来源：Detection of paralytic shellfish toxins and tetrodotoxins in shellfish using a single-cell biosensor based on patch clamp technology.（Arch Toxicol）| 编译：DNA Lab Space
导读
麻痹性贝类毒素（PSTs）与河鲀毒素（TTXs）是两类强效神经毒素，可同时富集于贝类组织中，对食品安全构成双重威胁。现有法规监测体系仅覆盖PSTs，而TTXs在多数欧盟国家尚未纳入常规监测。本研究开发了一种基于自动化膜片钳（APC）技术的单细胞生物传感器，利用Neuro-2a细胞的电压门控钠通道电流抑制效应，实现了两类毒素及其类似物的同步检测，检出限远低于现行监管限量，并在70余份实际样品中验证了其与参考方法的相关性。
研究背景
全球海产品需求持续增长，贝类因其高营养价值、高生产效率和较低环境足迹而扮演关键角色。然而，贝类的滤食特性使其极易富集海洋毒素。麻痹性贝类中毒（PSP）由摄入含石房蛤毒素（STX）及其类似物（统称PSTs）的贝类引起，这类毒素主要来源于亚历山大藻属等有毒甲藻的有害藻华。PSTs通过特异性阻断电压门控钠通道（VGSCs）发挥毒性作用。值得警惕的是，TTXs与PSTs共享相同的生物学靶点和作用机制，两者可同时存在于贝类中，构成叠加的神经毒性风险。现行法规仅针对PSTs设定监管限量（800 µg STX当量/kg），而TTXs未纳入常规监测，这一监管空白亟需填补。本研究提出以自动化膜片钳单细胞生物传感器作为毒理学分析工具，旨在实现两类毒素的同步检测。
研究方法
毒素标准品
STX及其类似物的认证参考标准品，包括脱氨甲酰基石房蛤毒素（dcSTX）、新石房蛤毒素（NEO）、脱氨甲酰基新石房蛤毒素（dcNEO）、N-磺基氨甲酰基膝沟藻毒素1和2（C1&2）、N-磺基氨甲酰基膝沟藻毒素3和4（C3&4）、膝沟藻毒素1和4（GTX1&4）、膝沟藻毒素2和3（GTX2&3）、脱氨甲酰基膝沟藻毒素2和3（dcGTX2&3）、膝沟藻毒素5（GTX5）和膝沟藻毒素6（GTX6），均购自CIFGA（西班牙卢戈）。TTX购自Tocris Bioscience（英国布里斯托尔），标准溶液以1%乙酸（v/v）配制成1 mg/mL浓度。
APC单细胞生物传感器检测STX和TTX
使用APC单细胞生物传感装置，通过监测Neuro-2a细胞钠电流的抑制情况，在电生理水平评估STX和TTX的单独及联合毒性。
无论单独测试还是以1:1摩尔比联合测试，两种毒素均产生可比较的浓度依赖性抑制曲线（图1），表现出相同的半数抑制浓度（IC50）和高度相似的工作范围（IC20–IC80）。这些结果表明，在Neuro-2a细胞中，STX和TTX的毒性是等效且加性的。基于这一观察，本研究采用800 µg STX当量/kg的监管限量（Regulation (EC) No 853/2004）作为判断样品是否可安全食用的阈值。
STX和TTX类似物的毒性当量因子
通过APC单细胞生物传感装置监测Neuro-2a细胞钠电流抑制情况，评估dcSTX、NEO、C1&2、C3&4、GTX1&4、GTX2&3、dcGTX2&3、GTX5和GTX6在电生理水平的单独毒性。随后，毒性当量因子（TEFs）按STX的IC50值与各STX类似物IC50值的比值计算。
如图2所示，所有STX类似物均诱导Neuro-2a细胞钠电流的浓度依赖性抑制。然而，其毒性效力与STX并不等效。在受试的STX类似物中，NEO效力最强（TEFAPC = 1.546），其次为GTX1&4、GTX2&3、dcSTX、dcGTX2&3、C1&2、GTX6、dcNEO和GTX5，其TEFAPC均小于1（表1）。
表1列出了从Neuro-2a钠电流抑制曲线推导的PSTs和TTX的半数抑制浓度（IC50）及计算的毒性当量因子（TEFs）。为便于比较，同时给出了EFSA和FAO/WHO的TEF值。
TTX类似物的TEFAPC值先前已使用本研究所用相同的APC单细胞生物传感器在Neuro-2a细胞中测定（Reverté等，2024）。由于TTX和STX具有等效毒性，以STX替代TTX作为参考化合物不会改变先前确定的TEFAPC值。因此，TEFAPC值保持Reverté等（2024）所报道的结果：11-norTTX-6(S)-ol为0.238，11-deoxyTTX为0.107，6,11-dideoxyTTX为0.035，5,11-dideoxyTTX为0.027，5,6,11-trideoxyTTX为0.001。这些结果表明，除STX和TTX外，该生物传感器还能检测其毒性类似物。
研究结果
APC生物传感器对STX和TTX的检测
使用APC单细胞生物传感装置，通过监测Neuro-2a细胞钠电流抑制情况，在电生理水平评估了STX和TTX的单独及联合毒性。无论单独测试还是以1:1摩尔比联合测试，两种毒素均产生可比较的浓度依赖性抑制曲线（图1），表现出相同的IC50和高度相似的工作范围（IC20–IC80）。这些结果表明，在Neuro-2a细胞中，STX和TTX的毒性是等效且加性的。基于此，本研究采用800 µg STX当量/kg的监管限量（Regulation (EC) No 853/2004）作为判断样品安全性的阈值。
