来源：Extracellular Vesicles from Kluyveromyces marxianus as Potential Postbiotics Against Candida albicans Vaginal Infections.（Pathogens）| 编译：DNA Lab Space
导读
念珠菌性外阴阴道炎（VVC）的耐药问题日益严峻，活菌益生菌制剂的临床应用又存在安全隐患。本研究从手工酸面团中分离的一株具有益生特性的马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）培养上清中提取细胞外囊泡（EVs），系统表征其物理性质与蛋白质组学特征，并验证其对氟康唑耐药白色念珠菌的拮抗活性及安全性。结果显示，该酵母 EVs 平均直径 157.7 nm，携带 100 种蛋白质，能抑制白色念珠菌浮游生长、生物膜形成及对阴道上皮细胞的黏附与侵袭，并调节宿主细胞因子分泌。本研究首次报道 K. marxianus 产生 EVs，为开发无细胞后生元制剂提供了新选项。
研究背景
益生菌的传统研究聚焦于活菌本身，而当前视角正扩展至其产生的组分与代谢产物。国际益生菌与益生元科学协会（ISAPP）将"后生元"定义为"灭活微生物和/或其组分的制剂，对宿主健康有益"。微生物来源的细胞外囊泡（EVs）是后生元中极具前景的一个亚类——这些双层纳米结构由包括细菌和真菌在内的所有细胞分泌至周围环境中，被认为是介导健康益处的重要因子。活菌益生素的广泛使用已暴露出若干安全性问题：在极低出生体重新生儿、重症监护患儿、术后住院及免疫受损患者中，益生菌使用与菌血症和真菌血症相关的感染及发病风险升高有关。目前文献多集中于乳酸菌 EVs 的功能研究，而益生性酵母 EVs 的探索尚处于起步阶段。
研究方法
菌株与培养条件
本研究所用马克斯克鲁维酵母菌株分离自家庭自制酸面团，如前所述。菌株保存于 YPD 琼脂培养基（1% w/v 酵母提取物、2% w/v 细菌蛋白胨（Gibco, Life Technologies Co., Detroit, MI, USA）、2% w/v 葡萄糖、2% w/v 琼脂（Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA））。K. marxianus 预培养和培养均在含 YPD 培养基的摇瓶中进行，从单菌落出发，30°C、200 rpm 培养 24 小时。本研究所用白色念珠菌菌株为临床分离的氟康唑耐药菌株 C19，分离自 VVC 患者，该菌株可代表一系列对活 K. marxianus 细胞作用已呈现相似反应的氟康唑耐药菌株。C19 菌株在 YPD 培养基中 37°C 培养。
【数据】培养基：YPD；K. marxianus 培养温度：30°C；转速：200 rpm；时间：24h；C. albicans 培养温度：37°C
EVs 分离与表征
EVs 从 K. marxianus 在 YPD 培养基中培养 24 小时的上清中分离。首先，培养上清经 8000 g、4°C 离心 20 分钟去除细胞和碎片。所得无细胞上清使用截留分子量 100 kDa 的 Amicon 超滤装置（Merck, Darmstadt, Germany）浓缩，随后通过孔径 0.45 µm 的 Ultrafree-CL 离心过滤器（Sigma-Aldrich）过滤。为验证真菌细胞完全去除，将过滤后上清的等分试样涂布于 YPD 琼脂平板并培养监测酵母生长。浓缩过滤后的上清随后在 100,000 g、4°C 超速离心 1 小时。所得沉淀用无菌 PBS 洗涤一次，重复相同条件的超速离心步骤。最终 EVs 沉淀重悬于 100 µL 无菌 PBS 中。所有超速离心步骤均使用配备 TLA 100.3 转头的 Optima MAX-XP 超速离心机（Beckman Coulter, Brea, CA, USA）完成。分离的 EVs 于 −80°C 保存至进一步分析。
