来源：High-level amyrin production in Yarrowia lipolytica via metabolic and enzyme engineering.（Synth Syst Biotechnol）| 编译：DNA Lab Space
导读
香树脂醇（Amyrins）是具有广泛药理和化妆品应用价值的五环三萜类化合物，但植物中含量低、提取困难，制约了可持续供应。本研究以高产角鲨烯的解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）为底盘，通过整合长春花来源的多功能香树脂醇合酶基因（CrMAS），并结合结构引导的ERG1酶工程改造、辅因子工程及发酵优化，最终在5 L生物反应器中实现了α-香树脂醇1.7 g/L和β-香树脂醇0.5 g/L的产量，为目前报道的最高水平。
研究背景
α-和β-香树脂醇属于五环三萜类化合物，具有抗炎、抗癌、镇痛及神经保护等多种药理活性。近年研究发现，香树脂醇还具有黄嘌呤氧化酶抑制功能，有望用于痛风治疗；其酪氨酸酶抑制活性也使其成为治疗皮肤色素沉着障碍的候选药物。化妆品行业已将香树脂醇纳入抗衰老、亮肤及皮肤保护配方，全球商业需求旺盛。然而，植物中天然香树脂醇积累量低，提取过程繁琐低效，难以满足市场需求。利用微生物细胞工厂合成香树脂醇成为可持续替代方案，但现有研究多集中于酿酒酵母，且产量仍有较大提升空间。本研究选择解脂耶氏酵母作为底盘，通过代谢工程与酶工程相结合的策略，系统解除香树脂醇生物合成途径中的瓶颈。
研究方法
2.1 菌株与培养基
本研究所用主要宿主菌株为解脂耶氏酵母PO1f。常规培养采用YPD培养基，含10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨和20 g/L葡萄糖，于30°C、220 rpm振荡培养。酵母转化后，转化子在YNB培养基上筛选，YNB培养基含6.74 g/L酵母氮碱、20 g/L葡萄糖和5 g/L亮氨酸。质粒构建与扩增使用大肠杆菌JM109，培养于LB培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl），添加100 μg/mL氨苄青霉素，37°C培养16 h。大肠杆菌感受态细胞使用感受态细胞制备试剂盒（TaKaRa Bio Inc.，日本大阪）制备。
2.2 质粒构建与酵母转化
质粒、引物及菌株详细信息列于表S1–S3。来自长春花（Catharanthus roseus）的CrMAS基因（GenBank：JN991165）经密码子优化后由GENEWIZ Biotech Co., Ltd.（中国苏州）合成，合成基因的DNA序列列于表S4。内源基因基于解脂耶氏酵母基因组构建。所有质粒构建使用Gibson组装试剂盒（Sangon Biotech Co., Ltd.，中国上海），以pYLXP'1质粒为模板。组装完成的质粒经Sanger测序确认，引物由Sangon Biotech Co., Ltd.（中国上海）合成。酵母转化使用Frozen-EZ Yeast Transformation II试剂盒（Zymo Research，美国加州），转化细胞涂布于YNB琼脂平板，30°C培养2–4天。转化子经基因组DNA PCR确认后测序验证。对于26S核糖体DNA（rDNA）位点的多拷贝整合，阳性转化子在缺乏尿嘧啶的YNB平板上培养，随后按前述方法去除URA3筛选标记。引导RNA使用CHOPCHOP网站设计，整合位点均为解脂耶氏酵母非必需基因区域。角鲨烯、α-香树脂醇和β-香树脂醇标准品购自Macklin（中国上海）。
2.3 摇瓶与生物反应器发酵
种子培养：将工程菌株单菌落接种于YPD培养基，30°C、250 rpm振荡培养24 h。随后取1 mL培养物转接至含24 mL YPD培养基的250 mL摇瓶中，相同条件下培养。培养5天后收获细胞。
