来源：Sustainable Poly(3-hydroxybutyrate) Bioplastic Production by Extremely Halophilic Haloarcula sp. PLQ Isolated from Qatari Extreme Environments.（Polymers (Basel)）| 编译：DNA Lab Space
导读
卡塔尔人口增长带来塑料废弃物激增，年产生量约16.8万吨，环境压力严峻。聚羟基链烷酸酯（PHA）作为石油基塑料的可持续替代品，其工业化生产仍受限于菌株与工艺。本研究从卡塔尔极端环境盐湖中首次分离鉴定24株产PHA嗜盐古菌，隶属于Natrinema、Haloarcula和Halostagnicola三个属。其中Haloarcula sp. PLQ在优化条件下PHB产量达496 ± 24 mg L⁻¹，细胞干重1109.8 ± 58.6 mg L⁻¹，聚合物经FTIR、TGA、DSC表征确认与标准PHB性质相当。
研究背景
石油基塑料如聚苯乙烯（PS）、聚丙烯（PP）等在全球产量持续攀升，2023年已达4.138亿吨，其中58.3%产自亚洲。海湾合作委员会（GCC）国家每年产生约1190万吨塑料废弃物，仅23%被回收利用，其余大多经焚烧、填埋或露天倾倒处置。卡塔尔人口增长使塑料废弃物年产量估计达16.8万吨，其中74%为陆地垃圾、26%为海洋垃圾，造成严重的环境影响与健康风险。尽管卡塔尔已推行塑料回收政策，但回收率仅约40%，远不足以解决废弃物积累问题。
生物塑料作为传统塑料的绿色替代品，凭借其可生物降解性、生物相容性和无毒性，在制药、医疗及食品包装领域受到日益关注。聚羟基链烷酸酯（PHA）是微生物在营养不平衡条件下合成的聚酯类储存物，具有热塑性且完全可生物降解。然而，PHA的工业化生产仍面临成本高、产率低等瓶颈。极端嗜盐古菌因其能在高盐、非无菌条件下生长，可显著降低生产成本，成为PHA生物合成的理想候选菌株。
研究方法
2.1 研究区域与样品采集
采样点选在卡塔尔北部Al Shamal地区的两个盐湖（Lake 1和Lake 2）。在旱季（2024年4月）无菌采集四个样品（S1G-24、S2P-24、S3P-24和S4P-24）。S1G-24和S3P-24为盐水与沉积物混合物，装入无菌瓶中，分别保存于−80 °C和4 °C。S4P-24沉积物呈沙色，S2P-24水样呈绿色，同样分别保存于−80 °C和4 °C。样品的经纬度位置及理化数据见表1。pH、电导率和温度使用pH/cond 3320 SET 2（WTW，德国）测定；盐度使用海水数字折射仪（BULK REEF SUPPLY）测量。
【数据】样品数：4个；采样时间：2024年4月；保存温度：−80 °C和4 °C
2.2 潜在嗜盐PHA产生菌的分离
将采集的样品等分接种至PHA累积培养基中，富集培养在37 °C、160 rpm的振荡培养箱中进行。培养14天后，从每个富集培养物中取1 mL，在含5 mL液体培养基的试管中梯度稀释，取100 µL各稀释液涂布于琼脂平板（2%（w/v）琼脂）表面，每个稀释度做两个平行。固体PHA生产培养基组成如下（g L⁻¹）：250 g NaCl、10 g MgCl₂·6H₂O、15 g MgSO₄·7H₂O、4.0 g KCl、1.0 g CaCl₂·2H₂O、0.5 g NaHCO₃、1 g酵母提取物、10 g淀粉和2%（w/v）琼脂，pH为7。培养基pH用1 M HCl或1 M NaOH调节。在37 °C培养10天后，挑选不同菌落，在新鲜琼脂平板上多次划线纯化，并用显微镜（ZEISS Primostar 3，德国）检查纯度（形状/大小）。对所有分离株进行细胞运动性和形态学特征鉴定。纯培养物加入30%（v/v）无菌甘油作为冷冻保护剂，于−80 °C冰箱长期保存。
【数据】富集温度：37 °C；转速：160 rpm；富集时间：14天；涂布量：100 µL；NaCl：250 g L⁻¹；MgCl₂·6H₂O：10 g L⁻¹；MgSO₄·7H₂O：15 g L⁻¹；KCl：4.0 g L⁻¹；CaCl₂·2H₂O：1.0 g L⁻¹；NaHCO₃：0.5 g L⁻¹；酵母提取物：1 g L⁻¹；淀粉：10 g L⁻¹；琼脂：2%（w/v）；pH：7；培养温度：37 °C；培养时间：10天；甘油保护剂：30%（v/v）
