来源：A Label-Free Cell-Based Biosensor Method for Ethanol Quantification Using Temperature-Induced Spontaneous Cell Detachment.（Biosensors (Basel)）| 编译：DNA Lab Space
导读
乙醇定量在饮料质量控制、生物燃料生产和制药领域至关重要，但现有方法成本高、依赖试剂或标记物。本研究开发了一种基于酿酒酵母温度梯度诱导自发脱落的无标记生物传感器，通过监测固液界面热阻变化获取脱落半时间（td50）作为读数。研究发现td50随乙醇浓度呈非单调变化，在20% v/v乙醇处出现尖锐峰值（约10小时），且细胞质量（新鲜与老化）显著影响检测窗口。该方法仅需加热器和温度探头，成本低廉、结构紧凑，并在威士忌实际样品中验证了适用性。
研究背景
乙醇定量对多种工业和研究应用至关重要。在酿造行业，乙醇作为主要产品需精确测量以满足质量控制和法规要求；在蒸馏酒（威士忌、朗姆酒、伏特加、金酒）生产中，精确的乙醇定量对工艺控制、ABV标签/税收和真伪鉴别至关重要。此外，乙醇监测对生物燃料发酵产率最大化、燃料混合物中乙醇含量追踪，以及临床法医学中血液酒精浓度测定均有重要意义。
现有乙醇定量方法包括气相色谱-火焰离子化检测（金标准方法）、高效液相色谱、折射法和分光光度法等。光谱学方法如红外传感器可实现非侵入式检测，但仍需大量样品前处理。这些方法普遍成本高、依赖试剂或标记物，难以满足快速、低成本、实时反馈的工艺控制需求。因此，开发一种简便、低成本的乙醇传感策略具有明确的应用价值。
研究方法
2.1 细胞悬浮液制备与OD600测量
所有测量使用Dr. Oetker（比利时马赫伦）市售干态聚集形式的酿酒酵母。细胞悬浮液通过将干酵母聚集体加入含目标乙醇浓度的乙醇-水混合物（去离子MilliQ水）中制备（10 mg酵母/mL），并以500 rpm温和涡旋1分钟至形成均匀悬浮液。所得悬浮液在600 nm波长下的光密度（OD）约为1.8 ± 0.2。OD600测量使用Biochrom Ltd.（英国剑桥）的Ultrospec 2100 pro对100倍稀释样品进行。
为验证复杂基质中的实际应用，采用相同方案在Jack Daniel's田纳西威士忌（Jack Daniel Distillery，美国田纳西州林奇堡）中制备酵母悬浮液，威士忌用Milli-Q水稀释至不同酒精体积浓度。为测试细胞沉降，对不同乙醇百分比悬浮液进行OD600测量——光密度快速下降意味着细胞快速沉降。高乙醇浓度下干酵母聚集体难以悬浮，因此制备乙醇浓度>20%的细胞悬浮液时，先将细胞在MQ水中快速悬浮，再加入适当体积分数的乙醇并再次涡旋。
使用两类酵母细胞：（1）老化酵母——过期后6个月，并额外在室温空气中暴露1个月；（2）新鲜酵母——测量前未开封且在保质期内。两类细胞的代谢活性分析见后文。老化酵母作为低质量细胞群体的实用模型，模拟超过制造商保质期储存导致的活力降低，用于评估该方法能否区分新鲜酵母与代谢活性降低、细胞活力受损的细胞。实际应用中，细胞质量下降常源于不当储存、老化、过期或污染。
【数据】菌株：酿酒酵母（Dr. Oetker）；细胞浓度：10 mg/mL；涡旋：500 rpm，1 min；OD600：≈1.8 ± 0.2（100倍稀释测量）；老化酵母：过期后6个月+室温空气暴露1个月
2.2 表面制备
除非另有说明，所有测量均在聚氨酯涂层铝芯片上进行以控制生物相容性影响。聚合物溶液由引发剂（4,4'-二异氰酸二苯基甲烷，122 mg）、单体（双酚A，222 mg）和交联剂（间苯三酚，25 mg）的混合物制备，具体见参考文献[39,40,41,42]。预聚合在65°C下进行200分钟至凝胶点。所有试剂由供应商（Sigma Aldrich N.V.，比利时迪海姆）提供，纯度≥99.9%。随后通过旋涂（60 s，2000 rpm，1000 rpm/s加速度）在10 mm × 10 mm铝芯片（Brico N.V.，比利时科尔贝克-洛）上沉积约1.2 µm聚合物层。