为提高香树脂醇产量，工程菌株采用5 L生物反应器进行补料分批发酵。接种物制备：挑取菌落接种于10 mL YPD培养基，30°C、220 rpm培养24 h。一级培养物转接至200 mL YPD培养基，继续培养24 h获得二级培养物。二级培养物接种至含2.2 L YPD的5 L生物反应器中。发酵过程中，pH用氨水维持在5.5，温度保持28°C，溶解氧通过搅拌级联（300–900 rpm）控制在25%，空气流量为3.0 vvm。初始D-葡萄糖浓度为40 g/L，葡萄糖以间歇方式补加（500 g/L储备液），维持浓度低于1 g/L。初始葡萄糖耗尽后，启动YPD补料，速率5–15 mL/h。
2.4 分析方法
角鲨烯和香树脂醇检测：取1 mL解脂耶氏酵母培养液转移至2 mL研磨管（MP）中，12,000 rpm离心10 min。弃去上清，细胞沉淀与等体积0.5 mm研磨珠混合，重悬于1 mL甲醇中。使用FastPrep程序（6.0 m/s，40 s）进行4个循环的细胞裂解。充分混匀后，12,000 rpm再次离心10 min，上清经0.22 μm滤膜过滤后进行气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析。角鲨烯和香树脂醇检测方法参照Kong等（2022）的描述。
2.5 序列检索与多序列比对
ERG1氨基酸序列从UniProt数据库获取，涵盖代表性真菌和哺乳动物物种，包括解脂耶氏酵母、酿酒酵母、白色念珠菌、烟曲霉、智人及其他真菌类群（表S4）。多序列比对使用CLUSTAL Omega默认参数进行。序列保守性和比对可视化使用Jalview分析，保守性评分基于比对序列的氨基酸同一性和理化相似性计算（图S10–S12）。
2.6 分子对接
ERG1三维结构从AlphaFold蛋白质结构数据库获取（UniProt ID：Q6C5R8），平均pLDDT评分>91.19。pLDDT（预测局部距离差异检验）评分提供每个残基的置信度估计，范围0–100，数值越高表示预测原子位置越可靠。使用MolProbity服务器验证查询蛋白建模结构的立体化学质量。角鲨烯三维结构（CID：638072）从PubChem以sdf格式下载。分子对接使用AutoDock Vina 1.2.0进行，采用标准对接协议预测配体-蛋白质相互作用。所得蛋白质-配体复合物根据计算结合能评估，使用PyMOL 3.1分子图形系统可视化和分析，配体5 Å范围内的残基纳入相互作用分析。
2.7 计算隧道工程分析
ERG1作为FAD依赖性单加氧酶，其催化功能必需的FAD辅因子通过AlphaFill引入——该方法通过局部结构比对将同源晶体结构中的实验测定配体转移至预测模型。人源角鲨烯环氧酶（PDB：6C6N）作为模板，序列同一性44.71%，移植的FAD局部r.m.s.d.为0.39 Å，表明定位高度可信。PyMOL目视检查确认异咯嗪环在Rossmann折叠域中的正确定位，并保留了保守的FAD结合基序（Gly-rich环、GD-和DG基序）。所有隧道分析均锚定于FAD N5–C4a催化中心，而非底物结合位点，为所有变体提供了固定且实验依据明确的起点。这种FAD锚定方法可实现明确、可重复的测量，不受突变依赖性底物姿态变化和对接不确定性的影响，克服了以往基于角鲨烯锚定的CAVER研究的局限。
隧道分析使用CAVER 3.0（PyMOL插件）进行，野生型、T202V和T202V/M308L变体的恒定参数如下：最小探针半径0.9 Å，壳层深度4 Å，壳层半径3 Å，聚类阈值3.5 Å，最大距离3 Å，期望半径5 Å。从每个变体的主导隧道簇中，CAVER量化了五个几何描述符：（1）瓶颈半径（Å），即隧道最小半径，是角鲨烯进入的主要空间位阻因素；（2）隧道长度（Å），即从FAD起点到蛋白质表面的线性路径距离，较短的隧道长度反映更直接的进入路径；（3）曲率（无量纲），衡量偏离直线路径的程度。
