来源：Rational Design and Characterization of a Mutated Nanobody for Specific Targeting of Heparan Sulfate.（Antibodies (Basel)）| 编译：DNA Lab Space
导读
硫酸乙酰肝素（HS）作为多种病毒入侵宿主细胞的关键表面受体，是抗病毒研究的重要靶点。本研究以纳米抗体（PDB: 7TJC）为骨架，综合运用分子对接、虚拟丙氨酸扫描、定点突变、分子动力学模拟及ELISA实验，理性设计并构建了靶向HS的突变纳米抗体HS-Mut-Nb1。该突变体通过三个点突变（Phe47Arg、Asp99Tyr、Tyr108Pro）的组合，将结合自由能提升至−83.26 ± 3.06 kcal/mol，亲和力达KD = 65.87 nM，且特异性显著改善。研究为HS-病毒互作机制解析及抑制剂开发提供了新型候选分子。
研究背景
病毒感染始于病毒与宿主细胞表面受体的结合。多种无包膜病毒依赖其结构蛋白与细胞表面糖胺聚糖（GAGs）的相互作用完成吸附过程。其中，硫酸乙酰肝素因参与病毒感染的吸附、进入和复制等多个关键阶段而备受关注。HS是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPGs）的线性多糖侧链，广泛分布于哺乳动物细胞表面和细胞外基质中。生理条件下，其负电荷特性可有效结合带正电荷的病毒粒子，从而增强病毒吸附效率和感染性。例如，猪圆环病毒2型（PCV2）的衣壳蛋白直接与HS互作介导病毒吸附；HS缺陷细胞研究显示，HS缺失显著抑制登革病毒2型（DENV-2）的吸附，而对寨卡病毒（ZIKV）而言，HS虽非吸附所必需，却在吸附后复制阶段发挥主要作用并参与病毒诱导的细胞凋亡。这些发现揭示了HS在病毒吸附与进入中的关键角色，其结构多样性和广泛分布使其成为理解病毒-宿主互作及开发抗病毒策略的重要分子靶标。
研究方法
2.1 实验材料
HS、氯霉素（CAP）、硫酸角质素（KS）和硫酸软骨素（CS）分别由MedChemExpress（美国新泽西州普林斯顿）、Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）、上海阿拉丁生化科技股份有限公司（中国上海）和河北华阳生物科技有限公司（中国衡水）提供。小鼠抗His标签单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG（goat anti-mouse IgG-HRP）购自Proteintech Group, Inc.（美国伊利诺伊州罗斯蒙特）。牛血清白蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）由Sigma-Aldrich贸易有限公司（中国上海）提供。统计分析使用GraphPad Prism 10.4.2（GraphPad Software，美国马萨诸塞州波士顿）完成。
【数据】材料来源：MedChemExpress、Sigma-Aldrich、上海阿拉丁、河北华阳；抗体来源：Proteintech；统计软件：GraphPad Prism 10.4.2
2.2 分子对接
首先，野生型Nb的三维（3D）结构骨架从RCSB蛋白质数据银行（PDB，ID: 7TJC）获取。对于HS，选择具有代表性的二糖重复单元作为对接的最小结合基序，其3D结构从PubChem数据库获取。其次，使用AutoDock 4软件执行HS与野生型Nb之间的对接模拟。网格盒中心设定为（X = 45.55, Y = 24.38, Z = 51.48），尺寸为（X = 18 Å, Y = 18 Å, Z = 18 Å）。第三，对接过程中，最大搜索构象数设置为10,000。采用遗传算法进行构象采样和打分，所有其他参数设置为默认值。最后，根据对接分数对构象进行排序，选择最优构象。
【数据】软件：AutoDock 4；网格中心：(X = 45.55, Y = 24.38, Z = 51.48)；网格尺寸：18 Å × 18 Å × 18 Å；最大搜索构象数：10,000；算法：遗传算法
