来源：Establishing MS2-MCP-based single-molecule RNA visualization in Schizosaccharomyces pombe.（J Cell Sci）| 编译：DNA Lab Space
导读
单分子RNA成像技术MS2-MCP已在多种模式生物中推动了RNA生物学研究，但裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）始终缺乏这一关键工具。本研究通过系统优化MCP表达与定位、筛选11种组成型启动子、评估NLS/NES组合，成功建立了裂殖酵母单分子RNA成像体系。研究采用光稳定性优异的串联StayGold荧光蛋白标记MCP，结合优化的MS2茎环标记载体，实现了对rad21、cdc13等内源基因mRNA的实时追踪，为这一核心遗传模式生物的RNA动态定量分析打开了大门。
研究背景
RNA分子的活细胞可视化为理解其时空动态提供了关键信息。该技术通过改造噬菌体来源的RNA茎环形成序列实现——携带MS2茎环的RNA可被荧光标记的MS2外壳蛋白（MCP）可视化。这一系统已实现单RNA分子的高时空分辨率成像，并在转录爆发、剪接、RNA核输出动态、RNA定位、翻译及RNA降解等研究中催生了重要发现。然而，尽管裂殖酵母是真核基因表达研究的核心模式生物，MS2-MCP技术在该物种中始终未能建立。实现单分子灵敏度需要在RNA标记足够明亮与背景荧光最小化之间找到狭窄的最优窗口。本研究通过系统优化MCP表达与定位、筛选组成型启动子、评估核定位信号（NLS）与核输出信号（NES）组合，填补了这一空白。
研究方法
菌株构建
所有裂殖酵母菌株列于表S1。mad2基因在其C末端融合了非荧光（Y66L）版本的EGFP（Rosenow et al., 2004），并在终止密码子后立即插入24× MS2V6序列。标记后的mad2基因整合至内源位点：首先在rpl42-sP56Q背景下用可反筛选的rpl42+/hygR cassette删除mad2编码序列（Roguev et al., 2007），随后用mad2-darkEGFP-24×MS2V6替换该反筛选cassette——先筛选放线菌酮抗性，再确认潮霉素敏感性。
cdc13基因在S177与V178氨基酸之间内部融合了环状置换超折叠GFP（sfGFPcp）（Kamenz et al., 2015），并在3′UTR第205或332位核苷酸后插入12× MS2V6或24× MS2V6。该构建体由整合于外源leu1位点的pDUAL载体（Matsuyama et al., 2004）表达。3′UTR内不同整合位点之间未观察到功能性差异。构建pDUAL载体时，先将同源臂克隆至12× MS2V6和24× MS2V6载体，再将含有cdc13–sfGFPcp部分编码序列及含MS2重复序列的3′UTR的BamHI/XbaI片段克隆至经BamHI/SpeI消化的、含cdc13启动子驱动的cdc13–sfGFPcp的pDUAL载体。pDUAL载体经NotI线性化后，通过转化leu1-32菌株整合至基因组leu1位点。
rad21基因在终止密码子后70个核苷酸处标记24× MS2V6，整个基因（含1452个核苷酸的启动子序列和5′UTR）整合至pAde6PmeI载体（Vještica et al., 2020）。载体经PmeI线性化后，通过转化ade6-D16菌株整合至基因组ade6位点。载体整合恢复ade6+。MCP–tdSG构建体通过将相应pUra4AfeI载体经AfeI线性化后转化至ura4+-缺失菌株（ura4-D18）实现整合，载体整合恢复ura4+。
【数据】菌株：S. pombe；标记：mad2-darkEGFP-24×MS2V6、cdc13-sfGFPcp-12/24×MS2V6、rad21-24×MS2V6；整合位点：内源位点、leu1、ade6、ura4；筛选标记：cycloheximide抗性、hygromycin敏感性、ade6+、ura4+
载体构建
