来源：Co-Overexpression of Geissoschizine Synthase and Catharanthine Synthase Increases Catharanthine Biosynthesis in Catharanthus roseus Hairy Roots.（Plants (Basel)）| 编译：DNA Lab Space
导读
长春花来源的长春质碱与文多灵是合成抗肿瘤药物长春碱类的前体单体，但植物中含量极低，供应紧张。本研究在长春花毛状根中利用糖皮质激素诱导型启动子共过表达盖西苏碱合酶（GS）与长春质碱合酶（CS），在关键竞争分支节点实施代谢流重定向。结果显示，诱导96小时后长春质碱含量相对提高67%，同时竞争性副产物阿马里新、蛇根碱和他波宁显著下降。转录分析揭示了通路基因的协调调控，非靶向代谢组学则描绘了广泛的代谢重排图景。
研究背景
长春花是多种高临床价值植物次生代谢物的模式植物。长春花碱类生物碱仅由长春花生物合成，其衍生物是治疗白血病、淋巴瘤等实体瘤的强效化疗药物。工业生产依赖从植物中提取前体单体长春质碱与文多林，再经体外化学偶联。然而，这些前体在植物组织中含量极低（每克干重毫克级），导致药物成本高昂。全球需求上升叠加社会经济、地缘政治与气候因素，供应短缺频发。代谢工程与合成生物学为提高长春碱及其前体产量提供了有希望的策略。随着合成生物学进展和单萜吲哚生物碱（MIA）生物合成通路的全面解析，微生物尤其是酵母已成为异源生产这些化合物的候选宿主。
研究方法
4.1 克隆构建
质粒pTA7002用于载体构建。从长春花品种“Little Bright Eyes”幼苗中提取总RNA，使用PrimeScript™ RT Reagent Kit with gDNA Eraser（Takara Bio）反转录为cDNA。使用Q5® High-Fidelity DNA Polymerase（New England BioLabs）扩增GS（Gene ID: MF770507.1）和CS（Gene ID: MF770512.1）的编码序列。每个片段使用ClonExpress® MultiS One Step Cloning Kit（Vazyme Biotech）独立克隆至中间载体pUCGALA。使用XhoI和SpeI（NEB）从pUCGALA/GS切下GS片段，用T4 DNA连接酶（Takara Bio）连接至pTA7002，生成pTA7002/GS。随后用SbfI从pUCGALA/CS切下CS表达盒，插入pTA7002/GS，生成共表达载体pTA7002/GS/CS。通过测序确认最终构建体中两个基因的方向和序列正确。所得表达质粒pTA7002/GS/CS经电穿孔导入发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）菌株ATCC 15834，转化成功通过测序验证。
【数据】质粒：pTA7002；菌株：A. rhizogenes ATCC 15834；基因ID：GS—MF770507.1，CS—MF770512.1；工具酶：XhoI、SpeI、SbfI；转化方法：电穿孔
4.2 长春花毛状根的产生、培养与诱导
携带共表达质粒pTA7002/GS/CS的发根农杆菌ATCC 15834在1 mL YMB培养基中于28°C、225 rpm条件下培养至OD达到0.5。无菌镊子浸入菌悬液后，用于长春花幼苗茎部穿刺接种，操作参照Bhadra等人建立的方案。毛状根培养方法如前所述。处于晚期指数生长期（继代后18天）的根分为两组：诱导组用3 μM地塞米松处理，未诱导对照组用等体积乙醇处理。诱导后0、24、48、72、96小时采集样品，每组每个时间点设三个生物学重复，即同一克隆转基因系的三个独立培养与提取重复。
【数据】培养基：YMB；温度：28°C；转速：225 rpm；OD：0.5；诱导剂：3 μM地塞米松；时间点：0、24、48、72、96 h；生物学重复：3
4.3 生物碱提取与HPLC分析