EV 表征采用纳米颗粒跟踪分析（NTA）技术。EV 粒径分布和浓度使用 Nanosight NS300 平台（Malvern Panalytical, Malvern, UK）测量，该平台配备 sCMOS 相机和绿色激光器，由 NTA 软件 v. 3.4 控制运行。样品以 1:100 比例在 PBS 中稀释，相机级别设为 16，检测阈值设为 4。记录视频以可视化每个样品中的 EVs。动态光散射（DLS）使用 Zetasizer Nano-ZS（Malvern Instruments, Worcestershire, UK）测量 EVs 的 zeta 电位。样品在 PBS 中以 X 浓度制备。测量在 25°C 下使用 4 mW He–Ne 激光器（633 nm）进行，固定散射角为 173°。
【数据】离心：8000 g/20 min/4°C；超滤截留：100 kDa；过滤孔径：0.45 µm；超速离心：100,000 g/1h/4°C；重悬体积：100 µL PBS；NTA 稀释：1:100；相机级别：16；检测阈值：4；DLS 温度：25°C；激光：4 mW He-Ne 633 nm；散射角：173°
蛋白质提取、分离与酶解
蛋白质提取在 K. marxianus EVs 的两个生物学重复样本上进行。样品平行裂解，使用含 8 M 尿素和 1% w/v SDS 的缓冲液，并添加 1:10 v/v 比例的 Complete EDTA-free 蛋白酶抑制剂混合物（Roche, Mannheim, Germany）。为确保最大程度破碎，EVs 首先在冰上探头超声处理（0.3 循环）2 分钟，随后进行两轮各 2 分钟的水浴超声。再在冰上孵育 30 分钟后，裂解液经 6000 g、4°C 离心 15 分钟澄清。最后，使用 Pierce BCA 蛋白质测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA）按制造商说明书测定蛋白质浓度。随后蛋白质用 6 倍体积的冷丙酮在 −20°C 沉淀过夜。沉淀后，蛋白质经 8000 g、4°C 离心 20 分钟收集，然后用 SpeedVac 旋转蒸发仪（Thermo Fisher Scientific）真空干燥。回收的蛋白质在还原条件下经 12% T SDS-PAGE 分离。胶体考马斯亮蓝染色和脱色后，每个凝胶泳道切为 15 个切片。这些切片经捣碎、水和乙腈洗涤，随后用 10 mM 二硫苏糖醇还原蛋白，55 mM 碘乙酰胺（均溶于 100 mM NH₄HCO₃）烷基化。随后使用胰蛋白酶（12.5 ng/µL 溶于 50 mM NH₄HCO₃）进行胶内酶解。所得肽混合物用 ZipTip μC18（Millipore, Burlington, MA, USA）纯化和浓缩，真空干燥，最终重悬于 5% v/v 甲酸中。
【数据】裂解缓冲液：8 M 尿素 + 1% w/v SDS；蛋白酶抑制剂：1:10 v/v；探头超声：0.3 循环/冰上/2 min；水浴超声：2×2 min；冰上孵育：30 min；离心：6000 g/15 min/4°C；丙酮沉淀：6 倍体积/−20°C/过夜；离心：8000 g/20 min/4°C；SDS-PAGE：12% T；还原剂：10 mM DTT；烷基化：55 mM IAA（100 mM NH₄HCO₃）；胰蛋白酶：12.5 ng/µL（50 mM NH₄HCO₃）
#### 质谱分析
肽混合物通过 nanoUltraHighPressure 液相色谱（nUHPLC）-电喷雾（ESI）-Q-Orbitrap-MS/MS 平台表征，该系统由 Vanquish-Neo 纳升色谱仪（Thermo Fisher Scientific）通过 easy-spray 离子源连接 Exploris 480 质谱仪（Thermo Fisher Scientific）组成。肽段上样至 EASY-Spray C18 色谱柱（250 mm × 75 μm 内径，2 μm 颗粒，100 Å 孔径）（Thermo Fisher Scientific），以溶剂 B（19.92/80/0.08 v/v/v 水/乙腈/甲酸）在溶剂 A（99.9/0.1 v/v 水/甲酸）中的梯度洗脱，流速 250 nL/min。溶剂 B 梯度从 6% 开始，90 分钟内增至 31%，5 分钟内增至 50%，5 分钟内增至 95%，在 95% 保持 8 分钟，最后回到 6% 进行平衡步骤。质谱仪以数据依赖性采集模式运行，在 375–1200 的扫描 m/z 范围内收集正离子 MS 谱图，标称分辨率 120,000 半峰全宽（FWHM），自动增益控制（AGC）目标 3 × 10⁶ 离子，最大注入时间（IT）50 ms，动态排除值 45 s，随后对 20 个最丰富离子进行 MS/MS 扫描。MS/MS 谱图使用归一化碰撞能量（HCD）30%、分辨率 15,000 FWHM、AGC 目标 2 × 10⁵ 离子、最大 IT 100 ms 采集。
