析显示杆状细菌，大小约4.5 ± 0.3 × 0.5 ± 0.1 µm（图2C,D）。细胞沉淀周围观察到矿物晶体，表明细菌生长与碳酸钙形成之间存在活跃关联。革兰氏染色显示该菌株为革兰氏阳性，芽孢染色证实其具有形成内生孢子的能力。
【数据】沉淀产量：26.73 ± 0.81 g/L（ITBMC36）；22.60 ± 0.81 g/L（DSM33）；脲酶活性：35.71 ± 1.24 U/mL（ITBMC36）；28.27 ± 1.57 U/mL（DSM33）；菌落直径：1.51 ± 0.19 mm；细胞尺寸：4.5 ± 0.3 × 0.5 ± 0.1 µm
3.2 矿物表征与裂缝密封性能
#### 3.2.1 培养中的矿物沉淀
ITBMC36在B4肉汤中产生的矿物沉淀物通过SEM-EDS和XRD表征。EDS分析显示碳、氧、钙是沉淀物中的主要元素，原子百分比分别为20.00%、64.82%和15.18%，对应重量百分比为12.74%、55.00%和32.26%。该组成与富含碳酸钙的生物矿物一致（图3A–C）。
XRD分析显示沉淀物含有多种碳酸钙多晶型物（图3D）。通过与参考衍射图谱比对（文石：RRUFF-R040078；方解石：RRUFF-R050009；球霰石：AMCSD-0019869），检测到对应方解石、球霰石和文石的峰。方解石是主要结晶相，方解石（104）面的强反射以及归属于（102）、（110）、（113）、（202）、（118）和（116）面的附加峰证实了这一点。同时存在对应球霰石和文石的次要峰。这些结果表明ITBMC36主要产生方解石，伴有少量其他CaCO₃多晶型物。
【数据】EDS原子百分比：C 20.00%，O 64.82%，Ca 15.18%；重量百分比：C 12.74%，O 55.00%，Ca 32.26%；主要晶相：方解石（104）面强反射，次要相：球霰石、文石
#### 3.2.2 砂浆试件中的裂缝密封活性
使用含平均宽度0.5 ± 0.1 mm人工微裂缝的砂浆试件评估ITBMC36的裂缝密封性能。ITBMC36处理的试件中，第7天观察到可见矿物沉积，第25天裂缝基本密封，第35天观察到完全闭合（图4A）。相比之下，无菌培养基处理的对照试件在相同时间内未显示可见裂缝密封。这些观察表明细菌处理与裂缝逐步填充相关。
吸水率测量进一步支持了ITBMC36的裂缝密封效果（图4B）。未处理开裂试件在整个实验期间吸水率最高，与开放裂缝的快速水渗透一致。未开裂试件吸水率呈中等且稳定的上升，反映了完整砂浆的固有孔隙结构。相比之下，ITBMC36处理的试件在早期浸泡阶段（3–12 h）吸水率降低，表明裂缝填充限制了初始水进入。在后期时间点（24–48 h），处理试件的吸水量增加并接近未开裂试件，此时水泥基质趋于饱和。
体视显微镜确认了裂缝内矿物随时间的逐步积累（图4C）。光学图像显示裂缝间隙逐渐变窄并最终填充，而深度映射图像显示深蓝色区域显著减少，与裂缝深度减小一致。综合成像和吸水率数据表明，ITBMC36在砂浆模型中促进了有效的裂缝闭合。
从处理裂缝中回收的矿物沉积物进一步通过EDS和XRD分析。EDS确认钙、碳、氧是主要元素，与富含CaCO₃的物质一致（图5A）。还检测到少量硅（Si：4.99 wt%，3.39 at%）、铝（Al：1.58 wt%，1.12 at%）、镁（Mg：0.89 wt%，0.70 at%）和钾（K：0.85 wt%，0.41 at%），可能反映了来自砂和水泥组分的混入（图5A）。XRD分析显示方解石是主要结晶相，伴有少量文石、球霰石和石英（图5B）。这些结果证实ITBMC36处理导致裂缝环境中沉积了以方解石为主的CaCO₃。
【数据】裂缝宽度：0.5 ± 0.1 mm；密封时间：第7天可见沉积，第25天基本密封，第35天完全闭合；EDS：Ca、C、O为主，Si 4.99 wt%，Al 1.58 wt%，Mg 0.89 wt%，K 0.85 wt%；XRD主要晶相：方解石，次要：文石、球霰石、石英
3.3 ITBMC36的代谢与生化特性
生化谱分析显示ITBMC36具有广泛的代谢能力（表1）。该菌株利用多种碳水化合物，包括甘油、L-阿拉伯糖、核糖、D-木糖、半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、甘露醇、山梨醇、甲基-D-葡萄糖苷、苦杏仁苷、熊果苷、七叶灵、水杨苷、纤维二糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、淀粉、糖原、松二糖和塔格糖。ONPG、精氨酸双水解酶、Voges–Proskauer反应、明胶酶、硝酸盐还原酶、过氧化氢酶和氧化酶均为阳性。特别是脲酶阳性反应与基于脲解的碳酸钙沉淀机制一致。总体而言，这些结果表明ITBMC36代谢多样，携带多种与生物矿化相关的表型特征。
【数据】碳水化合物利用：24种阳性；酶学：脲酶阳性、ONPG阳性、精氨酸双水解酶阳性、明胶酶阳性、硝酸盐还原酶阳性、过氧化氢酶阳性、氧化酶阳性
3.4 基因组组装与物种鉴定
