来源：Rapid On-Site Detection of Lacticaseibacillus paracasei Using a Portable MIRA-CRISPR/Cas12a Naked-Eye Fluorescence Assay.（Foods）| 编译：DNA Lab Space
导读
益生菌市场快速扩张，菌种身份验证成为质量管控的核心环节。副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）是功能食品和乳制品中最常用的益生菌株之一，但传统培养法耗时48–72小时且无法区分近缘种，PCR法则依赖昂贵热循环仪和专业操作人员。本研究开发了一种整合MIRA等温扩增与CRISPR/Cas12a信号放大的荧光检测方法，全程仅需58分钟，检测限达100 CFU/mL，在48份食品样本中与qPCR金标准100%一致，且只需便携式小型设备即可完成。
研究背景
副干酪乳杆菌是一种革兰氏阳性、兼性异型发酵乳酸菌，具有改善肠道功能、增强免疫应答、抑制病原菌等多种健康益处，因而被广泛添加于功能食品、乳制品和膳食补充剂中。对益生菌产品中副干酪乳杆菌进行准确的物种水平鉴定，是质量保证、法规合规和消费者安全的基本要求。
传统培养法依赖菌落形态、革兰氏染色和生化试验，通常需要48–72小时，且无法区分近缘的乳杆菌属物种。全基因组测序虽能可靠鉴定，但需48–96小时、专业测序设备和生物信息学知识，不适合高通量常规质控。qPCR因其快速和准确已成为主流实验室方法，但其依赖昂贵的热循环仪和专业操作人员，在资源有限的环境中难以部署，且102–103 CFU/mL的检测限无法捕获低水平污染。
等温扩增技术可在恒定温度下运行，为现场检测提供了新可能。本研究旨在开发一种结合MIRA（多酶恒温快速扩增）与CRISPR/Cas12a的检测体系，实现副干酪乳杆菌的快速、特异、高灵敏现场检测。
研究方法
2.1 菌株与培养条件
研究使用了23株常见于益生菌产品、涵盖6个属的细菌菌株。标准菌株包括副干酪乳杆菌CICC 20286、干酪乳杆菌CICC 6117、鼠李糖乳杆菌CICC 6001、瑞士乳杆菌CICC 20243、植物乳杆菌CICC 10345、乳酸乳球菌乳酸亚种CICC 20400、戊糖片球菌CICC 22228和动物双歧杆菌乳亚种CICC 21709，均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC，北京）。实验室保藏的商业益生菌株包括副干酪乳杆菌GM080、GMNL-33、LcS、K56和LC01；干酪乳杆菌BD-8632、B63、B240、ATCC 393和LC89；鼠李糖乳杆菌GG（LGG®）、HN001、MP108、GR-1和ATCC 53103。
所有菌株在MRS肉汤（环凯微生物，广州；货号027312）中、37°C、厌氧条件下培养24–48小时。细菌浓度通过标准平板计数法测定：用无菌磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）对菌悬液进行10倍梯度稀释，取100 μL涂布于MRS琼脂平板（环凯微生物，广州），厌氧条件下37°C培养48小时后计数菌落。
【数据】培养基：MRS肉汤/琼脂；温度：37°C；时间：24–48h（液体）/48h（平板）；稀释液：PBS（pH 7.4）；涂布量：100 μL
2.2 DNA提取
快速粗提法（RCE）使用商业试剂盒（AMP-Future Biotech，常州；货号WLD8201-ES），该试剂盒针对MIRA等温扩增优化，与细胞培养基、动物组织和食品基质具有广泛兼容性。细菌裂解通过剧烈pH冲击后快速中和实现，无需反复纯化即可获得稳定的粗DNA提取物。改良程序如下：取100 μL新鲜对数期细菌培养悬液或乳酸菌掺入的食品匀浆液，加入0.1 mm直径无菌玻璃珠（Sigma-Aldrich，St. Louis，MO，USA），在MX-E涡旋混合器（DLAB Scientific，北京）上以最大速度（3000 r/min，4.8 mm轨道直径）剧烈涡旋2分钟进行机械裂解。随后加入16 μL试剂A和4 μL试剂B，混合物在40°C孵育5分钟。裂解液在D1012U微型离心机（DLAB Scientific，北京）中6708× g离心1分钟，收集上清液。