【数据】色谱柱：EASY-Spray C18（250 mm × 75 μm ID，2 μm 颗粒，100 Å）；流速：250 nL/min；梯度：6%→31%（90 min）→50%（5 min）→95%（5 min）→95%（8 min）→6%；MS 扫描范围：m/z 375–1200；分辨率：120,000 FWHM；AGC：3×10⁶；最大 IT：50 ms；动态排除：45 s；MS/MS：HCD 30%，分辨率 15,000 FWHM，AGC 2×10⁵，最大 IT 100 ms
#### 生物信息学分析
蛋白质鉴定中，原始质谱数据使用 Proteome Discoverer 软件（v. 3.1, Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA）处理。数据库搜索由 Mascot 算法（v. 2.4.2, Matrix Science, London, UK）针对 K. marxianus UniProtKB 序列数据库（48,266 个蛋白质条目，含常见污染物）进行。搜索参数设置如下：胰蛋白酶为蛋白水解酶，最大漏切位点数为 2；半胱氨酸的脲甲基化设为固定修饰，甲硫氨酸氧化、天冬酰胺和谷氨酰胺脱酰胺、N 端谷氨酰胺焦谷氨酸化设为可变修饰。前体和碎片质量容差分别设为 ±10 ppm 和 ±0.02 Da。蛋白质鉴定置信标准要求至少 1 个唯一肽段、2 个肽段-谱图匹配（PSMs）和 Mascot 评分 ≥ 25。所有分配结果经人工谱图检查进一步验证，并过滤至 1% 假发现率（FDR）。
蛋白质组数据已存入 ProteomeXchange 联盟。蛋白质组数据集已存入 PRIDE 数据库，标识符为 PXD078607，可通过 https://www.ebi.ac.uk/pride/archive/projects/PXD078607/public 公开访问（访问日期 2026 年 5 月 20 日）。已鉴定的 K. marxianus 囊泡蛋白根据文献与已归属至其他生物的 EVs 组分相关联。已鉴定的 K. marxianus 囊泡蛋白间的功能关系使用 STRING 软件（v. 12.0）分析和可视化。功能富集、亚细胞定位和生物学通路分析使用整合的 STRING 资源进行，包括 Gene Ontology（GO）、COMPARTMENTS 和 Reactome（版本 12.0）软件。
【数据】数据库：K. marxianus UniProtKB（48,266 条目）；酶：胰蛋白酶；最大漏切：2；固定修饰：半胱氨酸脲甲基化；可变修饰：甲硫氨酸氧化、天冬酰胺/谷氨酰胺脱酰胺、N 端谷氨酰胺焦谷氨酸化；前体容差：±10 ppm；碎片容差：±0.02 Da；鉴定标准：≥1 独特肽段、≥2 PSMs、Mascot ≥ 25；FDR：1%；PRIDE 标识符：PXD078607
A-431 细胞
人上皮 A-431 细胞系来源于阴道（原文此段未完整呈现，后续操作细节原文未详述）。
【数据】细胞系：A-431（人阴道上皮来源）；其余参数原文未详述
研究结果
益生酵母 *K. marxianus* EVs 的分离与表征
按照实验部分所述方法从酵母培养上清中分离 K. marxianus EVs 后，将重悬沉淀经纳米颗粒跟踪分析（NTA）检测。分析清晰显示样品中存在 EVs，估计浓度为 2.5 × 10¹⁰ 颗粒/mL，平均直径为 157.7 nm。经 DLS 测量的 EVs zeta 电位值为 −3.55 ± 0.62 mV。
【数据】EVs 浓度：2.5×10¹⁰ 颗粒/mL；平均直径：157.7 nm；zeta 电位：−3.55 ± 0.62 mV
蛋白质组学分析
