来源：Low initial metabolite production enhances stability in syntrophic bacterial consortia.（Commun Biol）| 编译：DNA Lab Space
导读
互养共生关系在微生物群落中广泛存在，但其稳定性决定因素尚不明确。本研究以赖氨酸和精氨酸营养缺陷型大肠杆菌组成的合成菌群为模型，发现初始代谢物产量较低的菌株反而更能维持互养群落的稳定。高产量菌株虽在短期内促进生长，却因产生"剩余资源"而招致非生产者的剥削，最终导致群落灭绝。这一发现为合成微生物群落的理性设计提供了重要参考。
研究背景
稳定性是生态群落的定义性特征，决定了群落能否在环境变化和进化压力下持续存在。生态稳定性描述群落受扰动后能否维持其组成与功能，进化稳定性则关注物种内及物种间的性状能否在长期选择压力下被维持。互养相互作用通过代谢物交换在自然和工程微生物群落中广泛存在，能够扩展菌株的代谢能力、改善营养限制条件下的资源利用，并缓冲群落对环境变异的响应。营养缺陷型是互养相互作用产生的常见途径——生物体丧失生物合成能力后依赖邻近细胞产生的代谢物生存。比较基因组学研究表明，氨基酸营养缺陷型在细菌谱系中频繁出现，生物合成基因的丢失在降低生物合成成本时可能受到选择青睐。然而，决定互养群落稳定性的关键因素仍不清楚。
研究方法
实验菌株与培养条件
所有实验使用大肠杆菌 MG1655 赖氨酸和精氨酸营养缺陷型（ΔlysA 和 ΔargH），通过 CRISPR-Cas9 介导的 lysA 和 argH 基因敲除获得。菌株使用质粒携带的荧光标记（GFP/mCherry）进行区分。此前研究发现，在本实验条件下荧光质粒对生长的影响可忽略不计。双营养缺陷型（ΔlysAΔargH）通过在 ΔlysA 背景中利用相同的 CRISPR-Cas9 方案敲除 argH 构建。除非另有说明，所有营养缺陷型菌株均在 M9 基本培养基中培养，培养基成分为：6.8 g/L Na₂HPO₄、3 g/L KH₂PO₄、1 g/L NH₄Cl、0.5 g/L NaCl、2 mM MgSO₄·7H₂O、0.5 mM 盐酸硫胺素、0.0025 g/L FeSO₄·7H₂O 和 0.5%（w/v）葡萄糖。培养条件为 37°C、220 rpm 振荡，使用 12 mL 无菌培养管（生工生物）盛装 5 mL M9 培养基。培养基中添加卡那霉素（50 µg/mL，生工生物）以维持荧光质粒。种群密度通过酶标仪（Biotek Synergy Neo2，美国佛蒙特州）在 600 nm 波长处读取光密度值（OD600）评估，或通过在补充赖氨酸或精氨酸（150 µM）的选择性 M9 琼脂平板上计算每毫升菌落形成单位（CFU/ml）确定。CFU 测定时，培养物在无菌 M9 培养基中连续稀释，每个稀释度取 100 μL 接种于三个独立的 M9 琼脂平板。选取含 30-300 个菌落的平板进行 CFU 计数。
【数据】菌株：E. coli MG1655 ΔlysA、ΔargH、ΔlysAΔargH；培养基：M9 基本培养基；温度：37°C；转速：220 rpm；卡那霉素：50 µg/mL；氨基酸补充：150 µM；OD600 检测
营养缺陷型代谢灵活性测定
为评估工程菌株的代谢灵活性和营养缺陷补偿能力，实施了灵活营养补充测定方案。具体而言，评估营养缺陷型菌株能否通过代谢网络中的替代氨基酸补偿缺失代谢物。对每种营养缺陷型菌株，在四种条件下评估生长：（i）补充目标氨基酸（M9 培养基中 300 μM 赖氨酸或精氨酸；阳性对照）；（ii）不补充氨基酸（阴性对照）；（iii）分别补充其他 19 种蛋白氨基酸各 300 μM（排除目标氨基酸），以探究可能转化为缺失代谢物的生化途径；及（iv）同时补充目标氨基酸（300 μM 赖氨酸或精氨酸）和其他全部 19 种氨基酸（各 300 μM）。每种条件下，从每种营养缺陷型菌株（ΔlysA 和 ΔargH）各取 8 个独立菌落（n = 8）进行测试。预培养通过将单个菌落接种到 M9 培养基中，在 37°C、220 rpm 振荡条件下过夜培养。随后将培养物稀释到 5 mL 新鲜 M9 培养基中至初始 OD600 约 0.005，在相同条件下培养 24 小时。使用酶标仪（BioTek Synergy Neo2，美国佛蒙特州）在 600 nm 波长处测量光密度以量化生长。