2.3 丙氨酸扫描与定点突变
基于对接结果，使用Discovery Studio Visualizer 2019对HS结合位点5 Å半径范围内的氨基酸残基进行虚拟丙氨酸扫描。随后，对虚拟丙氨酸扫描分析鉴定的关键残基进行定点突变，以验证其在HS结合中的作用。
【数据】软件：Discovery Studio Visualizer 2019；扫描半径：5 Å
2.4 分子动力学模拟
使用PyMOL 2.5（Schrödinger，美国纽约州纽约）构建点突变模型，并作为MD模拟的初始构型。为确保结果的可重复性，每个系统执行两次独立的重复模拟，仅初始随机速度不同，所有其他参数和条件保持一致。所有模拟使用GROMACS 2022.5软件包执行。模拟前，系统用NaCl抗衡离子中和，复合物进行2000步能量最小化。每个系统在周期性边界条件下于310 K和1.0 bar下进行100 ns MD模拟。蛋白质与模拟盒边缘的最小距离沿X、Y、Z方向设定为1.0 nm，积分时间步长为2 fs。能量最小化采用最速下降算法，库仑相互作用和范德华相互作用的截断距离设定为1.4 nm。基于模拟轨迹，计算并分析了HS-Mut-Nb1复合物的均方根偏差（RMSD）、均方根波动（RMSF）、回旋半径（Rg）、溶剂可及表面积（SASA）和分子间氢键数量。复合物的结合自由能（ΔG）通过分子力学泊松-玻尔兹曼表面积（MMPBSA）方法计算，用于评估结构稳定性和分子间相互作用强度。同时，MMPBSA在残基水平上分解每个关键残基的结合能贡献。
【数据】软件：PyMOL 2.5、GROMACS 2022.5；模拟时间：100 ns；温度：310 K；压力：1.0 bar；能量最小化步数：2000步；积分步长：2 fs；截断距离：1.4 nm；重复次数：2次独立模拟
2.5 重组蛋白的表达与纯化
根据Mut-Nb1的氨基酸序列合成其编码基因，并克隆至pET-28a表达载体。重组质粒由通用生物（安徽）股份有限公司（中国滁州）合成和构建。重组蛋白Mut-Nb1的诱导表达和纯化具体流程如下：第一，将重组Mut-Nb1质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，转化细胞以1:100稀释接种至5 mL卡那霉素抗性LB液体培养基中。第二，当OD600值达到0.6–0.9时，向培养基中加入异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度1.0 mmol/L，随后于15 °C、200 r/min振荡诱导过夜。第三，通过10,000 rpm、4 °C离心5 min收集细胞，重悬于PBS缓冲液（pH 7.4），并在冰上超声裂解10 min直至悬液澄清。然后，重组Mut-Nb1首先通过Ni-NTA亲和层析富集纯化以去除大部分杂质。洗脱级分浓缩后，通过凝胶过滤层析（GFC）进一步纯化。最后，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）评估纯化的Mut-Nb1蛋白。野生型Nb在相同条件下诱导表达。
【数据】表达载体：pET-28a；宿主菌：E. coli BL21 (DE3)；培养基：5 mL LB（卡那霉素抗性）；接种稀释比：1:100；诱导时机：OD600 = 0.6–0.9；IPTG终浓度：1.0 mmol/L；诱导温度：15 °C；诱导时间：过夜；转速：200 r/min；离心：10,000 rpm、4 °C、5 min；超声裂解：冰上10 min；纯化方法：Ni-NTA亲和层析 + 凝胶过滤层析
2.6 Mut-Nb1的亲和力与特异性检测