研究结果
3.1 解脂耶氏酵母中香树脂醇的生物合成
为提升解脂耶氏酵母中α-香树脂醇的产量，研究采用前期工程化菌株YA-0作为出发菌株，该菌株在补料分批发酵条件下角鲨烯积累量达51.2 g/L。首先通过同源重组将来自长春花的多功能香树脂醇合酶基因（CrMAS）整合至YA-0基因组，获得菌株YA-1。CrMAS表达由组成型pTEF启动子驱动，以XPR2终止子终止。GC-MS分析确认YA-1菌株α-香树脂醇产量为15.75 ± 0.47 mg/L，β-香树脂醇为4.45 ± 0.13 mg/L，同时角鲨烯水平降至2.41 ± 0.07 g/L，表明代谢流已从角鲨烯转向α,β-香树脂醇合成途径。
为增加α-和β-香树脂醇生物合成的直接前体2,3-氧化角鲨烯的供应，在YA-1菌株中额外引入一个基因组拷贝的ERG1基因，获得菌株YA-2。该菌株α-香树脂醇产量为22.26 ± 0.66 mg/L，β-香树脂醇为6.28 ± 0.18 mg/L，角鲨烯积累仍维持在较低水平（1.95 ± 0.06 g/L）。尽管YA-2菌株中α-和β-香树脂醇产量有所增加，但角鲨烯的大量积累表明ERG1活性仍不足以将碳流完全导向2,3-氧化角鲨烯，该步骤被鉴定为主要代谢瓶颈。
研究假设在YA-2菌株rDNA位点增加ERG1拷贝数可增强香树脂醇生物合成。然而结果显示α-和β-香树脂醇产量下降，角鲨烯积累无显著变化，部分工程菌株甚至完全丧失香树脂醇生产能力。这一降低表明ERG1过度表达造成严重蛋白质负担并诱导内质网应激，压垮了细胞折叠机器，破坏了下游CrMAS酶最佳折叠和活性所需的膜环境。这些观察与既往研究结果一致。研究还尝试在rDNA位点增加CrMAS拷贝数，但α-和β-香树脂醇产量无显著提升，角鲨烯积累也未减少。这种缺乏改善可能归因于中间体2,3-氧化角鲨烯供应不足，表明该前体在途径中构成限制因素。为在不施加蛋白质过表达代谢负担的情况下缓解此瓶颈，选择YA-1菌株进行进一步优化，策略从增加基因剂量转向ERG1蛋白质工程，以增强角鲨烯向2,3-氧化角鲨烯的催化转化。
3.2 ERG1工程改造提升香树脂醇产量
#### 3.2.1 ERG1跨真核物种的序列保守性分析
为研究角鲨烯环氧酶（ERG1/SQLE）的进化保守性并识别具有潜在功能相关性的残基，利用来自多种真菌和哺乳动物物种的ERG1同源序列进行多序列比对。分析序列覆盖广泛的进化范围，可识别ERG1蛋白内的保守区和分歧区。比对结果显示ERG1 N端催化核心区域高度保守，与其黄素依赖性单加氧酶的功能一致。多个区域在真菌和哺乳动物同源物中均表现出强序列保守性，表明这些区域可能受到与必需催化或结构功能相关的进化约束。相比之下，非保守残基在不同物种间表现出变异性，表明其进化约束较低。这些位置可能耐受替换，在不损害酶功能的前提下容纳氨基酸变化，是蛋白质工程的潜在靶点。解脂耶氏酵母ERG1与曲霉属物种（烟曲霉，50.32%）序列保守性最高，反映了子囊菌门内较近的进化关系。与哺乳动物同源物（智人，45.51%；小鼠，44.42%）的中等序列同一性表明ERG1是真核生物中功能重要且中等保守的蛋白质，与其在麦角固醇生物合成（真菌膜的关键组分）中的必需作用一致。
#### 3.2.2 ERG1催化口袋保守残基的鉴定
为绘制底物-蛋白质相互作用图谱并识别参与角鲨烯识别的残基，进行了角鲨烯与ERG1结构的分子对接。对接模型将角鲨烯定位于预测FAD结合区附近的疏水腔内，与角鲨烯环氧酶的已知催化机制一致。对接的角鲨烯分子主要通过疏水相互作用与结合口袋内壁残基稳定结合，同时若干极性和带电残基可能有助于底物定向或过渡态稳定化。位于对接角鲨烯5 Å半径内的残基包括I27、R55、V57、G58、E59、L60、H137、T202、L249、Y251、L261、M308、P309、S311、D328、R333、P335、G338、G340和M341。对接模型获得结合自由能为−7.45 kcal/mol，表明底物-蛋白质相互作用具有有利的结合亲和力，支持预测相互作用的构象合理性。
