来源：Biogenic synthesis and characterization of selenium nanoparticles by halotolerant Bacillus sonorensis 2MNHR.（Appl Microbiol Biotechnol）| 编译：DNA Lab Space
导读
硒纳米颗粒（SeNPs）凭借其独特的理化性质和生物医学应用潜力而备受关注。本研究从埃及亚历山大港地中海海水中分离到一株耐盐海洋细菌Bacillus sonorensis 2MNHR，该菌株能够在72小时内将亚硒酸钠胞外还原为元素硒，形成粒径80–200 nm的球形无定形SeNPs。通过UV-Vis、FTIR、XRD、SEM-EDX、TEM等多种手段对SeNPs进行了系统表征，并验证了其广谱抗菌活性。该研究为海洋微生物介导的纳米硒绿色合成提供了新菌株资源。
研究背景
硒是25余种硒蛋白（包括谷胱甘肽过氧化物酶和硫氧还蛋白还原酶）的必需微量元素，对维持细胞氧化还原稳态至关重要。在自然环境中，硒主要以硒酸盐（SeO₄²⁻）、亚硒酸盐（SeO₃²⁻）和元素硒（Se⁰）等形式存在。尽管微量元素水平的硒是必需的，但高浓度的硒（尤其是亚硒酸盐）具有极强的毒性，这促使污染生态系统中微生物解毒策略的发展。相反，硒缺乏与克山病和免疫功能受损等疾病相关，凸显了营养需求与毒性之间的狭窄界限。
硒纳米颗粒因其独特的理化性质——粒径通常为50–400 nm、球形形态、结构稳定性和比块状硒更高的生物利用度——而成为有前景的纳米材料。这些特征支持其在抗菌、抗癌和抗氧化治疗中的潜在应用，且毒性相对较低、生物活性更优。值得注意的是，生物源性SeNPs对革兰氏阴性菌（如铜绿假单胞菌）表现出显著的抗菌活性。微生物将有毒的硒含氧阴离子还原为无毒的元素硒纳米颗粒，既是环境修复的重要途径，也是绿色合成纳米材料的新思路。
研究方法
化学试剂
本研究使用的所有化学品均为分析纯级。亚硒酸钠（Na₂SeO₃，纯度≥99%）、硒酸钠（Na₂SeO₄，纯度≥98%）、氯化钠（NaCl，纯度≥99.5%）、氯仿（纯度≥99%）和乙醇（70% v/v）均购自标准商业供应商，未经进一步纯化直接使用。所有实验均使用去离子水。
样品采集与地点描述
海水样品采集自埃及亚历山大港的地中海海域（北纬31°11′36.9492″，东经29°52′34.5252″）。采样在夏季进行，环境温度约37°C。所有采样容器、仪器和材料在采集前均经过彻底灭菌以防止外部污染。样品无菌运输至实验室并立即处理。
细菌菌株的分离、纯化与保藏
将海水样品进行连续稀释，涂布于补充3.5%（w/v）NaCl的Luria–Bertani（LB）琼脂平板上，在37°C下有氧培养。为确保培养物纯度，每个分离株通过反复划线于LB琼脂进行进一步纯化。纯化后的分离株保存在LB琼脂斜面上，4°C短期保藏。本研究所用的B. sonorensis 2MNHR菌株目前保藏于作者实验室培养物保藏中心，可通过通讯作者合理请求获取用于研究目的。
液体和固体培养基中硒酸盐还原的筛选策略
采用逐步筛选法评估每个纯化分离株在液体和固体培养条件下还原硒含氧阴离子的能力。硒还原测定中，LB培养基补充3.5%（w/v）NaCl以模拟海洋盐度条件。将分离株接种至补充1 mM亚硒酸钠（Na₂SeO₃）或1 mM硒酸钠（Na₂SeO₄）的LB肉汤中。肉汤培养物在37°C、150 rpm振荡下有氧培养。培养物在72小时内目视监测颜色变化，红色出现作为元素硒（Se⁰）形成的定性指标。同样，为评估固体生长条件下的硒还原能力，将分离株划线接种于补充1 mM亚硒酸钠或1 mM硒酸钠的LB琼脂平板上。每日检查平板是否有可见颜色变化，呈现红色素的分离株被认为可能具有亚硒酸盐还原能力，并选择进行进一步分析。