Mut-Nb1与HS的结合亲和力通过ELISA测定。简要流程如下：预偶联的HS-OVA和CAP-OVA用碳酸盐缓冲液（CBS，pH 9.6）稀释至2.0 μg/mL，以100 μL/孔（三复孔）包被ELISA板，4 °C孵育过夜。OVA作为阴性对照。包被后，板用1%（w/v）BSA于37 °C封闭1 h。随后，板与纯化的Mut-Nb1（10–0.02 μg/mL）于37 °C孵育30 min。加入抗His标签单克隆抗体（稀释1:1000），37 °C孵育30 min。然后，加入山羊抗小鼠IgG-HRP（稀释1:1000）100 μL/孔，37 °C孵育30 min。每步孵育之间，板用含Tween-20的磷酸盐缓冲液（PBST）洗涤五次并拍干。检测时，加入100 μL/孔的3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）底物溶液显色。加入50 μL/孔的2 M H₂SO₄终止反应。立即用酶标仪测量每孔的OD450值。平衡解离常数（KD）通过在GraphPad Prism 10.4中使用单位点特异性结合模型拟合饱和结合曲线确定，以产生50%平台期吸光度的纳米抗体浓度作为KD值。在该模型下，基于纳米抗体-抗原相互作用的单价特性，拟合的半最大效应浓度（EC50）对应于达到半最大特异性结合（Bmax/2）所需的抗体浓度，因此报告为内在KD。
Mut-Nb1的特异性通过测量其与HS结构类似物的结合来评估。所有类似物以2.0 μg/mL的固定浓度包被，Mut-Nb1以2.5 μg/mL的浓度使用上述相同ELISA方法检测。特异性通过以下两个参数评估：（1）阳性/阴性（P/N）比值：P/N = OD450（阳性对照）/OD450（阴性对照）。P/N比值≥ 2.1视为特异性结合；P/N < 2.1视为非特异性或阴性。（2）交叉反应率（CR%）：CR% = [HS的EC50]/[CAP或HS结构类似物的EC50] × 100%。HS类似物的EC50值使用上述方法测定。CR%越低表示交叉识别越弱，特异性越高。
【数据】包被浓度：2.0 μg/mL（HS-OVA、CAP-OVA）；包被量：100 μL/孔；包被缓冲液：CBS（pH 9.6）；封闭：1% BSA、37 °C、1 h；Mut-Nb1浓度范围：10–0.02 μg/mL；一抗稀释度：1:1000；二抗稀释度：1:1000；洗涤：PBST×5次；TMB用量：100 μL/孔；终止液：2 M H₂SO₄ 50 μL/孔；特异性检测浓度：类似物2.0 μg/mL、Mut-Nb1 2.5 μg/mL
研究结果
3.1 分子对接
分子对接结果（图1）显示，野生型Nb与HS结合的活性位点位于野生型Nb的互补决定区3（CDR3）和框架区（FRs）共同形成的空腔内（图1A），对接分数为−7.30 kcal/mol（Mut-Nb1为−8.10 kcal/mol）。该结合相互作用主要由关键残基介导，包括Phe37、Tyr59、Ala97、Asp99、Asp105、Tyr108和Arg109（图1B）。具体而言，HS的磺酸基团与野生型Nb的Phe37、Tyr59和Tyr108形成π-硫相互作用；与Tyr59、Ala97和Asp105形成稳定的常规氢键；与Asp99和Arg109形成碳-氢键。同时，HS与空腔周围的多个残基之间观察到范德华力（图1C）。这些结果表明，HS与野生型Nb之间的结合相互作用主要由氢键、π-硫相互作用和范德华力驱动。
【数据】对接分数：野生型Nb为−7.30 kcal/mol，Mut-Nb1为−8.10 kcal/mol；关键残基：Phe37、Tyr59、Ala97、Asp99、Asp105、Tyr108、Arg109
3.2 虚拟丙氨酸扫描
虚拟丙氨酸扫描结果表明，Phe47、Tyr59、Arg109、Phe37和Tyr108这五个残基表现出相对较高的突变能（>0.5 kcal/mol），具有预测的去稳定效应，表明这些残基是HS与野生型Nb相互作用的关键贡献者（表1）。值得注意的是，尽管Asp99的突变能相对较低（<0.5 kcal/mol），但其静电项的绝对值（−0.33）远高于其他残基，表明该残基在HS与野生型Nb结合界面的静电稳定中发挥关键作用。因此，这六个残基被鉴定为HS与野生型Nb相互作用的关键残基，并被选择用于后续定点突变。
【数据】高突变能残基（>0.5 kcal/mol）：Phe47、Tyr59、Arg109、Phe37、Tyr108；Asp99静电项绝对值：−0.33
3.3 定点突变