为优先选择功能分析靶点，将对接结果与多序列比对获得的进化保守性数据整合。位于对接底物结合口袋内的残基根据其在17个代表性真菌和哺乳动物物种中的保守程度进行分类。R55、V57、G58、E59、L60、H137、T202、L249、Y251、L261、D328、R333、P335、G338、G340和M341等多个残基高度保守，表明它们在催化、底物定位或结构稳定性中发挥关键作用。中等保守残基如I27、S311、M308和P309被鉴定为保守突变候选位点，可在不损害结构完整性的前提下微调底物相互作用。值得注意的是，T202保守性极低，是适合更激进突变以优化底物结合或催化效率的灵活位点。综合分析界定了保守与可变残基，为ERG1靶向工程提供了理性框架。
#### 3.2.3 丙氨酸扫描突变对活性位点残基的功能评估
为评估各残基对ERG1催化效率的功能贡献，将选定的活性位点残基逐一替换为丙氨酸并在YA-1菌株中表达。通过同源重组利用侧翼区域替换解脂耶氏酵母内源ERG1编码区。酶性能通过监测α-和β-香树脂醇产量以及定量残留角鲨烯水平间接评估。香树脂醇产量增加伴随角鲨烯积累减少被解释为ERG1催化效率提高。R55A、E59A、R333A和L261A突变显著降低香树脂醇产量同时增加角鲨烯积累。其中R55A突变体香树脂醇产量最低，α-香树脂醇6.15 ± 0.21 mg/L，β-香树脂醇1.59 ± 0.08 mg/L，角鲨烯积累增至2.42 ± 0.06 g/L。对接分析显示R55A突变降低了角鲨烯结合亲和力，结合自由能为−6.9 kcal/mol，而野生型为−7.45 kcal/mol，表明该替换削弱了底物稳定化。
相比之下，T202A、G338A、S311A和M308A突变体香树脂醇产量增加。
讨论与解读
本研究以高产角鲨烯工程菌株为底盘，通过系统优化MVA途径和乙酰辅酶A代谢提供了高效的上游前体供应。结果表明，香树脂醇生物合成的代谢瓶颈位于环化步骤上游——具体为ERG1催化的角鲨烯向2,3-氧化角鲨烯的转化。虽然ERG1对内源甾醇生物合成至关重要，但其固有催化能力不足以支撑高效三萜合成所需的高通量。以往酵母代谢工程多集中于过表达MVA早期酶或下调ERG9/ERG7等竞争分支来重定向代谢流，但直接对酶本身进行工程改造来解决此瓶颈的研究尚属空白。本研究填补了这一空缺，提供了ERG1是可调控且高价值靶点的首个机制性证据。工程化ERG1变体通过高效转化角鲨烯为2,3-氧化角鲨烯，直接解决了这一限制。
【编译者解读】该研究最值得称道之处在于将结构生物学工具（AlphaFold预测、分子对接、隧道分析）系统性地引入三萜合成途径的瓶颈酶改造中，实现了从"经验性过表达"到"理性酶设计"的范式转变。FAD锚定的隧道分析策略尤为巧妙，规避了传统底物锚定方法受突变影响的缺陷。不过，ERG1突变体在摇瓶与5 L发酵罐之间的产量放大效应（α-香树脂醇从220.81 mg/L提升至1.7 g/L）主要依赖补料策略优化，酶工程与发酵工程的协同贡献度尚需更精细的对照实验加以区分。
参考来源
Elsharawy H, Abdullah CN, Yin X, Zhou J. High-level amyrin production in Yarrowia lipolytica via metabolic and enzyme engineering. Synth Syst Biotechnol. PMID: 42518876.
PMID: 42518876