为表征 K. marxianus EVs 的蛋白质货物，进行了全面的蛋白质组学分析。简言之，囊泡蛋白经提取和 SDS-PAGE 分离，随后进行胶内胰蛋白酶酶解。所得肽段经 nUHPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS/MS 分析；随后的质谱数据生物信息学分析共鉴定出 100 种 K. marxianus 蛋白质（补充表 S1）。根据文献报道，其中 76 种蛋白质（占全部已分配分子的 76%）被认定为其他微生物（如白色念珠菌、耳念珠菌、酿酒酵母、新型隐球菌和格特隐球菌）EVs 蛋白质货物的组成成分。
为阐明 K. marxianus 囊泡蛋白质组的功能景观，使用 STRING 数据库构建了蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。采用中等置信度阈值（0.400）以确保功能关联集合的全面性和代表性。所得网络包含 94 种蛋白质，呈现高度互联的结构。从拓扑学上看，网络的右侧簇表现出密集的相互交互网络，识别出一个可能参与紧密整合细胞活动的中央功能核心。相比之下，左侧部分呈现更线性和稀疏的拓扑结构，具有顺序连接，这是外围子模块或特化通路的特征。该组织的生物学相关性得到 PPI 富集 p 值 < 1 × 10⁻¹⁶ 的支持，证实观察到的连通性显著高于随机预期。
此外，对 K. marxianus 囊泡蛋白进行了功能富集分析，聚焦基因本体论（GO）类别，包括生物学过程（BP）、分子功能（MF）和细胞组分（CC）。关于 BP-GO 类别，观察到中心碳水化合物代谢的显著优势。糖酵解和己糖分解代谢等过程具有最高的统计显著性和基因计数，从而将其确定为数据集内的主要代谢驱动因素。这种代谢取向与真菌型细胞壁组织和生物合成密切协调。同样，在 MF-GO 富集分析中，检测到朝向水解酶活性的明显生化特化。最具统计显著性的术语与糖苷键断裂和 O-糖基化合物水解严格相关，表明细胞具有强大的复杂碳水化合物加工能力。同时，观察到与 1,3-β-葡聚糖转移酶和 β-葡萄糖苷酶活性相关的酶功能显著富集，提示囊泡蛋白在葡聚糖重塑中发挥关键作用——葡聚糖是真菌细胞壁的重要组分。最后，CC-GO 富集分析进一步强调与真菌表面和外部结构相关的蛋白质的强烈优势。最具统计显著性的术语为"外部包裹结构"和"真菌型细胞壁"，两者均呈现极高的 −log（FDR）值。此外，"细胞外区域"和"细胞外周"类别也观察到显著富集，其中后者拥有最高的基因计数。
亚细胞定位富集分析表明，已鉴定蛋白质主要与细胞内空间之外的区室相关。最具统计显著性的术语是细胞外区域和真菌型细胞壁，其 −log（FDR）值最高。尽管"细胞解剖实体"这一宽泛类别占蛋白质数量最多（基因计数），但细胞壁和细胞外区室的强富集进一步证实了细胞外大分子的性质及其功能特化。上述术语的富集，连同膜的锚定组分类别，提示了 K. marxianus EVs 的可能起源。为鉴定富集的生物学通路，进一步进行了基于 Reactome 的功能分析，利用结构和功能同源性将 K. marxianus 结果外推至人类通路。分析突出显示与能量代谢——特别是糖酵解、葡萄糖代谢和碳水化合物代谢——以及免疫激活（包括先天免疫、中性粒细胞脱颗粒和 MHC II 类抗原呈递）相关蛋白质的显著富集。这些结果表明 K. marxianus EVs 富含对碳水化合物和糖蛋白调节至关重要的蛋白质。这些蛋白质在细胞壁和细胞外环境中发挥作用，可能还有助于宿主免疫调节、细胞黏附和应激信号通路。
【数据】鉴定蛋白质总数：100；已知 EVs 组分蛋白：76（76%）；PPI 网络蛋白数：94；PPI 富集 p 值：<1×10⁻¹⁶；主要富集通路：糖酵解、己糖分解代谢、真菌型细胞壁组织、水解酶活性、1,3-β-葡聚糖转移酶、β-葡萄糖苷酶、外部包裹结构、细胞外区域、细胞外周、先天免疫、中性粒细胞脱颗粒、MHC II 类抗原呈递
EVs 体外和体内安全性评估
从 EVs 作为后生元的潜在应用角度出发，评估制剂的安全性必不可少。因此，我们使用阴道上皮 A-431 细胞系在体外测试了 K. marxianus EVs 的细胞毒性，测量了细胞代谢活性和乳酸脱氢酶（LDH）释放——一种上皮细胞损伤指标——在不同 EVs 密度暴露后释放至周围培养基中的量。两项测试均证实 K. marxianus EVs 对所检测的人细胞模型无毒性，因为暴露于高达 10¹⁰ 颗粒/mL EVs 的细胞代谢活性与对照相比保持不变，相应的 LDH 释放与酶的自发释放相当。