【数据】氨基酸浓度：300 μM；初始 OD600：约 0.005；培养时间：24h；温度：37°C；转速：220 rpm；生物学重复：n = 8
实验室进化实验
为标准化各处理间的基线氨基酸可用性，首先确定了能使初始 OD600 约 0.005 的培养物过夜生长量增加约 2 倍的氨基酸补充水平。两种营养缺陷型菌株在 4 µM 赖氨酸或精氨酸条件下均达到该阈值（补充图 S14）。该浓度因此被用作实验进化的氨基酸补充上限。单培养和共培养均提供相同浓度的氨基酸，以确保各处理间营养一致性。选择这一保守的操作阈值是为了降低过量氨基酸掩盖菌株间互作的可能性。
实验涉及三个处理组：第 1 组和第 2 组分别为 ΔlysA 或 ΔargH 的单培养，在补充最低浓度（4 μM）相应氨基酸的 M9 培养基中生长。第 3 组为 ΔlysA 和 ΔargH 的共培养，在补充 4 μM 赖氨酸和 4 μM 精氨酸的 M9 培养基中进行（图1A）。每个菌株从冻存甘油菌液中在溶菌肉汤（LB）卡那霉素琼脂平板上分离 10 个独立祖先菌落（n = 10），并在补充 300 µM 相应氨基酸的 M9 培养基中过夜预培养。预培养物随后用 M9 培养基洗涤三次，稀释至 OD600 约 0.5，按 1%（v/v）接种。每个分离株用于启动一个单培养和一个共培养。因此每个单培养和共培养共享相同的祖先来源，10 个重复中的每一个由不同的祖先菌落建立。
每个共培养以每个菌株相同数量的细胞起始（ΔlysA：(4.57 ± 0.51) × 10⁵，ΔargH：(4.73 ± 0.32) × 10⁵ cells/ml），总密度为单培养的两倍。所有培养物在 37°C、220 rpm 恒定振荡条件下培养。根据各自培养物的生长曲线，单培养每天传代（1:100（v/v））至 5 mL 新鲜培养基中，而共培养每三天传代一次（1:100），每次传代时测定 CFU/ml。每个周期的世代数计算为 g = ln(Nt/N0)/ln(2)，其中 N0 为给定生长周期的初始细胞密度，Nt 为最终细胞密度。该程序共持续 27 天，相当于共培养约 55 代（各周期累计）、单培养约 170 代。每次共培养传代时，将种群涂布于选择性培养基上分离各菌株。每个重复每个菌株挑取三个菌落保存（15% 甘油，−80°C）用于下游测定。实验室进化后，检测营养缺陷型菌株是否回复为原养型表型。将衍生菌落接种于无氨基酸 M9 琼脂平板和补充赖氨酸或精氨酸的 M9 琼脂平板，37°C 培养 24 小时后发现，共培养或单培养中的菌株在实验结束时仍保持营养缺陷型。
【数据】氨基酸补充浓度：4 μM；共培养初始密度：ΔlysA (4.57 ± 0.51) × 10⁵ cells/ml，ΔargH (4.73 ± 0.32) × 10⁵ cells/ml；传代比例：1:100；共培养传代间隔：3 天；总时长：27 天；共培养世代数：约 55 代；单培养世代数：约 170 代
祖先与衍生种群相对净生长测定
为确定衍生种群在实验室进化后生长是否发生变化及如何变化，测量了衍生营养缺陷型菌株（Evo）相对于相应祖先菌株（Anc）的净生长。单培养（n = 10）中，祖先或衍生菌株接种于补充 4 µM 相应氨基酸的 M9 培养基中，培养 24 小时（37°C，220 rpm）。共培养（活性共培养 n = 3，非活性共培养 n = 7）中，祖先-祖先或衍生-衍生共培养在不补充氨基酸的条件下起始，培养 72 小时。在 0 小时和终点测定 CFU。相对净生长计算为：相对净生长 = ln(Nt,Evo/N0,Evo)/ln(Nt,Anc/N0,Anc)，其中 N0 为初始 CFU 计数，Nt 为最终 CFU 计数。
【数据】单培养氨基酸浓度：4 µM；培养时间：24h；共培养时间：72h；温度：37°C；转速：220 rpm；重复数：单培养 n=10，活性共培养 n=3，非活性共培养 n=7
使用生物传感器定量代谢物产量