对照验证采用常规基因组提取法（CGE），使用基因组DNA提取试剂盒（生工生物，上海；货号B518225）作为参考方法。该程序采用溶菌酶酶解、热介导碱性消化和异丙醇纯化；瑞士乳杆菌需额外添加变溶菌素（200 U/mL，货号M9901，Sigma-Aldrich，St. Louis，MO，USA）处理。细菌细胞离心收集后，用溶菌酶（20 mg/mL）在37°C预处理，随后在65°C的消化缓冲液中裂解。经蛋白沉淀和异丙醇介导的DNA回收后，纯化DNA溶解于TE缓冲液（pH 8.0）中。
DNA纯度和浓度使用Spark多功能酶标仪（Tecan Trading Co., Ltd.，上海）分光光度法测定。提取完整性通过通用细菌16S rRNA基因PCR验证，使用引物16SF/1495R（表1），随后进行琼脂糖凝胶电泳确认预期扩增子大小。
【数据】RCE：100 μL样品 + 0.1 mm玻璃珠，3000 r/min涡旋2 min；试剂A 16 μL + 试剂B 4 μL，40°C 5 min；6708× g离心1 min。CGE：溶菌酶20 mg/mL 37°C预处理；变溶菌素200 U/mL（仅瑞士乳杆菌）；65°C裂解
2.3 引物与crRNA设计
物种特异性靶区域通过SnapGene 8.2软件（Dotmatics，Boston，MA，USA）比较基因组分析确定。选择rpsM基因——一个编码30S核糖体蛋白S13的保守单拷贝看家基因——作为扩增靶标。MIRA引物按既定标准设计：长度30–35 bp，GC含量30–70%，无预测引物二聚体、发夹结构或与其他乳酸菌基因组的交叉反应。crRNA设计靶向MIRA扩增子内的副干酪乳杆菌特异性序列，包含通用骨架序列和与5′-TTTC-3′前间隔序列邻近基序（PAM）下游区域互补的23-nt特异性间隔序列。所有寡核苷酸，包括MIRA引物、crRNA和6-羧基荧光素（FAM）标记的单链DNA（ssDNA）荧光报告子，均由生工生物（上海）合成并经HPLC纯化。序列见表1。
【数据】引物长度：30–35 bp；GC含量：30–70%；crRNA间隔序列：23 nt；PAM序列：5′-TTTC-3′
2.4 MIRA等温扩增
MIRA等温预扩增使用商业AMP-Future MIRA基础试剂盒（AMP-Future Biotech Co., Ltd.，常州；货号MIRA001），按照制造商方案并做少量系统优化。每个50 μL反应包含：29.4 μL缓冲液A、2 μL正向引物（MIRA-F，10 μM）、2 μL反向引物（MIRA-R，10 μM）、5 μL基因组DNA模板和9.1 μL无核酸酶水。反应通过加入2.5 μL缓冲液B启动，立即在干热块（Eppendorf，Hamburg，Germany）中37°C孵育30分钟。全程使用带滤芯移液枪头防止交叉污染。鉴于扩增子浓度高，所有扩增后开管和样品转移操作均在专用扩增后区域进行，以最大限度降低气溶胶污染风险。
【数据】反应体系：50 μL（29.4 μL Buffer A + 2 μL MIRA-F 10 μM + 2 μL MIRA-R 10 μM + 5 μL模板 + 9.1 μL水 + 2.5 μL Buffer B）；温度：37°C；时间：30 min
2.5 CRISPR反应条件优化