高亲水性玻璃芯片通过将10 mm × 10 mm基底（Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH & Co，德国松德海姆）在测量前暴露于UV臭氧（UVO-Cleaner，Jelight Company Inc.，美国加州尔湾）90分钟制备。UV处理玻璃（及未处理玻璃）用于额外参考测量。
【数据】引发剂：4,4'-二异氰酸二苯基甲烷 122 mg；单体：双酚A 222 mg；交联剂：间苯三酚 25 mg；预聚合：65°C，200 min；旋涂：60 s，2000 rpm，1000 rpm/s加速度；聚合物层厚度：≈1.2 µm；UV臭氧处理：90 min
2.3 细胞显微镜分析
为理解乙醇对细胞形态和聚集行为的影响，进行了光学显微镜和扫描电子显微镜（SEM）分析。光学显微镜使用Leica DM750M系统（Leica Microsystems GmbH，德国韦茨拉尔），对预孵育于不同乙醇浓度（v/v）的细胞进行观察。样品制备方法：将一滴细胞悬浮液滴在显微镜载玻片上，盖上干净盖玻片，施加温和垂直压力以获得均匀单层，同时最小化横向剪切。在两层玻片就位状态下成像，以保持乙醇浓度依赖的细胞表面分布。
SEM成像使用JEOL JSM-7800 F仪器（德国弗赖堡），操作与参考文献[38]描述类似。细胞悬浮液在不同乙醇浓度下制备并滴铸在2 cm × 4 cm玻璃载玻片上。干燥后，酵母层用约10 nm铂-钯薄膜（Pt/Pd = 80/20）通过JEOL JFC-2300HR镀膜仪进行溅射镀膜。扫描电子显微镜在腔室压力<1.0 × 10⁻⁴ Pa、加速电压5 kV条件下进行，放大倍数约100×至15,000×。显微照片使用JEOL SEM内置软件3.0版处理和评估。
为详细比较老化细胞与新鲜细胞，使用Agilent 5500（Agilent Technologies，美国加州圣克拉拉）进行原子力显微镜（AFM）分析。测量采用MSNL-F悬臂（110–120 kHz，0.6 N/m弹簧常数，标称尖端半径2–12 nm），以间歇接触（轻敲）模式操作[43]。图像使用Gwyddion软件2.71版处理[44]。
【数据】SEM镀膜：Pt/Pd = 80/20，~10 nm；SEM腔室压力：<1.0 × 10⁻⁴ Pa；加速电压：5 kV；放大倍数：~100×至15,000×；AFM悬臂：110–120 kHz，0.6 N/m，尖端半径2–12 nm
2.4 细胞代谢活性分析
使用刃天青试剂（>99%纯度；Acros Organics，Thermo Fisher Scientific，比利时赫尔）监测时间分辨代谢活性。代谢活跃细胞中，蓝色刃天青被还原为粉色试卤灵。因此试卤灵荧光增加可实时指示细胞群体代谢。在高压灭菌的1× PBS（pH 7.4）中制备15 µM刃天青溶液。细胞悬浮液在1× PBS中制备，与刃天青以10% v/v比例在六孔板中混合。100 µL等分试样在Tecan Infinite 200 PRO酶标仪（Tecan Trading AG，瑞士曼内多夫）上于590 nm读取荧光。实验在预设温度27°C下进行≥4小时，动力学模式，5分钟采样间隔。每个条件均记录无细胞组成匹配空白对照。
代谢速率可从时间依赖图中直观比较，但研究采用定量方法——达到荧光饱和的半时间（代谢半时间，tm50）。tm50值不通过手动估计获得，而是在OriginPro（OriginPro 2023b版，OriginLab Corporation，美国北安普顿）中按方程(1)拟合逻辑函数得到：
(1) Y = A2 + (A1 − A2)/(1 + (t/t1/2)^p)
其中Y为时间依赖性荧光强度，A1 [Y(t=0)]和A2 [Y(t=∞)]为Y的两个极限值常数，p为斜率，t1/2为半时间（A1和A2的中点），代表细胞群体代谢活性半衰期（tm50）[36]。
【数据】刃天青浓度：15 µM（1× PBS，pH 7.4）；混合比例：10% v/v；检测波长：590 nm；温度：27°C；时间：≥4 h；采样间隔：5 min