为量化营养缺陷型伙伴之间的代谢物交换，使用了已建立的基于生长的生物传感器测定法。在该测定中，营养缺陷型受体菌株的生物量积累作为共培养供体菌株提供的代谢物可用性的整合读数，因为受体生长严格依赖于伙伴菌株释放或使其可及的代谢物。由于受体生长不仅可由目标氨基酸支持，还可由其他代谢物支持（一旦主要限制解除），生物传感器输出可解释为净生长支持代谢物可用性，而非严格的单一代谢物测量。固定的 ΔlysA 或 ΔargH 单菌落用作生物传感器，与需要代谢物定量的菌株（即供体）共培养。因此，共培养时一个菌株是另一个菌株的生物传感器（图2A）。
实际操作中，将 50 μl 稀释的供体和生物传感器预培养物共同接种于 5 ml 含供体菌株所需相应氨基酸（300 μM）的 M9 培养基中。
【数据】共培养体积：5 ml M9 培养基；氨基酸浓度：300 μM；接种体积：各 50 μl
研究结果
营养缺陷型共培养的稳定性
首先检测了 ΔlysA 和 ΔargH 菌株在不同氨基酸补充条件下的生长响应。两种菌株在缺乏其所需氨基酸的 M9 培养基中均不能生长。单独补充非目标氨基酸（各 300 µM）不能恢复生长（图1B）。添加所需氨基酸（300 µM）可恢复生长，而当目标氨基酸与其他氨基酸共同提供时生长进一步增加（单因素方差分析：ΔlysA，p < 0.001，F = 54015，df = 31；ΔargH，p < 0.001，F = 2523，df = 31；图1B）。这表明一旦主要限制被解除，每种营养缺陷型菌株还能利用额外的代谢物来增强种群生长。
随后监测了 27 天连续传代实验中的种群动态。单培养每天传代（共 27 次传代），而共培养在同一时期内每 3 天传代一次（共 9 次传代；图1A）。单培养中，ΔlysA 种群早期快速增长后保持相对稳定，而 ΔargH 单培养的种群密度随时间逐渐但持续增加（配对样本 t 检验比较第 3 天和第 27 天，ΔlysA：t = 1.89，n = 10，p = 0.092；ΔargH：t = 4.46，n = 10，p = 0.002；图1C、D）。相比之下，共培养各重复之间表现出异质性动态（图1E 和补充图 S1）。总共培养密度通常在最初 3-6 天内达到峰值后下降（Wilcoxon 符号秩检验比较第 3 天和第 27 天：p = 0.01，Z = −2.50，n = 10）。实验终点时，10 个共培养中有 7 个几乎没有或完全没有可检测的生长（灭绝），而 3 个维持了持续的种群密度。因此将共培养分别归类为非活性或活性（图1F）。共培养密度的变化伴随着群落组成的改变。尽管所有共培养以相似的菌株比例起始（图1G），第 27 天非活性共培养通常由 ΔlysA 主导，而活性共培养保留了较高的 ΔargH 相对丰度（图1H）。这一观察直接验证了基础研究中报道的模式，确认 ΔlysA 优势是该系统中互养相互作用失败的稳定生态标志。
为评估这些结果是否反映了个体菌株生长性能的进化变化，量化了衍生种群相对于其祖先的净生长。衍生 ΔlysA 菌株在单培养或活性共培养中与其祖先基线相比净生长无显著变化（单样本 t 检验：Mono-ΔlysA，p = 0.303，t = 1.09，n = 10；Active Co，p = 0.97，t = 0.047，n = 3；图1I 和补充图 S2）。相反，非活性共培养表现出显著降低的净生长（单样本 t 检验：p < 0.001，t = 6.88，n = 7；图1I 和补充图 S2），而 ΔargH 单培养在进化过程中表现出显著增加（单样本 t 检验：p = 0.005，t = 3.66，n = 10；图1I）。总之，这些结果表明互养共培养持续分化为具有不同种群轨迹和组成的活性与非活性状态。此外，排除了微量元素耗竭作为共培养种群生长下降的潜在原因：使用第一次培养的条件培养基进行第二轮共培养显示出相似的生长动态，表明 M9 培养基中的微量元素足以维持循环生长（补充图 S3）。由于这些模式不能仅用单培养生长的变化来解释，接下来检验代谢物交换的差异是否构成所观察到的分化模式的基础。