为最大化Cas12a反式切割活性，进行了系统性单因素优化。首先，测试Cas12a:crRNA摩尔比梯度（1:5、2:5、4:5、8:5、16:5、32:5和64:5），以确定功能性核糖核蛋白（RNP）复合物组装的最佳条件。其次，在优化后的Cas12a:crRNA比例下，评估Cas12a:crRNA:ssDNA摩尔比梯度（4:5:6.25、4:5:12.5、4:5:25、4:5:50、4:5:100、4:5:200和4:5:400）。第三，基于最佳比例，在Cas12a浓度梯度（4、8、16、32、64和128 nM）下测试工作浓度。所有CRISPR反应含1× NEBuffer 2.1（NEB，Ipswich，MA，USA）、5 μL MIRA产物，加无核酸酶水至终体积100 μL。使用Spark多功能酶标仪（Tecan Trading Co., Ltd.，上海）每1分钟记录一次荧光信号，持续45分钟，激发波长485 nm，发射波长535 nm。所有反应在恒定37°C下进行，与MIRA扩增温度一致。荧光到达平台期的时间和终点荧光强度作为评价指标。
【数据】Cas12a:crRNA比例梯度：1:5–64:5；Cas12a:crRNA:ssDNA比例梯度：4:5:6.25–4:5:400；Cas12a浓度梯度：4–128 nM；反应体积：100 μL；检测：激发485 nm/发射535 nm，每1 min记录，共45 min；温度：37°C
2.6 方法特异性评价
使用涵盖6个食品常用属的23株乳酸菌（详见2.1节）评估建立的MIRA-CRISPR/Cas12a荧光检测方法的分析特异性。各菌株新鲜培养物通过活菌平板计数并调整至统一浓度1 × 10⁷ CFU/mL。按2.2节所述从各菌株提取基因组DNA，在优化条件下平行检测。荧光信号使用470 nm蓝光透射仪（Puribo Instruments，杭州）可视化。阳性结果定义为裸眼可见绿色荧光，无可视荧光则判定为阴性。
【数据】菌株浓度：1 × 10⁷ CFU/mL；蓝光激发：470 nm
2.7 方法灵敏度评价
在牛奶基质中，使用副干酪乳杆菌CICC 20286的10倍梯度稀释液测定建立的MIRA-CRISPR/Cas12a荧光检测方法的检测限（LOD）。将过夜培养物通过活菌平板计数，掺入无菌牛奶并梯度稀释至终浓度1 × 10⁰至1 × 10¹⁰ CFU/mL。从各牛奶稀释液中提取基因组DNA，使用两种检测策略平行测试以验证……
（原文节选在此处截断，后续灵敏度评价细节原文未完整呈现）
【数据】菌株：副干酪乳杆菌CICC 20286；浓度范围：1 × 10⁰–1 × 10¹⁰ CFU/mL；基质：无菌牛奶
研究结果
3.1 可视化MIRA-CRISPR/Cas12a检测系统原理
建立的副干酪乳杆菌检测方法整合了MIRA等温预扩增、CRISPR/Cas12a介导的信号放大和可视化荧光信号转导，无需专业实验室精密仪器，仅需基础小型化设备（图1A）。简要流程为：8分钟内从样品中快速提取基因组DNA，随后30分钟内对靶基因进行MIRA扩增。扩增子在20分钟37°C等温CRISPR反应中被crRNA引导的Cas12a蛋白识别，触发其非特异性反式切割活性。激活的Cas12a切割FAM/BHQ1标记的ssDNA报告子，使荧光基团与淬灭基团分离，产生可在蓝光激发下可视化的亮绿色荧光信号。比较基因组比对显示，副干酪乳杆菌与其他乳酸菌物种在保守rpsM看家基因的引物结合位点和crRNA靶位点存在显著的种间序列变异（图1B）。
对21株代表性菌株的比较基因组比对揭示了一个多层鉴别特征，使得在干酪乳杆菌群内高度保守的情况下仍能实现物种特异性检测（图2）。具体而言，两条MIRA引物的3′-末端均含有种间多态性位点（正向：AACG对GTAT；反向：AA对TT），crRNA间隔区在种子区域外含有2–3个错配，且副干酪乳杆菌含有经典5′-TTTC-3′ PAM，而干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌携带次优的5′-CTTC-3′ PAM。
【数据】DNA提取：8 min；MIRA扩增：30 min；CRISPR反应：20 min，37°C；PAM：副干酪乳杆菌5′-TTTC-3′，非靶菌5′-CTTC-3′
3.2 CRISPR/Cas12a反应体系优化