收获的根吸干水分，液氮速冻，冷冻干燥（Scientz-100F）。约50 mg冻干组织匀浆后，用30 mL甲醇超声提取（Sonicator S4000）10分钟。离心（6000 rpm，15分钟，4°C）后，上清液经真空浓缩器浓缩至2 mL，经0.22 μm尼龙膜过滤器过滤，转移至自动进样瓶进行HPLC分析。长春质碱、阿马里新、蛇根碱和他波宁购自TargetMol（上海）。标准品和样品通过Agilent SB-C18色谱柱（1.8 μm，2.1 × 100 mm）在HPLC系统（SHIMADZU）上分离，方法如前所述。采用双因素方差分析（two-way ANOVA）后进行Tukey HSD检验评估显著性差异（p < 0.05）。
【数据】样品量：50 mg冻干组织；提取溶剂：30 mL甲醇；超声时间：10 min；离心：6000 rpm，15 min，4°C；浓缩体积：2 mL；滤膜：0.22 μm尼龙膜；色谱柱：Agilent SB-C18（1.8 μm，2.1 × 100 mm）；统计方法：two-way ANOVA + Tukey HSD，p < 0.05
4.4 RT-qPCR扩增与基因表达分析
从新鲜毛状根中提取总RNA并反转录为cDNA，方法同前。每个qPCR反应含1 μL稀释cDNA、0.8 μL引物混合液、10 μL 2× SYBR qPCR Master Mix（Vazyme Biotech）及无核酸酶水。qPCR所用引物列于补充表S1。扩增使用BIO-RAD CFX Connect™实时PCR检测系统，程序如下：95°C 10分钟；40个循环的95°C 15秒和60°C 1分钟。以40S核糖体蛋白S9（RPS9）作为参考基因，归一化基因表达和RNA提取效率的差异。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）后进行Tukey HSD检验评估显著性差异（p < 0.05）。
【数据】qPCR体系：1 μL cDNA + 0.8 μL引物 + 10 μL 2× SYBR Mix；程序：95°C 10 min；40×（95°C 15 s；60°C 1 min）；内参基因：RPS9；统计方法：one-way ANOVA + Tukey HSD，p < 0.05
4.5 LC-MS代谢组学分析
代谢组学分析使用未诱导对照组和72小时诱导组的三个独立培养重复。样品处理和代谢组学分析由武汉迈特维尔生物科技有限公司完成。约50 mg长春花毛状根粉末用1.2 mL 70%甲醇提取。样品每30分钟涡旋30秒，共6次，然后以12,000×g离心3分钟。所得上清液经微孔膜（0.22 μm孔径）过滤。从每个样品中取10 μL等量混合制备质控（QC）样品。代谢物分析使用UPLC系统（SHIMADZU Nexera X2）联用串联质谱仪（SCIEX P 6500 QTRA）。色谱分离使用SB-C18色谱柱（Agilent，100 mm × 2.1 mm，1.8 μm）。质谱、代谢物鉴定和定量按照武汉迈特维尔生物科技有限公司的标准流程进行，如Chen等人所述。
代谢物数据通过R软件包MetaboAnalystR 2.0进行正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）、聚类分析和Pearson相关性分析。鉴定到的代谢物进行OPLS-DA建模；差异代谢物基于VIP > 1和|Log2FC| ≥ 1.0筛选。通路富集分析使用自定义Perl脚本实现超几何检验，评估差异积累代谢物在各通路中的分布是否显著偏离随机期望。背景集定义为所有检测到且在KEGG数据库成功注释的代谢物的并集。所有检测到的代谢物映射至通用植物参考通路。未设置最小通路大小过滤；包含至少一个背景代谢物的所有通路均纳入分析。计算每条通路的原始p值，并使用Benjamini–Hochberg错误发现率（FDR）程序进行多重假设检验校正。显著富集采用探索性阈值原始p < 0.05，以保留发现生物学相关代谢变化的能力。
【数据】样品量：50 mg粉末；提取液：1.2 mL 70%甲醇；涡旋：30 s/30 min × 6次；离心：12,000×g，3 min；滤膜：0.22 μm；进样量：10 μL；色谱柱：SB-C18（100 mm × 2.1 mm，1.8 μm）；差异代谢物筛选：VIP > 1，|Log2FC| ≥ 1.0；富集阈值：raw p < 0.05
研究结果
2.1 GS/CS转基因毛状根的获得