对在全细胞培养中呈阳性反应的分离株进行基于上清液的测定，以确定硒还原发生在胞内还是胞外。将所选分离株在LB肉汤中在相同条件下培养24小时。然后通过离心将细菌细胞与培养基分离。所得无细胞上清液无菌补充亚硒酸钠至终浓度1 mM，并在相同条件下培养最多72小时。根据上清液中是否出现红色推断胞外组分是否参与硒还原。
耐盐性测定与生长动力学
通过将所选菌株在补充递增浓度NaCl（1%、2%、3.5%和5%，w/v）的LB肉汤中培养来评估其耐盐性。含1% NaCl的LB肉汤作为对照条件。纳入3.5% NaCl浓度以近似海水平均盐度（约3.5%溶解盐）。将过夜培养物接种至新鲜培养基中，调整初始光密度（OD₆₀₀）至约0.05。培养物在37°C振荡培养。通过每2小时间隔测量600 nm处光密度（OD₆₀₀）监测细菌生长，共30小时。以OD₆₀₀值对培养时间作图生成生长曲线。确定各盐度条件下的最大光密度（ODmax）和达到稳定期所需时间，以评估盐浓度对细菌生长性能的影响。所有后续亚硒酸盐还原和SeNP生物合成实验均使用1% NaCl浓度。
【数据】培养基：LB；NaCl浓度梯度：1%、2%、3.5%、5%（w/v）；初始OD₆₀₀：约0.05；培养温度：37°C；监测时间：30h；监测间隔：2h；振荡条件：150rpm
基于16S rRNA基因测序的分离株分子鉴定
按照Joseph Sambrook描述的方案从所选细菌分离株中提取基因组DNA。使用通用细菌引物（表1）通过聚合酶链式反应（PCR）扩增近完整的16S rRNA基因。每个50µL PCR反应混合物含30 pmol各引物、10 ng染色体DNA、200 µM各dNTP、2.5 U Taq DNA聚合酶及配套反应缓冲液。扩增进行30个循环，条件如下：94°C变性1分钟，55°C退火1分钟，72°C延伸2分钟。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分析。扩增片段使用QIAquick PCR纯化试剂盒（Qiagen）纯化。测序反应使用ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit进行，并在ABI PRISM 377 DNA测序仪（PerkinElmer）上分析。用于扩增的相同引物也用于测序。序列相似性搜索使用NCBI的BLAST程序进行。使用MEGA 12构建系统发育树，包括代表性分离株的矩形树和所选类群的环形树。树的可视化和注释在同一软件环境中进行，并在iTOL v6中进一步优化。
表1 16S rRNA基因扩增所用引物
| 引物名称 | 序列（5′→3′） | 参考文献 |
|---------|--------------|---------|
| 27F（正向） | AGAGTTTGATCCTGGCTCAG | Devereux and Willis 1995 |
| 1492R（反向） | ACGGTTACCTTGTTACGACTT | — |
【数据】PCR反应体系：50µL；引物量：30pmol/各；DNA模板：10ng；dNTP：200µM/各；Taq DNA聚合酶：2.5U；循环数：30；变性：94°C/1min；退火：55°C/1min；延伸：72°C/2min
生物源性SeNPs的纯化
通过4000 rpm离心10分钟将生物源性SeNPs从反应混合物中分离，收集所得沉淀。为去除与纳米颗粒相关的残留生物杂质和基质代谢物，将沉淀依次用氯仿、70%乙醇和无菌蒸馏水洗涤，获得纯化的SeNPs。最后，将纳米颗粒在40°C下干燥过夜以供后续分析。