2.3 嗜盐古菌菌株鉴定
使用PureLink™ Microbiome DNA Purification Kit（Invitrogen，美国）按制造商说明书提取所有分离株的基因组DNA。古菌16S rRNA基因使用正向引物21F（5′-TTCCGGTTGATCCYGCCGGA-3′）和反向引物1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）扩增。PCR使用Applied Biosystems™ Veriti™ 96-Well Thermal Cycler（Thermo Fisher Scientific，美国）进行，反应体积25 µL，含50 ng目标DNA、1× PCR缓冲液、2.5 mM MgCl₂、0.2 µM各引物、200 µM各dNTP和1.25 U GoTaq® Flexi DNA聚合酶（Promega）。程序为：95 °C初始变性5 min，30个循环（94 °C 1 min、55 °C 1 min、72 °C 2 min），最后72 °C延伸10 min。PCR产物用HaeIII、HindIII、HinfI（Life Technologies）进行限制性酶切消化。阳性菌株的16S rRNA片段用GeneJET™ Gel Extraction Kit（Thermo Scientific，立陶宛维尔纽斯）纯化后，送至Weill Cornell Medicine-Qatar进行Sanger测序。系统发育树用MEGA软件构建。
【数据】PCR反应体积：25 µL；DNA模板：50 ng；MgCl₂：2.5 mM；引物：0.2 µM；dNTP：200 µM；DNA聚合酶：1.25 U；变性温度：95 °C/94 °C；退火温度：55 °C；延伸温度：72 °C；循环数：30
2.4 潜在嗜盐PHA产生菌的筛选
所有分离株使用特异性Nile Red染料（Sigma-Aldrich）和苏丹黑B醇溶液（Sigma-Aldrich）进行PHA积累筛选。此前研究中，Natrinema altunense菌株CEJGTEA101（KY129977）已被描述为PHB产生菌，作为阳性对照。阴性对照为参考细菌菌株大肠杆菌DH5α。
【数据】阳性对照：Natrinema altunense CEJGTEA101（KY129977）；阴性对照：Escherichia coli DH5α
2.5 通过简并PCR筛选III类PHA合酶基因
对39株极端嗜盐古菌的基因组DNA，使用CODEHOP（Consensus-Degenerate Hybrid Oligonucleotide Primer）PCR扩增检测其基因组中的III类PHA合酶。位于phaEC操纵子中的相邻基因phaE和phaC，分别使用两对CODEHOP引物扩增：codehopEF（正向，5′-CGACCGAGTTCCGCGAYATHTGGYT-3′）/codehopER（反向，5′-GCGTGCTGGCGGCKYTCNAVYTC-3′）和codehopCF（正向，5′-ACCGACGTCGTCTACAAGGARAAYAARYT-3′）/codehopCR（反向，5′-GGTCGCGGACGACGTCNACRCARTT-3′）。PCR使用Applied Biosystems™ Veriti™ 96-Well Thermal Cycler进行，反应体积25 µL，含50 ng目标DNA、1× PCR缓冲液、2.5 mM MgCl₂、0.2 µM各引物、200 µM各dNTP和1.25 U GoTaq® Flexi DNA聚合酶（Promega）。PhaE和PhaC两个基因的PCR程序均为：94 °C初始变性5 min，30个循环（94 °C 30 s、55 °C 45 s、72 °C 45 s），最后72 °C延伸10 min。PCR产物用GeneJET™ Gel Extraction Kit纯化后送Weill Cornell Medicine-Qatar进行Sanger测序。phaC和phaE基因的核苷酸序列翻译为对应氨基酸序列。基于氨基酸序列构建系统发育树。