所有载体列于表S2。启动子序列从裂殖酵母基因组扩增，P.adh1.81除外（来自pRAD81质粒，Yoshinori Watanabe赠予）。MCP-NLS来自pET296-YcpLac111 CYC1p-MCP-NLS-2xyeGFP（Addgene质粒#104394；Robert Singer和Evelina Tutucci存放）；stdMCP-NLS来自pUbC-nls-ha-stdMCP-stdGFPx（Addgene质粒#98916；Robert Singer存放）；td8ox2StayGold来自pBS Coupler1/td8ox2StayGold（RIKEN RDB20227），mStayGold来自pRSETB/mStayGold（RIKEN RDB20214）（均为Ando et al., 2024），由RIKEN BRC通过日本MEXT国家生物资源项目提供。来自酿酒酵母的ADH1终止子（Scer\T.ADH1）与S. pombe* pFA6a表达载体所用序列相同（Bähler et al., 1998）。额外的NLS和NES序列通过酶切和Gibson组装插入合成片段。MCP质粒的pUra4AfeI骨架来自pAV0133（Addgene质粒#133467；Sophie Martin存放）。
含12× MS2V6（pET251-pUC 12xMS2V6 Loxp KANr Loxp，Addgene质粒#104392）和24× MS2V6 cassette（pET264-pUC 24xMS2V6 Loxp KANr Loxp，Addgene质粒#104393）的载体（均由Robert Singer和Evelina Tutucci存放，Tutucci et al., 2017）经BglII酶切和Gibson组装插入合成片段，在MS2 cassette下游引入EcoRI位点。
【数据】启动子来源：S. pombe基因组扩增（P.adh1.81除外）；质粒：Addgene #104394、#98916、#133467、#104392、#104393；荧光蛋白：td8ox2StayGold（RIKEN RDB20227）、mStayGold（RIKEN RDB20214）；终止子：Scer\T.ADH1
活细胞显微成像
细胞在添加补充物（200 μg/ml亮氨酸或50 μg/ml尿嘧啶）的爱丁堡极限培养基（EMM，MP Biochemicals，114110012）中培养。成像前，细胞稀释至106 cells/ml预温培养基中，取300 μl加入玻璃底8孔μ-Slide（Ibidi，80827）的一孔中，该孔已预先用50 μg/ml凝集素（Sigma，L1395）包被。包被方法：300 μl凝集素溶液加入孔中，30°C孵育数小时；成像前移除溶液，载玻片在30°C下空气干燥。成像在DeltaVision宽场显微镜上进行，使用Olympus 60×/1.42 Plan APO油浸物镜、461–489 nm LED照明、525/48 nm GFP/FITC发射滤光片、PCO edge sCMOS相机，以及维持30°C的环境 chamber。Z-stacks按指示每5、6、12或300秒记录一次，Z-section间距0.3至0.5 μm，覆盖3.9至5.4 μm距离。样品与对应对照的成像条件保持一致。在这些条件下，自发荧光在前几帧内漂白，这些帧被移除。图像使用SoftWoRx软件反卷积，采用比率法（保守）三个循环，噪声过滤设为高（300 nm），相机强度偏移为0，通常不进行校正——但>4小时的rad21-24xMS2成像除外，该处应用了漂白校正。
【数据】培养基：EMM + 200 μg/ml亮氨酸或50 μg/ml尿嘧啶；细胞密度：106 cells/ml；凝集素：50 μg/ml；温度：30°C；物镜：60×/1.42 Plan APO油浸；LED：461–489 nm；发射滤光片：525/48 nm；Z-stack间隔：5/6/12/300 s；Z-section间距：0.3–0.5 μm；成像范围：3.9–5.4 μm
全细胞荧光定量
基于明场图像使用YeaZ（Dietler et al., 2020）对细胞进行分割。定量在Z-stack的平均强度投影上进行。为扣除背景，将每张图像中细胞外信号的模式值从每个细胞获得的平均信号中减去。
【数据】分割工具：YeaZ；定量方式：平均强度投影；背景扣除：细胞外信号模式值
活细胞显微成像中荧光斑点的定量
RNA斑点的强度在Z-stack的最大强度投影上测量。手动将感兴趣区域置于斑点上，并在同一细胞的细胞质中放置另一个感兴趣区域。斑点测得的最大强度除以细胞质中测得的最大强度。
【数据】定量方式：最大强度投影；比值：斑点最大强度/细胞质最大强度
活细胞显微成像中斑点计数