【数据】离心转速：4000rpm；离心时间：10min；洗涤剂：氯仿、70%乙醇、无菌蒸馏水；干燥温度：40°C；干燥时间：过夜
生物源性SeNPs的表征
#### 紫外-可见光谱法
将纯化的生物源性SeNP悬浮液分散于蒸馏水中，使用紫外-可见（UV-Vis）分光光度计（T80，PG Instruments，英国）在200–800 nm波长范围内记录其吸收光谱。此外，在相同实验条件下，以未接种的培养基作为空白对照，对细菌上清液进行平行UV-Vis光谱分析。所有测量均进行三次重复。
【数据】波长范围：200–800nm；仪器：T80 UV-Vis分光光度计；重复次数：3；空白对照：未接种培养基
#### 傅里叶变换红外光谱法
使用傅里叶变换红外（FTIR）光谱法表征与SeNPs生物还原相关的生物分子和官能团。将真空脱水样品与KBr压片混合，使用FTIR分光光度计（FTIR spectrum version 10.5.3，PerkinElmer，美国）在450–4000 cm⁻¹范围内记录红外光谱。光谱以波数（cm⁻¹）对透射率（%）作图。
【数据】波数范围：450–4000cm⁻¹；仪器：FTIR spectrum 10.5.3，PerkinElmer；制样：KBr压片
研究结果
细菌菌株的分离
从埃及亚历山大港地中海海域的LB琼脂平板（补充3.5% NaCl）上成功分离到10株形态不同的细菌分离株。所有分离株均在这些条件下表现出有氧生长，随后对其还原硒含氧阴离子的能力进行了筛选。
【数据】分离株数量：10株；培养基：LB琼脂+3.5% NaCl；培养条件：有氧
细菌分离株亚硒酸盐和硒酸盐还原的筛选
所有10株分离株均在液体和固体培养条件下筛选了还原亚硒酸钠（Na₂SeO₃）和硒酸钠（Na₂SeO₄）的能力。在受试分离株中，仅一株在含1 mM亚硒酸钠的LB肉汤中于72小时内出现明显的红色，表明形成了元素硒。同一分离株在补充亚硒酸盐的LB琼脂平板上也呈现红色素沉着，而其余分离株在任一培养基中均未显示可见颜色变化。相比之下，在整个培养期间，没有任何分离株在硒酸钠存在下表现出可检测的颜色变化。
图1 a固体培养和b液体培养显示亚硒酸钠还原的红色指示，而在含硒酸钠的培养基中未观察到可见还原。c所选分离株在不同NaCl浓度（1–5%）下的生长动力学，显示在1% NaCl下生长最佳
【数据】亚硒酸钠浓度：1mM；硒酸钠浓度：1mM；显色时间：72h内；阳性分离株数：1/10
全细胞筛选后的上清液测定
在液体和固体培养基中均一致显示亚硒酸钠还原的分离株，在全细胞筛选后进行上清液测定。在LB肉汤中有氧培养24小时后，通过离心沉淀细菌细胞获得无细胞上清液。将上清液无菌补充亚硒酸钠至终浓度1 mM，并在相同条件下培养最多72小时。培养后，无细胞上清液中出现明显的红色，表明亚硒酸盐还原独立于完整细菌细胞而发生。这些发现表明硒还原通过胞外机制进行。基于该分离株在全细胞和上清液测定中的一致表现，选择其进行后续SeNP生物合成及进一步的生理学和分子表征。
【数据】培养时间：24h；亚硒酸钠终浓度：1mM；上清液培养时间：最多72h；结果：上清液变红
所选亚硒酸盐还原菌株的表征
#### 所选分离株的耐盐性测定
所选分离株在补充1% NaCl的培养基中表现出最佳生长。随着盐度增加，生长逐渐下降；然而，在5% NaCl下仍可观察到可测量的生长。这些发现表明该分离株具有耐盐性而非嗜盐性。
图1c 所选分离株在不同NaCl浓度（1–5%）下的生长动力学，显示在1% NaCl下生长最佳
