来源：From CRISPR-Cas to Argonautes: Defense systems of bacteria and archaea in the hydrothermal deep subsurface.（ISME Commun）| 编译：DNA Lab Space
导读
微生物防御系统是病毒与宿主互作的核心，但在极端环境微生物群落中研究甚少。本研究聚焦墨西哥湾瓜伊马斯盆地Ringvent热液区的深海沉积物与岩石样本，系统分析了原核生物防御基因的组成与分布。研究发现，限制修饰系统与流产感染系统在沉积物各深度广泛分布，而CRISPR-Cas系统主要存在于温带表层沉积物中，原核Argonaute基因则多见于最高81.8°C高温下的古菌MAGs。总体防御基因库随深度增加而缩减，系统发育是决定性控制因素。
研究背景
微生物在自然环境中经历着激烈的生物互作，包括持续暴露于病毒捕食。据估计，生物圈中存在近10³¹个病毒颗粒，仅全球海洋每秒就发生多达10²³次感染事件。为应对这一压力，原核生物演化出多种防御机制：限制修饰系统区分自身与非自身DNA，流产感染系统通过牺牲被感染细胞来限制病毒传播，以及以CRISPR-Cas为代表的适应性免疫系统。近期一项大规模基因组调查在近18,000个细菌和古菌基因组中鉴定出至少21种不同的抗噬菌体防御系统，凸显了这些免疫库的模块化与复杂性。
研究方法
采样
所有微生物样本均无菌处理，立即在液氮中速冻于50 ml Falcon管中，保存于−80°C（污染控制细节见文献[20]）。对冷冻（−80°C）的全岩芯剖面深部沉积物（U1547和U1548站位）内部（去除岩芯外2 cm）使用无菌刮刀进行二次取样，取0.5 g等分试样用于DNA提取（表1）。从IODP U1546B孔第一个沉积物岩芯顶部的泥线流体中取0.5 ml（含海水与细悬浮沉积物颗粒的混合物）用于DNA提取，以评估钻探流体的微生物组成。岩石样本优先选取可能允许热液循环的矿物结壳脉体，在船上于厌氧手套箱中用无菌锤在灭菌金属碗中立即压碎，装入50 ml Falcon管中，−80°C冷冻保存。在更大范围的脉岩样本中，仅一个样本（1547D-10R1）产生了足量DNA用于宏基因组测序（表1）。
表1 产出宏基因组的样本。IODP站位与钻孔、岩芯与剖面、样本描述、深度[m]（取整）、原位温度（°C，取整）、细胞数ml⁻¹[21]、宏基因组发表信息：U1547B 1H2（0.5 g沉积物，2.2 m，14.2°C，n.d.）[19]；U1547B 1H3（0.5 g沉积物，3.6 m，15.0°C，n.d.）[19]；U1547B 2H2（0.5 g沉积物，8.7 m，17.5°C，1.25×10⁸）[19]；U1547B 2H3（0.5 g沉积物，9.9 m，17.8°C，n.d.）[19]；U1547B 3H3（0.5 g沉积物，19.3 m，23.6°C，9.32×10⁶）[19]；U1547B 5H2（0.5 g沉积物，36.9 m，31.9°C，1.35×10⁶）[19]；U1547B 5H3（0.5 g沉积物，38.1 m，34.0°C，n.d.）[19]；U1547B 7H3（0.5 g沉积物，57.4 m，42.3°C，3.2×10⁵）[19]；U1547B 8H2（0.5 g沉积物，65.8 m，46.6°C，4.3×10⁴）[19]；U1547B 9H2（0.5 g沉积物，74.3 m，51.0°C，3.85×10⁴）[19]；U1547B 9H3（0.5 g沉积物，76.0 m，51.9°C，n.d.）[19]；U1547D 10R1（压碎脉岩，20 ml，134.5 m，81.8°C，n.d.，本文发表）；U1548B 2H3（0.5 g沉积物，8.9 m，13.7°C，9.96×10⁷）[19]；U1548B 4H7（0.5 g沉积物，33.5 m，33.5°C，1.78×10⁷）[19]；U1548B 8H5（0.5 g沉积物，69.5 m，62.4°C，1.01×10³）[19]；U1548C 1H3（3×0.5 g沉积物，2.78 m，18.6°C，n.d.，本文发表）；U1548C 3H6（3×0.5 g沉积物，24.17 m，39.1°C，n.d.，本文发表）；U1548C 5H4（3×0.5 g沉积物，40.38 m，54.6°C，n.d.，本文发表）。