为计数活细胞成像中的RNA斑点，使用U-FISH（Xu et al., 2025）在Z-stacks中识别斑点。为适应点扩散函数尺寸和RNA运动，检测到的斑点经目视检查并在napari（Chiu et al., 2022）中校正。假阳性斑点被手动删除，在Z-slices之间移动导致多次检测的RNA斑点计为单个检测RNA。剩余距离较近的斑点（3D距离<4像素）在额外数据处理中被平均并解释为单个斑点。为确定每细胞斑点数，在FIJI/ImageJ（Schindelin et al., 2012）中手动分割细胞，基于X/Y位置将斑点分配给细胞。
【数据】斑点识别：U-FISH；校正工具：napari；合并阈值：3D距离<4像素；细胞分割：FIJI/ImageJ手动
单分子RNA荧光原位杂交（smFISH）
培养物在EMM（MP Biochemicals，114110012）中生长至0.8至1.5×107 cells/ml密度。取2×108细胞，将16%多聚甲醛（PBS配制）直接加入细胞悬液至终浓度2%多聚甲醛进行固定。继续振荡孵育：30°C 15分钟，室温15分钟。通过离心（980 g，3分钟）沉淀细胞并重悬于1 ml 50 mM氯化铵（PBS配制）中淬灭固定，孵育10分钟，随后PBS洗涤三次。如有需要，细胞可在此步骤于4°C保存。为去除细胞壁，细胞沉淀后重悬于1 ml原生质体缓冲液[0.1 M磷酸钾、20 mM钒酰核糖核酸酶复合物（NEB，S1402S）、20 μM β-巯基乙醇，PBS配制]，加入4 μl 100T zymolyase（10 mg/ml；US Biological，Z1005）。细胞在30°C孵育直至细胞壁充分消化——通过测试少量样品在水中渗透裂解（约70%裂解）来判断。细胞用PBS洗涤三次去除zymolyase，然后在1 ml 0.01% Triton X-100（PBS配制）中孵育20分钟以透化质膜，再用PBS洗涤三次。杂交前处理：用含10%甲酰胺的2×柠檬酸钠缓冲液（SSC）（Thermo Fisher Scientific，AM9770）洗涤两次。每个样品分为两个技术重复，每个含108细胞。
【数据】细胞密度：0.8–1.5×107 cells/ml；固定：2%多聚甲醛，30°C 15 min + 室温15 min；淬灭：50 mM氯化铵10 min；离心：980 g，3 min；原生质体缓冲液：0.1 M磷酸钾、20 mM钒酰核糖核酸酶复合物、20 μM β-巯基乙醇；zymolyase：4 μl 100T（10 mg/ml）；透化：0.01% Triton X-100，20 min；杂交前处理：10%甲酰胺/2×SSC洗两次；技术重复：每样品2个，各108细胞
研究结果
适合单分子MS2–MCP成像的组成型启动子筛选
为优化MCP表达，研究者基于基因功能（pts1和nda3）、已知低噪声表达（mad3和rpb1；Weidemann et al., 2023）、跨胁迫条件稳定表达（cdc2、taf2、lon1和adk1；Thodberg et al., 2019）或此前在表达载体中的应用（adh1.81、pak1和act1；Chen et al., 2017; Kiriya et al., 2017; Vještica et al., 2020; Yokobayashi and Watanabe, 2005）选择了组成型启动子（图1C）。这些启动子覆盖约1至180个mRNA分子/细胞的天然mRNA表达水平范围（Marguerat et al., 2012）。启动子区域使用各基因起始密码子上游214至913个碱基对，涵盖启动子和各基因的5′UTR。使用这些启动子区域，表达融合了串联StayGold（td8ox2StayGold，简称tdSG；Ando et al., 2024）的MCP（图1D,E）。选择StayGold是因为其与其他荧光蛋白相比具有卓越的光稳定性（Ando et al., 2024; Hirano et al., 2022）。研究者观察到四类荧光强度，部分（但不完全）与报道的RNA数量成比例：低（taf2、lon1、mad3、pak1和adh1.81）、中（cdc2）、高（pts1、nda3、rpb1和adk1）和极高表达（act1）（图1E，注意对数刻度）。单体StayGold（Ando et al., 2024）作为tdSG的替代方案进行测试，产生的信号远弱于tdSG信号的一半，在弱启动子下无法检测，因此未进一步使用（图S1）。