2.5 乙醇-水混合物表面张力测定
使用99.9%纯乙醇（VWR，比利时哈斯罗德）和去离子Milli-Q水（25°C下18.2 MΩ·cm）制备0%至99.9% v/v乙醇的乙醇-水混合物。表面张力测量使用配备自动加样单元和高分辨率相机（USB 3.0）的DataPhysics OCA 25设备（DataPhysics，德国菲尔德施塔特）。每次测量中，以1.00 µL/s持续 dispensing 液体形成悬滴，直至达到最大未脱落液滴。建立定时方案以确保每个样品分配相同体积。相机捕获悬滴轮廓，采用背光照明增强边缘检测[45]。记录的液滴图像在DataPhysics SCA 22软件模块中处理，该模块通过强度对比检测液滴轮廓，并用Young-Laplace模型拟合计算表面张力[46]。
液滴形状反映力的平衡：表面张力趋于最小化面积使液滴变圆，而重力向下拉使其伸长。因此，高表面张力产生更球形液滴，低表面张力产生更拉长的梨形轮廓。每个样品至少测量5次。除乙醇-水混合物测量外，还对威士忌样品进行了测量。
【数据】乙醇纯度：99.9%；水电阻率：18.2 MΩ·cm（25°C）；dispensing速率：1.00 µL/s；测量次数：≥5次/样品
2.6 热转移法（HTM）自发脱落监测
（原文该部分未在节选中完整呈现，但根据引言和结果部分描述，HTM方法用于实时监测细胞附着和脱落过程中的热阻变化。芯片温度预设为27.0°C，室温为18.0 ± 0.5°C，使用聚氨酯涂层铝芯片。细胞悬浮液预孵育于不同乙醇浓度1小时后进行测量。脱落时间td50通过逻辑模型拟合确定，定义为信号恢复到总变化50%的时间点。）
【数据】芯片温度：27.0°C；室温：18.0 ± 0.5°C；预孵育时间：1 h
研究结果
3.1 不同乙醇-水混合物的表面张力
表面能（SE）对细胞-材料相互作用有显著影响[26,48,49]。因此，测量了从纯水到纯乙醇整个浓度范围内乙醇-水混合物的表面张力（液体的表面能），可观察到表面张力随乙醇含量增加而降低的预期趋势[50]。如图2a所示，表面张力从MQ水中的73.8 ± 0.4 mN/m降至纯乙醇中的27.8 ± 0.4 mN/m，符合预期[50]。该趋势呈指数型（见拟合线），符合方程(2)：
(2) γ = γ0 + A·exp(−C/λ)
其中γ0为水平渐近值，A为振幅，C为乙醇浓度（v/v），λ为浓度标度参数（衰减常数）。λ值为19.2 ± 1.1% v/v，意味着乙醇浓度每增加19.2%，表面张力降低0.632倍。该数据与先前研究结果一致。例如，参考文献[50]的测量显示，向水中添加乙醇使表面张力从纯水的~72 mN/m降至更小值，在10%、20%、30%和40% v/v乙醇下分别为51.4、44.8、37.8和33.9 mN/m。
Jack Daniel's威士忌的测量数据点如图2a绿色符号所示，呈现相同的总体表面张力下降趋势，表明乙醇含量是稀释威士忌样品中控制该趋势的主要因素。图2误差棒小于符号尺寸。与本研究数据的微小差异可归因于测量温度——本研究在低至18 ± 0.5°C的室温条件下测量。对选定乙醇浓度，还分析了dispensed液滴脱落前的时间（保留时间）。表面张力数据趋势与液滴保留时间随乙醇浓度的变化互补，见图2b，按方程(2)指数拟合（R² > 0.99）。
【数据】MQ水表面张力：73.8 ± 0.4 mN/m；纯乙醇表面张力：27.8 ± 0.4 mN/m；λ = 19.2 ± 1.1% v/v；测量温度：18.0 ± 0.5°C；测量次数：≥5次/点
3.2 自发脱落动力学与乙醇浓度的关系
图3a显示了酿酒酵母细胞在无乙醇培养基（MQ水）中液体温度T2和芯片温度T1随时间变化的典型测量结果。芯片温度预设为27.0°C，测量在室温18.0 ± 0.5°C下于聚氨酯涂层铝芯片上进行。如图所示，在MQ中初始稳定步骤后，芯片表面暴露于细胞悬浮液时T2缓慢下降至稳定值，而T1（及加热器电压V）保持在预设值不变。44分钟后，T2（和Rth）因集体细胞脱落而自发恢复（图3a,b）。脱落时间td50按参考文献[36]所述通过逻辑模型拟合确定，定义为信号恢复到总变化50%的时间。基于六次独立测量（其他数据见图S1），td50值为44.1 ± 2.0分钟。作为对照，无乙醇1× PBS缓冲液中的测量也产生相似的自发脱落时间，平均为44.0 ± 2.1分钟（图3c），表明该效应对渗透压变化不太敏感。