【数据】菌株数：39株；PCR反应体积：25 µL；DNA模板：50 ng；MgCl₂：2.5 mM；引物：0.2 µM；dNTP：200 µM；DNA聚合酶：1.25 U；变性温度：94 °C；退火温度：55 °C；延伸温度：72 °C；循环数：30
2.6 细胞生长与细胞干重（CDW）测定
为跟踪最佳PHB嗜盐古菌产生菌在PHA累积培养基中的生长情况，使用可见分光光度计（JENWAY 7310，英国）以24 h为间隔监测600 nm处吸光度。接种物为96 h龄培养物（2%（v/v））。为测定生物量（细胞干重），取50 mL对数晚期培养物（双份），使用Megafuge ST plus系列离心机（Thermo Scientific，美国）在4752× g离心30 min收获细胞。用无菌蒸馏水洗涤两次后，细胞沉淀再次离心、冷冻，然后冷冻干燥过夜至恒重。冻干细胞用于胞内PHA回收和定量。
【数据】接种量：2%（v/v）；培养物龄：96 h；取样量：50 mL；离心：4752× g、30 min；检测波长：600 nm；间隔：24 h
2.7 生长参数对PHB生产的影响
为优化所选PHB产生菌株的PHB积累，监测温度（30、37、40和45 °C）、盐浓度（100–300 g L⁻¹）、pH值（6.5、7、8和9）和培养时间（24–144 h）。优化实验在含淀粉（10 g L⁻¹）的50 mL PHA累积培养基中进行双份测试。测定干生物量和PHB浓度。
【数据】温度范围：30–45 °C；盐浓度：100–300 g L⁻¹；pH：6.5–9；培养时间：24–144 h；培养基体积：50 mL；淀粉：10 g L⁻¹
2.8 碳源对PHB生产的影响
根据可获得性和成本效益，选择三种纯碳水化合物：淀粉、葡萄糖和甘油。D-葡萄糖、纯甘油和可溶性淀粉购自Sigma-Aldrich（德国）。在优化生长条件下，将每种碳源分别以1%（w/v）加入PHA累积培养基中，测试其对所选PHB产生菌株PHB生产的影响，然后测定干生物量和提取聚合物质量。葡萄糖、甘油和可溶性淀粉添加量均为10 g L⁻¹，对应的理论碳当量分别为4、3.91和4.44 g C L⁻¹。
【数据】碳源：葡萄糖、甘油、可溶性淀粉；添加量：1%（w/v）= 10 g L⁻¹；碳当量：4、3.91、4.44 g C L⁻¹
2.9 氮源对PHB生产的影响
在优化生长条件下，将所选PHB产生菌株分别培养在添加蛋白胨（Suvchem）、酵母提取物（Gibco）、NH₄Cl（Sigma-Aldrich）或尿素（Sigma-Aldrich）的PHA累积培养基中，添加量为0.1%（w/v）。测定干生物量和提取聚合物质量。
【数据】氮源：蛋白胨、酵母提取物、NH₄Cl、尿素；添加量：0.1%（w/v）
2.10 聚合物提取
（原文该部分未完整提供）
【数据】原文未详述
研究结果
3.1 潜在嗜盐PHA产生菌的表型与系统发育特征
近年研究聚焦于嗜盐古菌在生物塑料可持续生产中的显著潜力。本研究从卡塔尔极端环境中筛选了此前从未被调查和利用的潜在嗜盐产PHA古菌。这些微环境以盐度和温度条件的高度变异性为特征。本研究揭示了样品类型间的理化异质性，从而促进了嗜盐古菌群落的生长与存活。共从卡塔尔极端环境中分离获得39株嗜盐产PHA古菌。所收集的古菌菌株用于建立卡塔尔及该地区首个古菌菌株生物库，可进一步开发用于多种生物技术应用。
平板上培养10天后的菌落呈圆形、红色、粉色、奶油色，边缘整齐，直径在0.2至0.5 mm之间。对所有分离株进行形态学特征鉴定，显示多形性和球菌形态占优势。细胞不运动。
其中24株嗜盐古菌分离株经Nile红染料荧光染色或亲脂性苏丹黑B染色呈阳性，被确定为PHA积累菌。该筛选方法广泛用于PHA产生菌的定性观察。多种嗜盐古菌菌株，如Haloarcula tradensis、Natrinema pallidum和Natrinema altunense，均可通过在琼脂菌落中掺入染色染料快速筛选。除菌落染色法外，荧光显微镜也被用于可视化Haloarcula hispanica A85、Natrinema altunense A112、Haloarcula sp. TG1和Haloarcula marismortui细胞中的PHA包涵体。