使用携带双元载体pTA7002/GS/CS的发根农杆菌ATCC15834转化长春花幼苗。感染后，诱导产生的毛状根切下，在含300 mg/L头孢噻肟和30 μg/mL潮霉素的固体培养基上选择性培养。随后选择四个生长旺盛的毛状根系进行继代培养并适应液体培养基。最初选定的四个毛状根系中，三个因生长欠佳和表现不稳定被排除。剩余的一个根系表现出快速的生物量积累和稳定的液体培养适应性，成功建立用于后续遗传验证和代谢谱分析。从选定根系提取基因组DNA，使用靶向GS和CS转录单元的引物进行PCR。两个片段的阳性扩增证实了遗传转化的成功（图1）。
GS和CS基因均置于糖皮质激素诱导型启动子控制下，使我们能够在同一遗传背景下研究诱导表达相对于对照的影响。该系统还允许将生长与次生代谢物生产分开。液体培养基中继代培养18天的毛状根用3 μM地塞米松处理0、24、48、72或96小时以诱导基因表达；对照样品接受等体积乙醇。RT-qPCR分析显示，地塞米松诱导72小时使GS mRNA水平较对照增加18倍，而延长诱导至96小时未导致进一步升高。与此同时，CS mRNA在诱导后48小时达到峰值，显示8.6倍增强（图2）。
【数据】筛选抗生素：300 mg/L头孢噻肟 + 30 μg/mL潮霉素；诱导剂：3 μM地塞米松；GS mRNA峰值：72 h，18倍；CS mRNA峰值：48 h，8.6倍
2.2 转基因长春花毛状根中MIA积累
长春质碱是本研究的靶标代谢物，是合成长春花碱类抗癌药物的直接前体，也是其工业生产中的关键原料。在长春花毛状根中过表达GS和CS不同时长后，通过HPLC定量长春质碱及MIA通路中的一些竞争性生物碱。HPLC定量所用校准曲线见补充图S1。与对照相比，诱导后24小时和48小时长春质碱含量未显著增加。然而，诱导72小时和96小时后，长春质碱水平分别显著升高37%和67%。最高长春质碱浓度（1.98 ± 0.21 mg/g DW）出现在诱导96小时后。相反，GS和CS共过表达导致上游竞争通路来源的阿马里新和蛇根碱积累减少。阿马里新水平逐渐下降，在24小时、48小时、72小时和96小时分别较对照降低14%、12%、39%和40%。蛇根碱呈现相似趋势，24小时和48小时保持不变，72小时和96小时分别下降14%和17%。他波宁及其衍生物属于白坚木型生物碱。他波宁衍生分支构成长春质碱生物合成的另一个竞争通路，其中他波宁合酶（HL2）竞争前体二氢前冠罂粟碱乙酸酯。如图3所示，诱导后24小时和48小时他波宁含量与对照无显著差异。然而，延长诱导至72小时和96小时后，他波宁产量分别下降34%和45%。综上，这些发现表明GS和CS共过表达减少了竞争分支中代谢物的积累，同时增强了长春质碱的产生。
【数据】长春质碱：72 h提高37%，96 h提高67%；最高含量：1.98 ± 0.21 mg/g DW（96 h）；阿马里新下降：24 h—14%，48 h—12%，72 h—39%，96 h—40%；蛇根碱下降：72 h—14%，96 h—17%；他波宁下降：72 h—34%，96 h—45%
2.3 GS和CS过表达对MIA通路基因的影响
MIA通路基因的过表达通常触发跨通路的复杂转录响应。为在转录水平评估长春质碱生产的代谢工程策略，我们检测了长春花毛状根中MIA生物合成基因和调控因子对GS和CS过表达的响应。
位于GS上游的异胡豆苷合酶（STR）和异胡豆苷β-D-葡萄糖苷酶（SGD）在所检测的四个诱导时间点均上调（图4A）。STR在诱导72小时显示峰值上调（3.6倍），而SGD mRNA水平在96小时达到最大增加（103%）（图4A）。在催化GS与CS之间转化的酶中，出现了不同的表达模式。盖西苏碱氧化酶（GO）表达逐渐增加，在72小时达到峰值后于96小时下降。还原酶2（Redox2）表达在96小时达到最高水平（对照的2.8倍）。O-乙酰基前冠罂粟碱氧化酶（ASO）在24小时、48小时和96小时上调，但在72小时无显著变化。还原酶1（Redox1）在24小时显示急剧上调（3.2倍），至48小时减弱，在后期诱导时间段变得不显著（图4A）。值得注意的是，前冠罂粟碱-O-乙酰转移酶（SAT）表达显著下调（48小时为0.7倍，72小时为0.5倍），提示其可能构成GS和CS共过表达后长春质碱积累的瓶颈（图4A）。