【数据】最佳生长NaCl浓度：1%；最高耐受NaCl浓度：5%；生长趋势：随盐度增加逐渐下降
#### 基于16S rRNA基因测序的分子鉴定
所选分离株的16S rRNA基因PCR扩增产生单一清晰条带，经琼脂糖凝胶电泳验证。纯化的扩增子成功测序，所得部分16S rRNA基因序列已提交至GenBank数据库，登录号为PX992226。使用NCBI的BLAST算法进行序列相似性分析，结果显示与B. sonorensis序列100%一致。基于最高序列同一性和系统发育聚类，该分离株被鉴定为B. sonorensis，并命名为B. sonorensis 2MNHR。使用MEGA 12进行系统发育分析。构建的系统发育树表明，该分离株与B. sonorensis参考菌株稳健聚类，并与近缘种明显分开。该拓扑结构在矩形（14个类群）和环形（40个类群）两种树布局中一致，支持该分离株在芽孢杆菌属中的分类学位置。
图2 基于部分16S rRNA基因序列构建的系统发育树。a包含14个代表性类群的矩形树。b包含40个类群的环形树。所选分离株（B. sonorensis 2MNHR）以实心圆标记。树使用MEGA 12中的邻接法构建，1000次bootstrap重复，并在iTOL v6中优化
【数据】16S rRNA序列一致性：100%（与B. sonorensis）；GenBank登录号：PX992226；bootstrap重复：1000次；树中类群数：矩形树14个、环形树40个
生物源性SeNPs的表征
#### 紫外-可见光谱分析
细菌上清液和合成SeNPs的UV-可见光谱分析为纳米颗粒的成功生物合成提供了有力证据。最初，B. sonorensis 2MNHR生物合成SeNPs通过培养基颜色从淡黄色（对照）变为橙红色的明显变化被目视指示，表明亚硒酸钠被还原为元素硒（Se⁰）。细菌滤液的UV-Vis光谱在200–300 nm范围内表现出宽吸收带，具有高吸光度值（约3），反映了细菌上清液中存在多种生物分子。相比之下，纯化SeNPs的UV-Vis光谱在226 nm处显示明显的吸收峰，吸光度值较低（约1）。此外，纯化SeNPs的UV-Vis光谱在200–400 nm区域内显示出突出的吸收峰，并在约326 nm处伴随一个小肩峰。这些光谱特征是SeNPs的特征，支持亚硒酸钠成功生物转化为纳米级元素硒（Se⁰）。
图3 B. sonorensis 2MNHR在37°C培养72小时后a生物源性SeNPs和b细菌滤液的UV-Vis光谱
【数据】细菌滤液吸收带：200–300nm；吸光度：约3；SeNPs吸收峰：226nm；吸光度：约1；肩峰：约326nm；培养温度：37°C；培养时间：72h
#### 傅里叶变换红外光谱分析
细菌上清液的FTIR光谱在3460.19 cm⁻¹处表现出宽而强的吸收带，通常归属于蛋白质、肽和其他胞外生物分子产生的O–H和N–H伸缩振动。在2083.05 cm⁻¹处观察到的弱带可能与该上清液中弱结合官能团有关，可能反映脂质或蛋白质组分中脂肪链的C–H伸缩振动。此外，在1637.51 cm⁻¹处检测到明显峰，对应蛋白质的酰胺I带。在指纹区，观察到694.35和644.40 cm⁻¹处的峰，可归因于生物分子组分的骨架振动和有机成分的低频模式。作为比较，前体亚硒酸钠的FTIR光谱在441、746、1649、2185、3406和3431 cm⁻¹处表现出其特征吸收带。
图4 B. sonorensis 2MNHR产生的a生物源性SeNPs和b细菌滤液的傅里叶变换红外光谱