扩增的16S rRNA基因经HaeIII、HinfI和HindIII限制性酶消化后的ARDRA图谱比较显示不同谱型。HaeIII消化将阳性产生菌分为四种限制性图谱，HinfI分为三种图谱。然而，HindIII消化的图谱上未观察到限制性片段。扩增核糖体DNA限制性分析（ARDRA）用于区分菌株。
根据16S rRNA基因分析，经表型和基因型检测确定24株分离株为阳性PHA产生菌，隶属于Methanobacteriota门、Halobacteria纲、Halobacteriales目的Natrinema、Haloarcula和Halostagnicola属。分离株PLQ与Haloarcula quadrata（相似度99.11%）、Har. japonica（99.26%）、Har. mannanilytica（99.2%）、Har. hispanica（99.2%）和Har. argentinensis（99.2%）相关。17株分离株与Natrinema thermotolerans和Natrinema pellirubrum物种密切相关。最后，菌株L1QC、L1QC1、L1QC2、L1QC3、L1QC4和L1QC5隶属于Halostagnicola larsenii物种。
【数据】分离菌株总数：39株；阳性PHA产生菌：24株；菌落直径：0.2–0.5 mm；PLQ与Haloarcula quadrata相似度：99.11%；与Har. japonica：99.26%；与Har. mannanilytica：99.2%；与Har. hispanica：99.2%；与Har. argentinensis：99.2%；ARDRA图谱：HaeIII 4种、HinfI 3种、HindIII无条带
3.2 PHA产生细胞中phaC和phaE基因的分子特征
PHA产生菌的初步筛选缺乏特异性，可能产生假阳性结果。因此，分子方法（包括聚合酶链反应）可精确高效地靶向编码III类PHA合酶的基因。近期涉及phaE/phaC基因PCR扩增的筛选研究已在Natrinema和Haloarcula属成员中检测到PHA合酶。本研究使用CODEHOP PCR扩增对39株分离株的基因组DNA进行III型PHA合酶基因检测。前述表型方法确定为阳性的同一批嗜盐古菌分离株，均呈现280 bp（phaC）和230 bp（phaE）的条带。
在嗜盐古菌中，PHA合酶由结构亚基phaE和催化亚基phaC组成。然而，基于嗜盐古菌PHA合酶的分子鉴定和遗传特征的研究报道仍然很少。
就相应氨基酸序列而言，系统发育分析表明，24株阳性PHA产生菌的phaC与Haloarcula quadrata对应序列具有99%的高度一致性，与Natrinema thermotolerans为97–98.88%，与Halostagnicola larsenii为93.75–95.51%。阳性分离株的PhaE与Halostagnicola larsenii、Haloarcula quadrata和Natrinema sp.对应序列的一致性达100%相同氨基酸。研究结果与先前描述一致，即产PHB嗜盐古菌具有将碳源转化为PHB的显著潜力，包括Halobiforma、Haloarcula、Haloferax、Natrinema、Halorubrum、Natrialba、Natronococcus、Natronobacterium和Natronomonas等属。值得注意的是，编码III型PHA合酶的phaEC基因簇已在Haloarcula marismortui和Haloferax mediterranei中被鉴定。Han等人报道了phaEC基因对PHB生产的必要性，其缺失导致Haloarcula物种中PHA合酶活性丧失。本研究首次在Halostagnicola属中检测到phaE和phaC氨基酸序列作为PHB积累因子。
【数据】phaC条带大小：280 bp；phaE条带大小：230 bp；phaC一致性：与Haloarcula quadrata 99%、与Natrinema thermotolerans 97–98.88%、与Halostagnicola larsenii 93.75–95.51%；PhaE一致性：与Halostagnicola larsenii、Haloarcula quadrata和Natrinema sp.均为100%