【数据】非目标氨基酸：各 300 µM；目标氨基酸：300 µM；ΔlysA 单培养：t = 1.89，n = 10，p = 0.092；ΔargH 单培养：t = 4.46，n = 10，p = 0.002；共培养 Wilcoxon 检验：p = 0.01，Z = −2.50，n = 10；活性共培养：3/10；非活性共培养：7/10；Mono-ΔlysA：p = 0.303；Active Co：p = 0.97；Inactive Co：p < 0.001，t = 6.88，n = 7；ΔargH 单培养：p = 0.005，t = 3.66
代谢物产量塑造共培养互作动态
为量化每种营养缺陷型菌株向其伙伴提供的代谢物，采用了基于生物传感器的测定法，将祖先受体菌株与目标供体菌株共培养（图2A）。选择该方法是因为当共享代谢物在积累到主体培养基之前被生产者细胞附近消耗或重新获取时，标准上清液测量可能低估有效交换。该测定基于系统中交换的空间邻近性特征。当 ΔlysA 和 ΔargH 菌株被允许小分子自由扩散但阻止短距离细胞间接触的膜过滤器分离时，代谢物交换显著减少（独立样本 t 检验，p < 0.001，tΔlysA = 16.10，tΔargH = 21.33，n = 8，补充图 S4A、B），这可能源于生产者对代谢物的重新获取。一致地，任一营养缺陷型单培养的无细胞上清液不能维持伙伴菌株的生长（补充图 S4C），表明共培养中的代谢物可用性超过了主体胞外培养基中的含量。这些结果表明营养缺陷型之间的空间邻近性增强了有效的交叉喂养。因此使用生物传感器生长作为共享代谢物的整合读数，同时捕获可扩散化合物和邻近依赖性交换的贡献。生物传感器生长在氨基酸浓度升高时呈线性增加（补充图 S5），确认该测量提供了代谢物产量的定量代理指标。因此，生物传感器读数表示为有效代谢物产量（每个供体细胞供养的生物传感器细胞数）。为评估冻存后基于生物传感器的代谢物产量表型的可重复性，从冻存 0、7 或 14 天的冻存液中复苏了单菌落来源的祖先 ΔlysA 和 ΔargH 分离株，然后使用生物传感器测定法量化代谢物产量。不同储存时间的产量水平稳定，表明该测定捕获了每个分离株的可重复特性（补充图 S6）。
使用该测定法，监测了进化实验期间代谢物产量的时间变化。在非活性共培养中，代谢物产量水平……
【数据】膜过滤实验：p < 0.001，tΔlysA = 16.10，tΔargH = 21.33，n = 8；生物传感器线性响应：补充图 S5；冻存稳定性：0/7/14 天
讨论与解读
研究表明，群落组装时存在的代谢物产量变异能显著影响互养微生物群落的命运。在由赖氨酸和精氨酸营养缺陷型大肠杆菌组成的简单互养体系中，初始代谢物产量较低的菌株建立的群落更可能维持稳定生长，而高产量菌株建立的群落频繁灭绝。虽然实验进化明确表明已建立的互惠关系可以随时间进化出增强的 reciprocal exchange 和更深的代谢纠缠，但本研究揭示了额外的约束——群落的初始组装阶段，过量的代谢物产生实际上会破坏生态稳定性。
大多数关于微生物互惠互作的实验和理论工作集中于相互作用结构、代谢互补性和系统建立后的进化变化。相比之下，对互作发生前菌株或物种内存在的表型变异关注较少。在本系统中，源自同一工程化祖先的独立分离菌落表现出连续的代谢物产量变异。这种变异足以预测群落能否在数十代内持续或灭绝。重测序分析显示高产量和低产量分离株之间编码区无一致差异，但表达差异提示编码区以外的区域可能影响这些产量性状。
编译者解读：该研究为合成菌群设计提供了重要警示——"过度慷慨"反而有害。从合成生物学应用角度看，这一发现意味着在设计互养型工程菌群时，应有意筛选或改造代谢物分泌水平适中的菌株，而非追求最大化的输出。生物传感器结合进化实验的方法论也值得借鉴：通过表型预筛选即可预判群落命运，大幅降低了长周期稳定性筛选的成本。未来若能将"低初始产量"这一设计原则推广至更多元的合成群落体系，将有助于构建更稳健的工程微生物生态系统。
参考来源
Ye N, Dunn DW, Yang Z, Hou B, Wang H. Low initial metabolite production enhances stability in syntrophic bacterial consortia. Commun Biol. PMID: 42086699.
PMID: 42086699