【数据】细胞系：Neuro-2a；毒素：STX、TTX；摩尔比：1:1；重复数：n=4；监管限量：800 µg STX当量/kg
STX和TTX类似物的毒性当量因子
通过监测Neuro-2a细胞钠电流抑制情况，评估了dcSTX、NEO、C1&2、C3&4、GTX1&4、GTX2&3、dcGTX2&3、GTX5和GTX6在电生理水平的单独毒性。TEFs按STX的IC50值与各类似物IC50值的比值计算。如图2所示，所有STX类似物均诱导浓度依赖性钠电流抑制，但毒性效力与STX不等效。NEO效力最强（TEFAPC = 1.546），其余类似物TEFAPC均小于1。各毒素的IC50值及TEFs详见表1。
【数据】NEO的IC50：21 nM，TEFAPC：1.546；GTX1&4的IC50：60 nM，TEFAPC：0.639；GTX2&3的IC50：170 nM，TEFAPC：0.214；dcSTX的IC50：123 nM，TEFAPC：0.029；dcGTX2&3的IC50：140 nM，TEFAPC：0.026；C1&2的IC50：174 nM，TEFAPC：0.021；GTX6的IC50：175 nM，TEFAPC：0.021；C3&4的IC50：236 nM，TEFAPC：0.015；dcNEO的IC50：601 nM，TEFAPC：0.006；GTX5的IC50：653 nM，TEFAPC：0.006；STX的IC50：41 nM，TEFAPC：1；TTX的IC50：41 nM；重复数：n=4
TTX类似物的TEFAPC值
TTX类似物的TEFAPC值先前已在Neuro-2a细胞中使用相同的APC单细胞生物传感器测定（Reverté等，2024）。由于TTX和STX毒性等效，以STX替代TTX作为参考化合物不改变先前确定的TEFAPC值：11-norTTX-6(S)-ol为0.238，11-deoxyTTX为0.107，6,11-dideoxyTTX为0.035，5,11-dideoxyTTX为0.027，5,6,11-trideoxyTTX为0.001。这些结果证明，除STX和TTX外，该生物传感器还能检测其毒性类似物。
【数据】11-norTTX-6(S)-ol的TEFAPC：0.238；11-deoxyTTX的TEFAPC：0.107；6,11-dideoxyTTX的TEFAPC：0.035；5,11-dideoxyTTX的TEFAPC：0.027；5,6,11-trideoxyTTX的TEFAPC：0.001
检出限与实际样品验证
该方法实现了37 µg STX当量/kg的检出限，远低于现行800 µg STX当量/kg的监管限量。在分析70余份具有多样化毒素谱的样品后，结果与参考方法的相关性表明，APC单细胞生物传感为PSTs和TTXs的同步监测提供了稳健且综合的工具。
【数据】检出限：37 µg STX当量/kg；监管限量：800 µg STX当量/kg；样品数：>70份
讨论与解读
现行毒素监测法规所考虑的单毒素评估可能不足以保护人类健康，因为当PSTs和TTXs共存时，可能低估受污染贝类消费相关的总体神经毒性风险。因此，应考虑采用综合分析策略同步监测PSTs和TTXs，以进行适当的食品安全评估。本研究提出的单细胞APC生物传感装置，在Neuro-2a细胞中证实STX和TTX对钠电流抑制贡献相等，毒性等效且加性。这与Finch等（2018）的报道一致——STX和TTX经口给予小鼠时表现出相同毒性。由于两者毒性等效且加性，任一毒素均可作为生物传感器响应的定量参考。事实上，该生物传感器对两种毒素化合物表现出相同的灵敏度。遵循建议将TTXs纳入PSTs组群的科学意见（Finch等，2018），本研究选择STX而非TTX作为参考化合物。
编译者解读
该研究的关键价值在于用功能读出（钠通道电流抑制）替代结构识别，天然实现了"总毒性当量"的整合检测——这恰好是监管端最需要的指标。方法学上，以STX为参考化合物统一量化PSTs和TTXs的思路，巧妙规避了TTX标准品供应受限的实际困难。检出限37 µg STX当量/kg远低于监管限值，动态范围覆盖了风险决策所需区间。局限在于Neuro-2a细胞系对两类毒素的等效响应是否在所有贝类基质中保持稳定，以及复杂基质对传感器长期运行的影响仍需更多现场数据支撑。该平台为多毒素同步监测提供了可转化的技术范式。
参考来源
Reverté J, Turner AD, Dhanji-Rapkova M, Klijnstra MD, Gerssen A. Detection of paralytic shellfish toxins and tetrodotoxins in shellfish using a single-cell biosensor based on patch clamp technology. Arch Toxicol. PMID: 42128918.
PMID: 42128918