单位点和双位点饱和突变的结果分别见表2和表3。单位点饱和突变共设计6 × 20 = 120个突变变体，双位点饱和突变共构建C₆² × 20 × 20 = 6000个组合变体。单位点饱和突变数据显示，Asp99突变为Phe、Gln、Asn、Tyr、Leu或Cys；Tyr108突变为Phe、Pro或Val；以及Phe47突变为Arg可增强HS与野生型Nb之间的结合亲和力。
基于单位点饱和突变结果，进行了三位点组合突变，共产生1 × 7 × 3 = 21个突变变体（表4）。对双位点饱和突变和三位点组合突变结果的分析表明，三位点突变体Phe47→Arg、Asp99→Tyr和Tyr108→Pro是促进HS与野生型Nb结合亲和力的最优变体。
【数据】单位点饱和突变变体数：120个；双位点饱和突变变体数：6000个；三位点组合突变变体数：21个；最优组合：Phe47Arg + Asp99Tyr + Tyr108Pro
3.4 分子动力学模拟
在100 ns MD模拟中，通过RMSD评估HS-Mut-Nb1复合物的构象稳定性（图2A）。两次独立模拟的RMSD值在初始阶段迅速下降，随后达到平台期。第二次模拟（2nd）的整体RMSD水平略高于第一次（1st），但两者均表现出稳定波动，表明复合物已达到动态平衡。相比之下，游离Mut-Nb1的整体RMSD波动范围为0.15–0.20 nm，明显大于两个模拟组中复合物的波动范围。该结果表明，HS结合有效限制了Mut-Nb1骨架的柔性运动，提高了复合物体系的构象稳定性。RMSF分析显示，两次模拟的残基柔性谱高度一致，仅在个别残基处存在约1 Å的微小差异，证明了HS-Mut-Nb1复合物构象柔性的高可重复性（图2B）。进一步分析显示，Mut-Nb1的His55残基表现出最显著的波动，这与理论预期一致。这可归因于His55位于CDR环区，该区域本身具有高柔性。相比之下，游离Mut-Nb1的整体RMSF基线较低，表明其在游离状态下采取相对紧凑的构象。Rg和SASA结果显示，游离Mut-Nb1表现出较低的值，而复合物的两次模拟表现出高度一致的分子紧凑性和表面暴露度。两次模拟之间的差异对于Rg约为0.1 Å，对于SASA约为2 Å，均在统计误差范围内，进一步验证了HS-Mut-Nb1复合物的结构稳定性（图2C,D）。氢键总数随时间波动，平均为5–6个氢键（图2E）。氢键存在图谱显示2–3个核心稳定氢键在整个模拟过程中持续存在，表明HS小分子稳定结合在Mut-Nb1蛋白空腔内，并与关键氨基酸残基形成稳定相互作用（图2F,G）。
两次独立模拟的结合自由能分解结果（图3A）显示，各能量组分的贡献趋势高度一致，总结合自由能（ΔG）分别为−83.14 ± 3.86 kcal/mol和−83.37 ± 1.95 kcal/mol（平均值：−83.26 ± 3.06 kcal/mol）。这表明HS-Mut-Nb1复合物表现出强的热力学结合亲和力，从能量角度进一步证实了HS-Mut-Nb1相互作用的稳定性。关键能量贡献残基分析（图3B）表明，Arg47突变在两次模拟中均提供主导性能量贡献（ΔΔG分别为−20.59和−18.01 kcal/mol），而其他关键残基的贡献相对较小。
【数据】模拟时间：100 ns；游离Mut-Nb1 RMSD波动范围：0.15–0.20 nm；RMSF差异：约1 Å；Rg差异：约0.1 Å；SASA差异：约2 Å；平均氢键数：5–6个；核心稳定氢键数：2–3个；ΔG₁ = −83.14 ± 3.86 kcal/mol；ΔG₂ = −83.37 ± 1.95 kcal/mol；平均ΔG = −83.26 ± 3.06 kcal/mol；Arg47贡献：ΔΔG = −20.59和−18.01 kcal/mol
3.5 重组蛋白的表达与纯化
SDS-PAGE分析证实重组蛋白Mut-Nb1和野生型Nb在大肠杆菌BL21中成功诱导表达（图4A）。纯化的Mut-Nb1和野生型Nb蛋白分别在泳道1和泳道2中检测到，表观分子量约为15 kDa，与理论分子量一致。
【数据】表达宿主：E. coli BL21；表观分子量：约15 kDa
3.6 亲和力与特异性评估