为测试单RNA分子成像的可行性，研究者将野生型mad2基因（纺锤体组装检查点组分；McAinsh and Kops, 2023）替换为C末端含EGFP标签（通过Y66L突变使其非荧光；Rosenow et al., 2004）且在3′非翻译区（UTR）含24个MS2茎环的版本（mad2–24×MS2）。通过smFISH，mad2基因每细胞显示0至7个mRNA分子（平均约2–3个）（Esposito et al., 2022; Weidemann et al., 2023）。标记使用MS2V6变体，该变体MCP结合力略有减弱，茎环之间连接子更长，以避免MS2片段的非天然稳定化（Tutucci et al., 2017）。为便于内源标记，研究者对现有12× MS2V6和24× MS2V6载体进行了轻微修改（图2A）。原始载体设计为PCR模板以将同源臂连接到MS2重复序列；然而，跨重复区域的PCR通常需要优化（Hommelsheim et al., 2014）。因此，研究者选择了一种策略：同源臂可克隆至载体中重复序列的上游和下游，待转化至酵母的片段使用Type IIS限制酶切出（图2；图S2）。含MS2标签的供体DNA可通过CRISPR/Cas9介导的同源重组（图2B）或替换反选择cassette（图2C）以无痕方式引入基因组。或者，可使用载体上的卡那霉素（G418）抗性（图2D）。
使用不同启动子表达的mad2-24xMS2与MCP–tdSG组合，在lon1、mad3、pak1和cdc2启动子下观察到细胞质中清晰的点状信号（图3A,B；图S3）。这些点的丰度和运动与单个mRNA分子的预期行为一致（图3B；图S3，Movies 1–4）。当MCP–tdSG在无MS2标签的情况下表达时，未观察到此类信号（图3B；Movies 1–4）。正如预期，过弱（taf2）或过强（pts1或更强）的启动子未能产生清晰可辨的RNA信号（图S3）。使用lon1、mad3、pak1和cdc2启动子表达MCP–tdSG时，RNA信号与细胞质背景的比率相似——尽管cdc2启动子的MCP–tdSG表达更强（图3C；图S4），表明使用较弱启动子时MS2茎环未被MCP饱和。
为测试第二个mRNA浓度更高的基因，研究者用MS2茎环标记了细胞周期蛋白cdc13（图3D）。smFISH测定的cdc13 mRNA每细胞数量约为10–35个（平均约20个）（Bashir et al., 2026预印本; Vandal et al., 2026预印本; Weidemann et al., 2023）。除3′UTR中的MS2标签外，cdc13基因还在内部标记了环状置换超折叠GFP（sfGFPcp），因此除cdc13 mRNA外还可可视化Cdc13–sfGFPcp蛋白。由于Cdc13蛋白在细胞核中强烈富集（Alfa et al., 1989; Decottignies et al., 2001），Cdc13–sfGFPcp蛋白信号预计对细胞质背景贡献极小（图3E）。使用md3启动子表达MCP–tdSG时，可在有丝分裂中被降解的Cdc13蛋白和cdc13 mRNA同时被追踪（图3F,G；图S5）。有或无MS2标签时Cdc13–sfGFPcp蛋白信号无明显差异，表明含MS2茎环的mRNA保持功能。使用24× MS2V6和12× MS2V6均观察到与单mRNA分子一致的细胞质点状信号。
【数据】启动子数量：11个；mRNA表达范围：约1–180分子/细胞；启动子区域长度：214–913 bp；mad2 mRNA：0–7分子/细胞（平均约2–3）；cdc13 mRNA：约10–35分子/细胞（平均约20）；荧光强度分类：低（taf2、lon1、mad3、pak1、adh1.81）、中（cdc2）、高（pts1、nda3、rpb1、adk1）、极高（act1）；斑点定量：每重复56–162个斑点，每菌株2个重复
MS2探针与编码序列探针的共定位及mRNA计数
为验证MS2标签报告mRNA的可靠性，研究者进行了双色RNA FISH实验，在mad2-darkEGFP-24xMS2细胞中使用靶向EGFP标签和24× MS2标签的探针（图4A）。代表性图像显示两种探针的信号高度共定位（图4B）。共定位定量显示大多数斑点同时被两种探针识别（图4C）。同一实验中每细胞mRNA分子计数显示两种探针获得的分布高度一致（图4D）。在cdc13–sfGFPcp–24×MS2细胞中进行的单色RNA FISH实验（分别靶向sfGFPcp标签或24× MS2标签）（图4E,F）也获得了相似的mRNA计数结果（图4G）。使用与RNA FISH实验相同菌株进行的RNA活细胞成像所得每细胞mRNA分子计数与FISH结果一致（图4H）。