使用与图3相同的测量方案，对预孵育于不同乙醇浓度（v/v %）1小时的酵母悬浮液进行测量。共获取0%、2%、4%、6%、10%、15%、20%、25%、27.5%、30%、40%、50%、60%和70%乙醇的数据。图4比较了0%、15%、20%、30%、50%和70%代表性测量的时间依赖性细胞附着和脱落行为的原始Rth数据（所有其他数据见图S1–S6）。总体而言，自发细胞脱落发生在乙醇浓度最高50%的范围内。具体而言，在0%至20%之间，脱落时间增加：0%时为44.6分钟，15%时为95.0分钟，20%时为758分钟。20%乙醇的长时间脱落出乎意料，但非常持久且可重复，见图S5中多次测量。有趣的是，从15%到20%的脱落时间变化非常急剧。超过20%后，脱落时间下降。60%和70%时无脱落发生；在这些乙醇水平下，细胞已死亡，且普遍从悬浮液中聚集到芯片上，详见3.3节。
为便于可视化，图5a将0%至15%之间各种乙醇浓度的Rth响应放在同一面板中比较，突出脱落时间的增加趋势；图5b则描绘了20%及以上至30%浓度酵母脱落时间的下降趋势。图5a,b中的数据沿纵轴位移以便目视比较，虚线为用于确定脱落半时间td50的逻辑拟合示例。
图5c显示了除60%和70%（无细胞脱落发生，图S6）外的全部测量数据和所有乙醇浓度。所有数据点为至少三次独立测量的平均值，误差为标准偏差。
为验证该方法在化学复杂且实际的样品基质中的适用性，额外测试了商业酒精饮料Jack Daniel's威士忌及稀释样品。其40% v/v酒精含量可在图5c所示乙醇校准范围的大部分区域内进行验证，而葡萄酒或啤酒等较低酒精基质仅能覆盖较窄的浓度窗口。未稀释威士忌（40%）及对应约4%、10%和20%乙醇的稀释样品产生的响应与乙醇校准测量结果一致。数据以星号显示于图5c中。每个数据点为至少三次独立测量的平均值，误差为标准偏差。
这些结果表明，基于酵母的传感方法不仅限于乙醇-水简单溶液，还可应用于真实酒精饮料样品。乙醇-水混合物与威士忌样品获得的表面张力数据的一致性表明，威士忌基质中的传感器响应主要归因于乙醇。重要的是，本方法作为概念验证分析手段而非即用型设备提出。发酵监测是未来可能的应用方向之一——该方法可用于测试发酵过程中提取或获得的样品。如威士忌测量所示，该方法也可能用于啤酒等饮料的乙醇定量，包括区分含酒精和无酒精啤酒，以及葡萄酒、烈酒及相关产品。
值得注意的是，除遵循总体趋势外，暴露于20%威士忌样品的细胞也表现出20%乙醇时观察到的独特长脱落时间。这证实该效应与20%左右乙醇浓度相关。
众所周知，表面润湿性（和表面能）显著影响细胞对表面的粘附[26,49]。然而，在聚氨酯、金和玻璃（进一步通过UV暴露和硅烷化区分）表面上进行的自发细胞脱落测量表明，td50与表面无关[36]。为理解20% v/v乙醇中细胞长脱落时间是否也出现在其他表面，在具有不同表面疏水性的材料上进行了类似测量，通过水接触角（CA）评估，包括UV处理玻璃（CA 13.7 ± 2.5°）和玻璃（CA 52 ± 0.6°）。聚氨酯（所有其他测量的表面）接触角为64.8 ± 0.8°。
【数据】td50（0%乙醇，MQ水）：44.1 ± 2.0 min（n=6）；td50（0%乙醇，1× PBS）：44.0 ± 2.1 min；td50（0%）：44.6 min；td50（15%）：95.0 min；td50（20%）：758 min；脱落发生上限：50%乙醇；无脱落：60%和70%乙醇；接触角：UV处理玻璃13.7 ± 2.5°，玻璃52 ± 0.6°，聚氨酯64.8 ± 0.8°
3.3 高乙醇浓度下的细胞活性与聚集