为在体内测试 EVs 的安全性，我们使用常用的 Galleria mellonella 动物模型。注射密度范围为每只幼虫 10⁶ 至 10¹⁰ 个 EVs 的幼虫监测 3 天；与对照组相比，这些组别均未观察到显著的存活率损失。仅在注射最高密度 EVs（每只幼虫 10¹⁰ 个 EVs）的幼虫组中观察到轻微但统计学上不显著的存活率降低。
【数据】体外细胞毒性：EVs 浓度最高 10¹⁰ 颗粒/mL，细胞代谢活性与对照无差异，LDH 释放与自发释放相当；体内安全性：10⁶–10¹⁰ EVs/幼虫，3 天监测无显著存活率损失；最高剂量组（10¹⁰ EVs/幼虫）存活率轻微下降但无统计显著性
EVs 对白色念珠菌的拮抗活性
K. marxianus EVs 的拮抗活性通过一系列实验评估，旨在研究这些囊泡对某些特征的影响，如液体培养中白色念珠菌的生长和病原体体外生物膜形成，以及 A-431 细胞中的黏附和侵袭。所有测试均使用氟康唑耐药临床菌株 C19。
生长分析是评估制剂拮抗特性的核心特征。结果表明 K. marxianus EVs 可以阻碍 C. albicans C19 生长曲线的进展，且该效应呈剂量依赖性。EVs 的生长抑制导致孵育期结束时使用两种 EVs 剂量（分别为 1.3 × 10¹⁰ 和 6.0 × 10⁹ 囊泡/mL）的生物量较对照降低 43% 和 27%。
【数据】EVs 剂量：1.3×10¹⁰ 和 6.0×10⁹ 囊泡/mL；生物量降低：43% 和 27%（相对于对照）；效应：剂量依赖性生长抑制
（原文结果部分在此处截断，后续关于 EVs 对生物膜形成、黏附/侵袭、细胞因子调节及 SAP2/SAP6 基因表达影响的详细结果数据，在原文节选中未完整呈现。）
【数据】后续结果数据原文节选未完整呈现
讨论与解读
本研究基于一个核心假设：益生微生物产生的 EVs 可在一定程度上保留母体微生物的有益特性，从而作为活菌制剂的无细胞替代方案。研究者从一株新近分离的益生 K. marxianus 菌株的培养上清中分离并表征了 EVs 群体。据作者所知，这是首次报道 K. marxianus 产生 EVs。选择 24 小时培养物进行 EVs 分离，与近期文献报道一致——24 小时培养较 72 小时培养可分泌更多 EVs。所得 EVs 直径处于其他酵母物种 EVs 群体的报道范围内，而不同尺寸通常反映不同的生物发生机制。
该 K. marxianus 菌株此前已被证明对氟康唑耐药白色念珠菌具有拮抗活性，扩展了被提议作为 VVC 替代或补充治疗方案的益生酵母种类。白色念珠菌是人类真菌感染最常见的病原体，而 EVs 的蛋白质组学特征——富含糖酵解酶、细胞壁重塑酶和免疫调节相关蛋白——为其多重拮抗机制提供了分子层面的解释。
编译者解读
本研究将"后生元"概念从细菌拓展至益生性酵母，首次系统报道 K. marxianus EVs 的蛋白质组学特征与抗念珠菌功能。方法学上，NTA+DLS+蛋白质组学+体外/体内安全性+功能验证的完整链条值得借鉴，尤其是用蜡螟幼虫模型评估 EVs 安全性，成本低且符合 3R 原则。从合成生物学应用角度看，酵母 EVs 作为天然纳米载体，其"无细胞后生元"定位规避了活菌制剂的感染风险，但 EVs 量产工艺（超速离心依赖性）和标准化质控仍是产业化瓶颈。此外，EVs 对 C. albicans 的抑制作用是否源于特定蛋白货物（如糖苷水解酶家族成员）的直接抗菌活性，抑或通过宿主免疫调节间接实现，值得后续以工程化 EVs 策略加以解析。
参考来源
Imparato M, Buonanno A, Maione A, Matuozzo M, D'Ambrosio C. Extracellular Vesicles from Kluyveromyces marxianus as Potential Postbiotics Against Candida albicans Vaginal Infections. Pathogens. PMID: 42514994.
PMID: 42514994