【数据】mad2 mRNA：0–7分子/细胞（平均约2–3）；cdc13 mRNA：约10–35分子/细胞（平均约20）；共定位分析：两种探针高度共定位；计数分布：高斯核密度估计（平滑带宽×2）
细胞周期依赖性黏连蛋白rad21表达的实时可视化
为展示该系统的应用潜力，研究者对黏连蛋白亚基rad21进行了标记。rad21基因在3′UTR标记24× MS2V6，使用其自身启动子（P.rad21）整合至基因组ade6位点。MCP–tdSG使用mad3启动子从ura4位点表达（图5A）。活细胞成像的代表性kymograph显示清晰的点状信号（图5B）。使用U-FISH对五个细胞中的斑点数量进行定量，曲线对齐至测得最大值。细胞分裂由黑线到灰线的过渡指示（图5C），显示了rad21 mRNA随细胞周期的动态变化。
【数据】rad21标记：3′UTR 24× MS2V6；整合位点：ade6（自身启动子P.rad21）；MCP表达：mad3启动子/ura4位点；成像间隔：每5分钟记录Z-stack；定量：5个细胞，U-FISH
MCP–tdSG空间分布可通过NLS/NES组合调控
研究者测试了不同的核定位信号（NLS）和核输出信号（NES）组合对MCP–tdSG空间分布的影响（图6A）。NLS和NLS的区别在于MCP与SV40 NLS之间的连接子序列不同。在表达mad2–24×MS2的菌株中，使用cdc2*启动子表达指示的MCP–tdSG或stdMCP–tdSG构建体（图6B）。不同NLS/NES组合产生了从主要核定位到主要细胞质定位的不同空间分布模式，为针对不同RNA靶标的成像提供了灵活选择。所有图像以相同曝光条件记录，显示Z-stack最大强度投影。
【数据】启动子：cdc2（另见图S7中mad3启动子）；NLS/NES组合：多种；成像条件：相同曝光条件
用于裂殖酵母表达的MCP–tdSG载体系统
研究者建立了完整的MCP–tdSG载体系统（图7）。所有载体均为pUra4AfeI（Vjestica et al., 2020）的衍生物，经AfeI线性化后可整合至ura4位点。带星号的载体已存放至Addgene和RIKEN，其他载体可应要求提供。图7A显示了从不同组成型启动子表达MCP–NLS–tdSG的载体，P.cdc2和P.rpb1的虚线表示短启动子版本的长度。图7B显示了从mad3或短cdc2启动子表达具有不同NLS/NES组合的MCP–tdSG的载体。图7C显示了表达经同义密码子优化的串联MCP（stdMCP，Wu et al., 2015）、标记NLS和tdSG的载体。
【数据】载体骨架：pUra4AfeI；整合位点：ura4（AfeI线性化）；存放：Addgene和RIKEN（带星号载体）；启动子：多种组成型启动子；MCP变体：MCP-NLS-tdSG、stdMCP-NLS-tdSG
讨论与解读
MS2–MCP系统广泛应用于单分子RNA活细胞成像，但此前未在裂殖酵母中实现。本研究通过建立融合抗漂白串联StayGold的MCP表达载体填补了这一空白，获得了适合MS2成像的细胞质浓度。通过将MCP–tdSG与多种NLS/NES组合搭配，为调节核质信号提供了灵活性。研究还修改了现有MS2载体以简化标记流程。这些工具使裂殖酵母中RNA生命周期动态和RNA定位的单分子精度探索成为可能。数据还提供了不同组成型启动子可达表达强度的参考，但需注意表达强度还受编码序列调控——例如同义密码子优化的串联MCP（stdMCP）在相同启动子下比单拷贝MCP产生更高浓度。
编译者解读：该研究的关键突破在于系统性地解决了MS2-MCP系统在裂殖酵母中的信噪比优化难题——既不过弱导致RNA不可见，也不过强造成背景淹没信号。选择抗光漂白的串联StayGold替代传统GFP是明智之举，尤其适合长时程活细胞成像。载体系统设计兼顾了CRISPR整合和反选择标记两种策略，工具包完整度高。局限在于MCP过表达可能影响RNA代谢，且启动子强度受编码序列影响需个案优化。对合成生物学而言，这套可调启动子-定位信号组合平台也为其他RNA可视化工具的快速部署提供了范式。
参考来源
Weidemann DE, Turner SC, Chethan SG, Hauf S. Establishing MS2-MCP-based single-molecule RNA visualization in Schizosaccharomyces pombe. J Cell Sci. PMID: 42417086.
PMID: 42417086