Ringvent站位（U1547和U1548）沉积物与岩石样本概览，包括先前发表的宏基因组[19]及本文新提取测序的样本（1547D-10R1压碎脉岩；1548C-1H3、3H6和5H4沉积物）。深度按IODP的CSF-A术语标注。样本描述栏中带星号者为产出防御系统基因的样本。更大范围Ringvent样本的细胞数与DNA浓度[21]汇总于表S3。
DNA提取
使用MP Biomedical FastDNA™ SPIN Kit从0.5 g沉积物或合并的3×0.5 g沉积物样本中提取DNA，针对地下沉积物进行了改良[21]。对于脉岩及压碎岩石样本（表S1），使用MP Biomedical FastDNA™ SPIN Kit并附加补充改良步骤（补充方法）进行DNA提取。DNA运送至特拉华大学测序与基因分型中心进行文库构建（包括Illumina文库质量分析、Qubit定量和Fragment Analysis，随后进行ddPCR）和宏基因组测序，采用Element Aviti 2×150 bp High Output平台。文库构建与测序在UDSG内部微调，以允许对DNA含量<1 ng/μl的低DNA样本进行测序（补充材料）[21]。
【数据】样本量：18个（17个沉积物+1个脉岩）；DNA提取试剂盒：MP Biomedical FastDNA™ SPIN Kit；测序平台：Element Aviti 2×150 bp；DNA检测下限：<1 ng/μl
宏基因组处理、组装与MAG分箱
使用MetaWRAP v1.3.2中的read_qc模块从原始测序读段中去除Illumina接头和低质量序列。使用FastQC v0.12.1评估修剪前后的序列质量。使用MEGAHIT v1.2.9对来自污染控制样本的高质量读段进行从头组装。随后使用Bowtie2（v2.5.4）从组装的对照contigs构建索引，并将环境样本读段比对到该污染物序列数据库以识别潜在污染物。使用Samtools v1.17提取未比对的读段（代表非污染序列），保留用于下游分析。所得清洁读段（补充结果）使用MEGAHIT进行独立组装，参数为--min-count 2 --k-min 41 --k-max 141 --k-step 10。应用三种宏基因组分箱程序MetaBAT2（v2.12.1）、MaxBin2（v2.2.4）和CONCOCT（v1.1.0），采用默认参数从组装的contigs重建宏基因组组装基因组（MAGs）。为确保下游温度和深度分辨比较所需的样本特异性分辨率，避免了多样本分箱；样本特异性分箱策略对低完整度MAGs的防御系统恢复采取了较为保守的接受度。使用MetaWRAP中的binning_refinement模块对所得基因组bins进行优化，生成最终MAG集合。使用CheckM2（v0.1.3）评估所有MAG的完整度和污染度。保留完整度>50%、污染度<10%的MAG用于后续分析。使用Genome Taxonomy Database Toolkit（GTDB-Tk）[30]（数据库版本R226）对优化后的MAG进行分类学注释。为减少基因组冗余并建立非冗余的代表性基因组集合用于下游分析，使用dRep（v3.4.3）对所有优化MAG进行去冗余，二次平均核苷酸同一性阈值为95%，最低完整度为50%。使用CoverM（v0.7.0）计算每个样本中去冗余MAG的基因组覆盖率。
【数据】组装工具：MEGAHIT（--min-count 2 --k-min 41 --k-max 141 --k-step 10）；分箱工具：MetaBAT2/MaxBin2/CONCOCT；MAG筛选阈值：完整度>50%、污染度<10%；去冗余阈值：ANI 95%
功能注释与防御系统鉴定
使用Prokka（v1.14.6）对MAG进行自动代谢注释，随后用DRAM（Version 1.4.6）进行精细化注释。另使用METABOLIC进行与微生物生物地球化学相关的精选功能分配。使用DefenseFinder v1.0.2鉴定MAG中的抗病毒防御系统，参数为"-dbtype gembase"，遵循MacSyFinder v1.2.0模型及相关规则。