#### 3.2.1 Cas12a:crRNA摩尔比优化
Cas12a反式切割活性决定CRISPR检测的灵敏度，因此对核心酶组分进行优化以改善反应动力学和检测性能。Cas12a:crRNA比例是高效RNP复合物形成和后续反式切割激活的关键参数。如图3A所示，Cas12a:crRNA摩尔比为4:5时产生最高的初始斜率（指示最大反式切割速率）；次优和超优比例均导致信号输出显著衰减。
【数据】最佳Cas12a:crRNA摩尔比：4:5
#### 3.2.2 Cas12a:crRNA:ssDNA摩尔比优化
ssDNA报告子与预组装RNP复合物的摩尔比决定了CRISPR反应对MIRA产物信号放大的程度。基于Cas12a:crRNA最佳摩尔比4:5，进一步优化Cas12a:crRNA:ssDNA摩尔比。摩尔比4:5:100（Cas12a:crRNA:ssDNA）产生最高的初始斜率（图3B）。ssDNA报告子量不足限制了荧光积累速率，而过量报告子对初始反应速率无进一步增益——后者可能反映了反应窗口内Cas12a反式切割活性的动力学限制。
【数据】最佳Cas12a:crRNA:ssDNA摩尔比：4:5:100
#### 3.2.3 工作浓度优化
在预验证的最佳摩尔比4:5:100下，发现在4 nM至128 nM测试范围内，CRISPR反应体系的荧光积累速率与Cas12a浓度正相关（图3C），浓度越高信号积累越快。综合考虑检测成本，选择64 nM Cas12a作为工作浓度。对应的crRNA和ssDNA终工作浓度分别为80 nM和1.6 μM。最终优化的20 μL CRISPR/Cas12a反应体系包含5 μL MIRA扩增产物、1× NEBuffer 2.1、64 nM EnGen® LbCas12a（NEB，Ipswich，MA，USA）、80 nM crRNA、1.6 μM FAM标记ssDNA报告子，加无核酸酶水至体积。反应在37°C孵育20分钟，荧光信号在470 nm蓝光激发源下可视化。
【数据】Cas12a工作浓度：64 nM；crRNA：80 nM；ssDNA报告子：1.6 μM；反应体积：20 μL；温度：37°C；时间：20 min
#### 3.2.4 两种核酸提取方法比较
为验证RCE用于DNA提取的有效性，使用RCE和CGE两种方法提取8株乳酸菌的基因组DNA进行比较分析。分光光度法纯度评估显示，RCE产物表现出升高的A260/A280比值（2.07–2.32，CGE为1.76–2.01）和显著降低的A260/A230比值（0.23–0.54，CGE为0.77–2.08）（表S1）。升高的A260/A280比值可能反映RNA污染或蛋白耗竭，而大幅降低的A260/A230比值表明存在与碱性裂解粗提物相关的有机污染物。这些杂质人为抬高了RCE产物的表观DNA浓度（359–1543 ng/μL，CGE为16–141 ng/μL）。尽管如此，16S rRNA基因的PCR扩增在所有样品中均产生预期的约1500 bp条带，确认两种方法均成功从测试菌株中提取到可扩增DNA（图S1）。
鉴于RCE提取物纯度较低，进一步研究这种污染是否会损害下游MIRA-Cas12a检测性能。为此，在不同细菌载量范围内比较RCE和CGE。如图3D所示，在所有测试浓度下，RCE和CGE组的荧光信号积累速率相当，表明快速裂解方法能高效释放靶DNA，从而支持有效的MIRA预扩增和后续Cas12a反式切割激活。
快速粗提法的DNA提取效率与常规基因组提取相当，同时显著减少了柱纯化和长时间酶消化的需求，8分钟即可完成，而CGE需2小时。这些结果支持将RCE工作流程整合到检测系统中，实现从核酸提取到荧光读出的端到端快速化和便携化。
【数据】RCE纯度：A260/A280 2.07–2.32，A260/A230 0.23–0.54；CGE纯度：A260/A280 1.76–2.01，A260/A230 0.77–2.08；RCE DNA浓度：359–1543 ng/μL；CGE DNA浓度：16–141 ng/μL；RCE耗时：8 min；CGE耗时：2 h
3.3 MIRA-CRISPR/Cas12a检测方法的分析性能