为将菌株ITBMC36置于可靠的分类学背景中，并为解释上述生物矿化和裂缝密封表型提供基因组资源，我们使用Oxford Nanopore和Illumina平台进行了混合全基因组测序。测序产生7.5 Gb长读长和6.3 Gb双端短读长（2 × 150 bp）。Unicycler混合组装产生一个单一环状染色体，大小为4,410,549 bp，GC含量45.8%（表2；图6A）。组装质量高，CheckM2评估完整性100%、污染率0.22%，BUSCO恢复99.3%的预期单拷贝直系同源基因。这些指标表明基因组组装适用于详细的后续分析。
表型与生化特征初步支持将ITBMC36归入芽孢杆菌属。使用TYGS和GBDP的全基因组分析进一步将该菌株置于Bacillus paralicheniformis分支内（图6B）。成对基因组相关性数值支持这一分类：ITBMC36与B. paralicheniformis模式菌株KJ-16之间的ANI为98.2%，dDDH为85.5%（图6C）。基于这些多相分类数据，该分离株被鉴定为Bacillus paralicheniformis ITBMC36。
【数据】基因组大小：4,410,549 bp；GC含量：45.8%；长读长：7.5 Gb；短读长：6.3 Gb；完整性：100%；污染：0.22%；BUSCO：99.3%；ANI：98.2%；dDDH：85.5%
3.5 ITBMC36生物矿化相关功能的基因组基础
#### 3.5.1 ITBMC36基因组功能概览
基因组注释鉴定出4647个蛋白质编码序列、81个tRNA基因和24个rRNA基因（表S1）。基于COG的功能分类显示，最大的类别是转录（K；374个基因）、氨基酸转运与代谢（E；369个基因）和碳水化合物转运与代谢（G；286个基因）（图7A）。能量产生与转换（C；219个基因）以及无机离子转运与代谢（P；211个基因）相关基因也有充分代表。
【数据】CDS：4647个；tRNA：81个；rRNA：24个；COG最大类别：转录374个基因，氨基酸转运与代谢369个基因，碳水化合物转运与代谢286个基因
#### 3.5.2 MICP相关基因模块
基因组挖掘揭示了多个与MICP和水泥环境适应性相关的功能模块（图7B）。尿素摄取与脲酶基因簇包含完整的尿素转运系统和脲酶操纵子（图8）。该基因簇编码尿素结合蛋白、尿素转运通透酶和脲酶结构亚基（UreA、UreB、UreC）及辅助蛋白（UreD、UreE、UreF、UreG），构成完整的脲解通路。
基因组中鉴定出5个推定的碳酸酐酶基因（图9）。这些基因分布在染色体不同位置，部分位于正链（+），部分位于负链（−），编码不同类别的碳酸酐酶。
EPS生物合成/输出基因簇编码胞外多糖合成与转运相关蛋白（图10）。生物被膜基质操纵子包含sinI–sinR调控模块，位于 tasA–sipW–tapA 操纵子上游，后者编码淀粉样纤维基质蛋白TasA、信号肽酶SipW和锚定蛋白TapA（图11）。
γ-PGA生物合成位点编码聚谷氨酸合成相关蛋白（图12）。此外，基因组还包含多个与应激反应、pH稳态和芽孢形成相关的基因，这些特征有助于菌株在水泥基环境中存活。
【数据】脲酶基因簇：完整尿素转运+脲酶操纵子（UreA/B/C结构亚基+D/E/F/G辅助蛋白）；CA基因：5个推定基因；EPS基因簇：存在；生物被膜操纵子：sinI-sinR + tasA-sipW-tapA；γ-PGA位点：存在
讨论与解读
本研究对Bacillus paralicheniformis ITBMC36进行了表型、矿物学和基因组水平的系统表征。该菌株在B4培养基中产生26.73 ± 0.81 g/L沉淀物，高于已报道的多种产方解石菌株。此前菲律宾棉兰老岛的一项研究报道了多种产方解石细菌，其中B. paralicheniformis菌株产量约10.5 g CaCO₃/L，其他分离株范围为——原文未详述具体数值。ITBMC36的产量优势可能与其高脲酶活性（35.71 ± 1.24 U/mL）相关。
基因组分析揭示了完整的脲解通路、5个碳酸酐酶基因、EPS和生物被膜相关位点以及多种应激响应基因，为MICP表型提供了遗传基础。砂浆裂缝修复实验证实，该菌株能在35天内实现0.5 mm裂缝的近完全闭合，吸水率数据进一步支持了裂缝密封效果。
【编译者解读】该研究的亮点在于将"菌株筛选—矿物表征—应用验证—基因组解析"四个环节闭环整合，为MICP菌株开发提供了完整范式。选择B. paralicheniformis而非传统模式菌株，拓展了MICP研究的物种多样性。基因组资源为后续定向改造（如增强脲酶表达或EPS产量）奠定了数据基础。值得关注的是，该菌株分离自石灰岩环境，体现了"本地菌株适配本地应用"的策略价值。局限在于目前仍处于砂浆试件尺度，距实际工程应用尚有距离——如何在大体积混凝土中均匀引入菌株并维持活性，仍是该技术商业化的核心挑战。
参考来源
Nguyen DH, Luc TM, Le LQ, Tran KT, Tran NTM. Genomic and Functional Characterization of the Calcite-Precipitating Bacterium Bacillus paralicheniformis ITBMC36: A Promising Agent for Self-Healing Concrete. Microorganisms. PMID: 42513943.
PMID: 42513943