在长春质碱生物合成的上游竞争分支中，四氢鸭脚木碱合酶（THAS）、阿马里新合酶（AS）、异育亨宾合酶（HYS）和蛇根碱合酶（SS）的表达受GS和CS过表达影响。THAS和AS编码参与阿马里新生物合成的酶，在24小时显示短暂显著增加，随后在后期时间点逐渐下调。至96小时，其表达达到最低水平（THAS为对照的0.6倍，AS为对照的0.3倍）（图4B）。参与阿马里新和蛇根碱生物合成的HYS和SS在大多数诱导期间在诱导根系中表达持续降低。最强抑制出现在HYS 24小时（对照的0.4倍）和SS 96小时（对照的0.6倍）（图4B），表明阿马里新和蛇根碱产量降低源于这些分支通路基因的协调下调。
HL2/TS、HL3和HL4编码将中间产物转向他波宁和长春碱胺生产的竞争通路酶。RT-qPCR分析显示，HL2/TS表达在诱导根中48小时、72小时和96小时显著下调，与72小时和96小时观察到的他波宁水平降低相关。类似地，HL3表达在所有检测时间段在诱导根中显著降低，在72小时达到最低（对照的0.3倍）（图4B）。下游MIA通路基因他波宁6,7-环氧酶（TEX1）、他波宁19-羟化酶（T19H）、他波宁衍生物19-O-乙酰转移酶（TAT）、长春碱胺19-水解酶（V19H）和米诺文辛19-羟基-O-乙酰转移酶（MAT）将他波宁或长春碱胺转化为根特异性生物碱，如荷哈默里辛、米诺文辛和刺木文辛。TEX1 mRNA水平在诱导根中持续高于对照。相比之下，T19H和TAT呈现复杂表达模式。T19H在24小时和72小时上调（分别为3.0倍和1.3倍），但在48小时和96小时下调（分别为对照的0.7倍和0.5倍）。类似地，TAT表达在24小时和48小时增加（分别为1.3倍和1.6倍），但在72小时和96小时降低（分别为对照的0.7倍和0.8倍）（图4B）。催化长春碱胺转化为刺木文辛的V19H和MAT在所有时间点在诱导根中表达显著降低，表明该下游分支通路响应GS和CS过表达而下调。
【数据】STR峰值：72 h，3.6倍；SGD峰值：96 h，+103%；Redox2峰值：96 h，2.8倍；Redox1峰值：24 h，3.2倍；SAT下调：48 h—0.7倍，72 h—0.5倍；THAS最低：96 h，0.6倍；AS最低：96 h，0.3倍；HYS最低：24 h，0.4倍；SS最低：96 h，0.6倍；HL3最低：72 h，0.3倍；T19H：24 h—3.0倍，72 h—1.3倍，48 h—0.7倍，96 h—0.5倍；TAT：24 h—1.3倍，48 h—1.6倍，72 h—0.7倍，96 h—0.8倍
2.4 GS和CS基因过表达对MIA通路调控因子的影响
【数据】原文未详述
2.5 代谢组学分析
【数据】原文未详述
2.6 MIA通路整合图谱
【数据】原文未详述
讨论与解读
本研究验证了竞争分支点分流策略在长春花毛状根中的有效性。GS和CS共过表达使长春质碱积累在72小时和96小时分别提高37%和67%，同时减少了阿马里新、蛇根碱和他波宁等竞争副产物的积累。转录分析揭示了通路基因的协调响应——核心MIA生物合成基因短暂上调，部分竞争分支基因受到抑制。然而，整体产量提升受到严格调控的限制，特别是BIS转录激活因子的下调限制了上游萜类前体的供应。非靶向代谢组学揭示了广泛的代谢变化，其中苯丙氨酸来源的次级代谢通路显著富集。这些结果证明了竞争分支点分流策略对目标生物碱富集的有效性，同时凸显了长春花网络中复杂的调控动态和广泛的代谢改变。
编译者解读
本研究巧妙地将代谢工程干预点设在GS/CS这一关键分支节点，而非传统的上游基因或全局调控因子，体现了"疏导而非加压"的策略思路。诱导型启动子的设计使生长与产物合成解耦，便于在同一遗传背景下进行时间序列分析。值得注意的是，尽管靶标产物显著提升，但上游前体供应受限和SAT潜在瓶颈提示单点干预的局限。代谢组学揭示的苯丙氨酸通路富集表明，代谢重定向可能引发全网络范围的资源再分配。未来若将分支点分流策略与上游前体供给增强（如BIS激活）相结合，有望突破当前产量天花板。该方法对其它植物来源天然产物的代谢工程改造具有借鉴意义。
参考来源
Li X, Li G, Hu Z, Wang J, Chen Y. Co-Overexpression of Geissoschizine Synthase and Catharanthine Synthase Increases Catharanthine Biosynthesis in Catharanthus roseus Hairy Roots. Plants (Basel). PMID: 42514587.
PMID: 42514587