通过间接ELISA同时体外测定Mut-Nb1和野生型Nb与HS及CAP的结合亲和力，并基于单位点特异性结合模型进行非线性回归拟合（图4B,C）。与OVA阴性对照组相比，随着Mut-Nb1浓度逐渐增加，HS对应的OD450值呈现典型的S形剂量依赖性增加。Mut-Nb1对HS的KD值计算为65.87 nM，表明Mut-Nb1与HS之间具有强结合亲和力（图4B）。相比之下，Mut-Nb1对CAP的结合较弱，KD值为608.90 nM。对于野生型Nb，CAP和HS的KD值分别为77.08 nM和446.92 nM（图4C）。比较分析显示，相对于野生型Nb，Mut-Nb1对靶标HS的结合亲和力提高了6.78倍，但对CAP的亲和力降低了5.80倍。
使用相同的间接ELISA系统，进一步评估了两种Nb对HS、CAP及HS结构类似物（CS和KS）的结合特异性（图4D,E）。Mut-Nb1对CAP、CS和KS的P/N值分别为1.87、1.15和0.82，均低于特异性结合的阈值2.1，而对靶标HS的P/N值达到3.84（图4D）。相比之下，野生型Nb对CAP、CS、KS和HS的P/N值分别为1.52、4.31、1.26和1.15（图4E）。综合这些结果表明，突变显著提高了Mut-Nb1识别靶标HS的特异性。
此外，交叉反应（CR）分析进一步量化了Mut-Nb1的特异性。Mut-Nb1对CAP、CS和KS的CR值均低于6.60%，证实其交叉反应性极低，对HS具有高度特异性。
【数据】Mut-Nb1对HS的KD：65.87 nM；Mut-Nb1对CAP的KD：608.90 nM；野生型Nb对CAP的KD：77.08 nM；野生型Nb对HS的KD：446.92 nM；亲和力提升倍数（HS）：6.78倍；亲和力降低倍数（CAP）：5.80倍；Mut-Nb1的P/N值：HS = 3.84、CAP = 1.87、CS = 1.15、KS = 0.82；野生型Nb的P/N值：CAP = 1.52、CS = 4.31、KS = 1.26、HS = 1.15；Mut-Nb1的CR：< 6.60%
讨论与解读
HS作为初始黏附受体，参与多种病毒的吸附与进入过程，包括DENV-2、PCV2、PRRSV、PDCoV、VACV、RV、PRV和HAdV等，显著影响病毒的致病性、组织嗜性和宿主范围。本研究选择PDB: 7TJC作为野生型Nb骨架，基于两方面考量：结构上，该天然氯霉素结合Nb具有典型的配体结合模式，将抗原夹在CDR3区与FR2之间；同时，其原始配体氯霉素的分子大小和理化特性与HS具有中等相似性，赋予7TJC天然有利的口袋微环境。此外，其与HS的分子对接分数为−7.30 kcal/mol（<−6.0 kcal/mol），初步验证了该Nb对HS具有潜在结合能力，适合作为亲和力成熟和特异性重定向的理想起始骨架。
本研究通过整合虚拟丙氨酸扫描、定点突变和MD模拟，系统优化了Nb对HS的结合性能。三点突变组合（Phe47Arg、Asp99Tyr、Tyr108Pro）将结合自由能提升至−83.26 ± 3.06 kcal/mol，ELISA实验证实其KD达65.87 nM，且对HS结构类似物的交叉反应性极低（CR < 6.60%）。值得注意的是，Arg47突变在结合自由能分解中贡献了主导性能量（ΔΔG = −20.59和−18.01 kcal/mol），表明引入精氨酸的正电荷与HS的负电荷磺酸基团之间形成了强静电相互作用。
编译者解读
本研究展示了计算驱动蛋白工程策略的典型范式——从结构信息出发，经虚拟筛选、分子动力学验证到实验确认的完整闭环。三点突变的组合效应并非简单叠加，Arg47的静电贡献与Asp99Tyr、Tyr108Pro的疏水/芳香重排协同作用，体现了理性设计中对结合界面化学互补性的精细调控。该方法路径对合成生物学中其他多糖-蛋白互作体系（如肝素、硫酸软骨素）的靶向分子开发具有直接参考价值。不足之处在于，研究仅停留在分子结合层面，未涉及细胞水平的HS竞争性抑制实验，其抗病毒功能尚需进一步验证。
参考来源
Hao J, Xu Q, Cui Y, Wang W, Huang K. Rational Design and Characterization of a Mutated Nanobody for Specific Targeting of Heparan Sulfate. Antibodies (Basel). PMID: 42496278.
PMID: 42496278