图7显示了60%和70%乙醇中的OD600值，与0%至50%较低乙醇浓度中的酵母相比，其数值显著更低且随时间呈下降趋势。该效应在70%乙醇中更为明显。
图8显示了酵母细胞的形态和代谢表征。(a,b)为老化细胞(a)和新鲜细胞(b)的AFM图像，两种细胞类型均显示典型的芽殖酵母特征。(c,d)比较了27°C(c)和37°C(d)两种温度下老化酵母与新鲜酵母的代谢活性，新鲜细胞表现出更快且更早的饱和。(e)为试卤灵荧光半时间，量化27°C和37°C下老化与新鲜酵母之间的代谢活性半时间tm50。图(e)中误差棒为标准偏差。在(c,d)中，R1、R2和R3为相同条件下的重复测量。
【数据】OD600趋势：60%和70%乙醇中显著更低且下降；AFM：两种细胞均显示典型芽殖酵母特征；代谢活性：新鲜细胞更快更早饱和；测量温度：27°C和37°C
3.4 通过自发脱落评估细胞质量
图9显示了通过自发脱落评估细胞质量的结果。(a)为组合图，比较老化酵母细胞的脱落响应，数据沿纵轴位移以便可视化。9%及以上乙醇浓度下未观察到细胞脱落。(b)为脱落时间与乙醇浓度的关系，老化细胞在8% v/v乙醇以下呈指数趋势，新鲜细胞在50% v/v乙醇以下呈指数趋势。(c)为6%乙醇下新鲜与老化酵母自发脱落响应的原始Rth数据比较。(d)为选定乙醇浓度（0%、2%、4%和6%）下老化与新鲜酵母td50之差，呈指数曲线（R² = 0.9999）。(b)及(d)中数据点为至少三次测量的平均值，误差为标准偏差。
图10显示了玻璃载玻片上老化酵母细胞在不同乙醇浓度下的光学显微照片。代表性显微照片展示了老化酵母在玻璃上于不同乙醇浓度下的分散/聚集行为。第一列和第二列分别对应5×和50×显微镜物镜获取的图像。10%乙醇下细胞显示显著聚集，70%乙醇下聚集程度更高。
【数据】老化细胞脱落上限：9%乙醇；新鲜细胞脱落上限：50%乙醇；td50差值与乙醇浓度关系：指数拟合R² = 0.9999；聚集行为：10%乙醇显著聚集，70%乙醇聚集更高
讨论与解读
本研究开发了一种基于温度梯度诱导细胞自发脱落的无标记乙醇定量生物传感器。核心发现是td50随乙醇浓度呈非单调变化——从0%乙醇的约45分钟上升至20%乙醇的758分钟（约12.6小时），然后下降至50%乙醇时仍有脱落，60%及以上完全无脱落。细胞质量是关键的调节因素：新鲜酵母可响应至约50%乙醇，而老化酵母在8%以上即停止脱落，形成双重功能检测。表面张力测量证实乙醇降低表面张力呈单调指数趋势（λ = 19.2 ± 1.1% v/v），而光学显微镜揭示高浓度乙醇下细胞聚集。在Jack Daniel's威士忌实际样品中的验证结果与乙醇校准趋势一致。
20%乙醇处td50的尖锐峰值是本研究最引人注目的现象。作者指出这一非单调效应，尤其是20%处的尖锐最大值，目前仍无合理解释，有待进一步研究。该现象可能与高浓度乙醇对细胞膜流动性、膜蛋白构象或细胞-表面相互作用的复杂影响有关，但原文未提供机制层面的解释。
编译者解读：该方法的巧妙之处在于将细胞本身作为传感元件，通过热阻监测实现无标记检测，仅需加热器和温度探头即可运行，成本极低。20%乙醇处的td50峰值虽机制不明，但恰好覆盖了蒸馏酒（威士忌40%可稀释至该范围）和发酵液监测的实际需求窗口，具备应用潜力。细胞质量双重功能检测为微生物质量控制提供了新思路——但老化细胞在8%以上即无响应，提示该方法对细胞批次一致性要求较高，实际应用中需建立严格的质量控制标准。未来若能阐明20%峰值对应的细胞生理机制，将进一步提升该技术的科学价值与应用广度。
参考来源
Yongabi D, Krane A, Espreafico Guelerman Ramos H, Xavier Bustia S, Gruber J. A Label-Free Cell-Based Biosensor Method for Ethanol Quantification Using Temperature-Induced Spontaneous Cell Detachment. Biosensors (Basel). PMID: 42505431.
PMID: 42505431