3.3 发酵工艺优化实现Haloarcula sp. PLQ细胞中PHB最大产量
据现有知识，多种嗜盐古菌，尤其是Haloferax mediterranei，能够从包括淀粉、葡萄糖和甘油在内的多种纯碳水化合物积累PHBV。尽管产PHB的嗜盐古菌数量不断增加，但关于其从结构不相关的碳源或富碳废弃物中合成均聚物PHB的报道仍然有限。本研究从卡塔尔极端环境中分离出具有前景的产PHB嗜盐古菌，这些分离株隶属于Haloarcula、Natrinema和Halostagnicola属。尽管Natrinema属成员在高盐环境中分布广泛，但这些潜在PHB产生菌是首次在卡塔尔湖泊中被描述。此外，从不同高盐环境中回收的Haloarcula属成员此前已被报道为良好的PHB产生菌以及碳氢化合物降解菌。另一方面，本报告表明Halostagnicola分离株被认为是携带phaC/phaE基因的推定PHA产生菌。
其中，24株阳性PHA产生菌通过气相色谱进行定量初步筛选。定量分析显示，菌株PLQ表现出最高的细胞干重（1525 ± 5 mg L⁻¹）和PHA产量（205.8 ± 36 mg L⁻¹），PHA回收率为13.5 ± 2.31%。因此，应对培养条件进行优化以实现最大PHB产量。基于独特的ARDRA图谱、荧光强度和GC结果，极端嗜盐古菌Haloarcula sp. PLQ被认为是最佳阳性菌株，被选作进一步研究对象。
优化实验以双份进行，评估温度（30–45 °C）、pH（6.5–9）、氯化钠浓度（100–300 g L⁻¹）、培养时间（24–144 h）、碳源/氮源类型对菌株PLQ细胞干重（CDW）和PHA产量的影响。这些培养参数在其他研究中也经过优化以获得更高的PHA浓度。同时，记录了菌株PLQ在不同发酵参数下的曲线特征。
【数据】菌株PLQ初始细胞干重：1525 ± 5 mg L⁻¹；初始PHA产量：205.8 ± 36 mg L⁻¹；PHA回收率：13.5 ± 2.31%；优化后PHB浓度：496 ± 24 mg L⁻¹；优化后细胞干重：1109.8 ± 58.6 mg L⁻¹；最大产率：44.69 wt% ± 2.13；TGA：Tonset = 250 °C、Td = 270 °C；DSC：Tm = 169 °C
讨论与解读
本研究从卡塔尔极端盐湖环境中成功分离并鉴定了一批产PHA的极端嗜盐古菌，其中Haloarcula sp. PLQ在优化条件下达到496 ± 24 mg L⁻¹的PHB浓度和44.69 wt% ± 2.13的产率。聚合物的FTIR光谱与标准PHB（Sigma-Aldrich）高度一致，TGA分析显示热分解起始温度（Tonset）为250 °C、分解温度（Td）为270 °C，DSC测得的熔融温度（Tm）为169 °C，均与标准PHB相当，证实所产聚合物为聚(3-羟基丁酸酯)，具备良好的热稳定性。该菌株在非无菌、高盐条件下的生长优势，为降低PHA工业化生产成本提供了可行路径。未来将在中试规模下，利用可再生原料在非无菌、分批或连续发酵条件下进行该菌株纯培养的PHA生产研究。
编译者解读
本研究亮点在于从尚未被开发的卡塔尔极端环境中系统筛选嗜盐古菌，并首次报道了Halostagnicola属的PHA合成能力。方法上采用表型染色与基因型（phaC/phaE）双重筛选，有效降低了假阳性率。Haloarcula sp. PLQ的PHB产率在嗜盐古菌中处于较高水平，且高盐环境天然抗污染，适合开放式发酵，工业前景可观。不足之处在于目前仍停留在摇瓶水平，碳源局限于纯糖类，距离利用廉价废弃物实现规模化生产尚有距离。后续可探索该菌株对农业或工业废弃物的利用能力，并评估其在连续发酵体系中的稳定性。
参考来源
Ben Abdallah M, Saadaoui I, Bounnit T, Al-Ghasal G, Thaher M. Sustainable Poly(3-hydroxybutyrate) Bioplastic Production by Extremely Halophilic Haloarcula sp. PLQ Isolated from Qatari Extreme Environments. Polymers (Basel). PMID: 42514746.
PMID: 42514746