相比之下，生物合成SeNPs显示出多个前体相关带强度的显著降低，同时出现了亚硒酸钠光谱中不存在的新吸收峰。在3371 cm⁻¹处观察到以该位置为中心宽峰，可归因于O–H和N–H伸缩振动，表明存在通常与蛋白质相关的羟基和胺基。此外，在1517、1417、1379、1043、1001、956、833和507 cm⁻¹处也检测到额外峰，对应酰胺I和酰胺II振动、C–N伸缩及其他蛋白质相关或生物分子特征。这些光谱位移和新出现的谱带表明细菌生物分子（尤其是蛋白质）参与了亚硒酸钠的还原和所得SeNPs的稳定。这些发现证实了亚硒酸盐成功生物还原为元素硒（Se⁰），并表明细菌蛋白质可能在SeNP生物合成过程中同时发挥还原剂和稳定剂的双重作用。
【数据】上清液FTIR峰位：3460.19、2083.05、1637.51、694.35、644.40cm⁻¹；亚硒酸钠FTIR峰位：441、746、1649、2185、3406、3431cm⁻¹；SeNPs FTIR峰位：3371、1517、1417、1379、1043、1001、956、833、507cm⁻¹
#### Zeta电位分析
Zeta电位反映悬浮液中颗粒的净静电电荷，是胶体稳定性的关键决定因素。生物源性SeNPs表现出−38 mV的zeta电位，表明纳米颗粒悬浮液具有高稳定性。
图5 B. sonorensis 2MNHR合成的生物源性SeNPs的理化表征。a Zeta电位显示高度负表面电荷（−38 mV）和强胶体稳定性。b XRD图谱在2θ=25–35°处显示宽峰，表明无定形或弱结晶结构
【数据】Zeta电位：−38mV；XRD峰位：2θ=25–35°
讨论与解读
本研究描述了一株耐盐海洋菌株B. sonorensis 2MNHR的分离及其胞外生物合成SeNPs的能力。尽管该菌株分离自高盐海洋环境，但它在中等盐度（1% NaCl）下表现出最佳生长，表明其具有生理适应性而非严格嗜盐性。这种生长模式是耐盐芽孢杆菌物种的特征，它们能够在广泛盐度范围内生长而不需要高盐浓度。例如，B. subtilis HG-15已被报道可耐受高达30%的NaCl。这种灵活性通常归因于高效的渗透适应机制，包括相容性溶质的积累和膜转运系统的调节。因此，我们的分离株在中等盐度下生长同时耐受亚硒酸盐胁迫的能力，突显了其在盐浓度波动环境中生物技术应用的适用性。值得注意的是，这并不是埃及首次报道B. sonorensis谱系。相关菌株先前已从马特鲁港和西奈半岛法老浴温泉中分离到，这种地理分布表明该物种在地中海沿岸环境中广泛存在。
编译者解读
该研究展示了一条完整的"海洋菌株筛选—表型验证—纳米颗粒表征—抗菌活性评估"技术链条。方法学上的亮点在于通过无细胞上清液测定明确了硒还原的胞外机制，为后续无细胞酶法合成提供了可能。FTIR和GC-MS联用揭示蛋白质等生物分子在还原与稳定中的双重角色，这为理性设计高效硒纳米合成菌株提供了分子线索。然而，SeNPs的粒径分布（80–200 nm）相对较宽，且抗菌机制尚停留在抑菌圈和MIC层面，未深入探究其破坏细菌细胞膜或诱导氧化应激的具体途径。后续研究若能结合蛋白质组学锁定关键还原酶，并系统评估SeNPs在体内环境中的稳定性与毒性，将推动其从实验室走向实际应用。
参考来源
Naga NG, Mabrouk MEM, Taha RM, Arayes MA, Al-Kordy HMH. Biogenic synthesis and characterization of selenium nanoparticles by halotolerant Bacillus sonorensis 2MNHR. Appl Microbiol Biotechnol. PMID: 42603172.
PMID: 42603172