#### 3.3.1 特异性
建立的方法在两层水平上评估分析特异性。首先，测试了涵盖6个属的8种常见食品级乳酸菌的跨属菌株组。如图4A所示，仅靶标副干酪乳杆菌产生明亮的强阳性荧光信号，而7种非靶菌——包括近缘的干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌——无可视荧光，与检测方法无交叉反应。荧光图像的定量分析证实了这些视觉观察结果，仅副干酪乳杆菌显示显著升高的相对荧光强度（p < 0.0001），所有非靶菌株的信号与阴性对照无显著差异（p > 0.05）（图4D）。
其次，为在分类学上复杂的干酪乳杆菌群内严格验证物种特异性，将验证菌株组扩大至15株商业益生菌株。如表2所示，5株副干酪乳杆菌均产生强阳性荧光信号，而5株干酪乳杆菌和5株鼠李糖乳杆菌均无可检测荧光。这些结果确认该方法对干酪乳杆菌群常用商业菌株中的副干酪乳杆菌具有100%特异性。三层特异性机制确保即使在crRNA种子区域的靶DNA片段在属内保守时也能实现一致区分。两条MIRA引物的3′-末端2–4个核苷酸在所有副干酪乳杆菌菌株中严格保守，但在干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌中存在错配，从而完全阻断重组酶介导的引物延伸，防止非特异性扩增。此外，Cas12a需要PAM结合才能启动……
（原文节选在此处截断，后续讨论内容原文未完整呈现）
【数据】跨属特异性：8种乳酸菌中仅副干酪乳杆菌阳性；商业菌株验证：5/5副干酪乳杆菌阳性，5/5干酪乳杆菌阴性，5/5鼠李糖乳杆菌阴性；p < 0.0001（阳性 vs 阴性）；p > 0.05（非靶菌 vs 阴性对照）
讨论与解读
新开发的MIRA-CRISPR/Cas12a检测平台相比现有副干酪乳杆菌鉴定方法具有多重优势（表4）。相对于传统培养生化鉴定，该方法大幅缩短了周转时间并实现物种水平特异性，将检测从48–72小时压缩至58分钟（8分钟核酸提取、30分钟MIRA、20分钟CRISPR反应）。相较于包括qPCR和微滴数字PCR在内的PCR方法，本方法无需笨重、不可移动且昂贵的热循环设备，适用于资源有限的环境。单次检测直接试剂成本低于5美元，每次检测总成本（含仪器摊销）低于qPCR和微滴数字PCR。灵敏度与大多数已报道的qPCR方法相当，但逊于微滴数字PCR——后者仍高度依赖专业且昂贵的仪器。
后续工作将聚焦冻干试剂配方以简化操作流程，配合全封闭管一体化系统（单管序贯或一锅同时反应）消除气溶胶污染风险。最终将小型化配套仪器和匹配耗材集成为一体化便携式现场检测试剂盒，为益生菌产品快速质量筛查开辟广阔应用前景。
编译者解读
该研究的关键创新在于将MIRA等温扩增与CRISPR/Cas12a检测"缝合"为一个真正可部署的现场方案——58分钟全流程、蓝光手电筒裸眼读数、单次成本低于5美元，这些参数直击益生菌行业质控的痛点。三层特异性机制（引物3′端多态性+PAM差异+crRNA错配）巧妙解决了干酪乳杆菌群内物种区分难题，是方法设计的亮点。值得关注的是，RCE粗提物虽纯度指标不佳（A260/A230仅0.23–0.54），却未影响下游检测性能，这提示MIRA-CRISPR体系对杂质耐受性优于PCR，为简化前处理提供了依据。局限在于灵敏度仍逊于微滴数字PCR，且当前为开管操作，气溶胶污染风险尚未完全消除。向冻干试剂与闭管一体化方向发展是合理的下一步，但单管一锅法需解决MIRA与CRISPR两步反应的条件兼容问题。从合成生物学视角看，该系统展示了"分子工具组合+工程化设计"解决实际检测需求的范例，其便携化思路对其它食源性致病菌的现场检测具有直接迁移价值。
参考来源
Liao K, Zhang Y, Xiong X, She Z, Wang Y. Rapid On-Site Detection of Lacticaseibacillus paracasei Using a Portable MIRA-CRISPR/Cas12a Naked-Eye Fluorescence Assay. Foods. PMID: 42587967.
PMID: 42587967