【数据】注释工具：Prokka v1.14.6、DRAM 1.4.6、METABOLIC；防御系统鉴定：DefenseFinder v1.0.2（-dbtype gembase）
CRISPR-Cas系统间隔序列分析
使用MinCED（v0.4.2）从MAG contigs中提取CRISPR间隔序列，最少重复单元数为2。将提取的间隔序列用BlastN（e-value ≤1×10⁻⁵，word size 7）比对到IMG/VR数据库以识别潜在病毒靶标。此外，将间隔序列与本地组装的宏基因组contigs比对，以识别潜在的局部间隔序列靶标，包括病毒、质粒、前噬菌体、移动元件或宿主来源序列。BLAST命中以≥95%核苷酸同一性和≥95%查询覆盖度进行过滤。每个MAG的间隔序列计数和命中率汇总后与温度和分类学元数据合并，用于下游分析。
【数据】间隔序列提取：MinCED v0.4.2（最少2个重复单元）；BlastN阈值：e-value ≤1×10⁻⁵、word size 7；命中过滤：≥95%同一性、≥95%覆盖度
统计框架
使用Kruskal-Wallis检验和配对Wilcoxon秩和检验（Benjamini-Hochberg多重比较校正）评估温度组间MAG丰度（RPKM）和α多样性（Shannon指数，由归一化RPKM计算）的差异。效应量使用Cliff's delta及95%置信区间估计。CRISPR-Cas在不同温度区间的流行率使用Fisher精确检验（全局及适用时的配对检验）和逻辑回归（CRISPR_Cas ~ temperature）进行量化和检验。为检验分类学对防御库的影响，使用Kruskal-Wallis检验比较库大小（每个MAG的防御类别数），使用PERMANOVA（adonis2；binary Jaccard距离）检验多变量防御组成。多变量同质性检验（原文未详述具体方法）。
【数据】统计方法：Kruskal-Wallis、Wilcoxon秩和检验（BH校正）、Cliff's delta、Fisher精确检验、逻辑回归、PERMANOVA
研究结果
MAG多样性与读段招募随热沉积物下降
为研究热液影响的瓜伊马斯盆地地下宿主防御系统，本研究聚焦于Ringvent区域——该区域以浅层岩浆岩床侵入、陡峭热梯度和活跃热液循环为特征。分析了来自U1547孔B（U1547B）和U1548孔B（U1548B）的冷（13.7°C–20°C）、温（20–45°C）和热（45°C–62.4°C）沉积物中公开可用的MAGs[19]。此外，从U1547和U1548站位先前未检测的沉积物和岩石样本中生成了新的MAGs（表1）。总体上，Ringvent样本的特征是细胞数和DNA浓度随深度快速下降（表S3）。来自U1548C孔的沉积物样本——最接近Ringvent区域热液活动峰部——展现出IODP 385期间记录的最陡热梯度（图1B，表S4），并产生了足量DNA用于新宏基因组。除沉积物外，从U1547D孔海底下134.5米处采集的一个岩床样本也产生了足量DNA用于宏基因组文库构建和测序（表S1和S2）。81.8°C的原位温度是从紧邻岩床上方沉积物中的温度梯度外推得到的。
![Overview on Ringvent sampling locations and their thermal gradients. (A) Bathymetry of Ringvent, with seismic lines from site survey expeditions (RV ‘Sonne’, July 2015; RV ‘Alpha Helix’, April 2016), and drilling locations for IODP Sites U1547 and U1548 [ 17 ]. (B) Temperature gradients for Ringvent](/d/file/research/202608/art_26_1786967848_0.webp)
十七个沉积物样本和一个岩石样本（表1）通过对每个样本数据集的独立组装，产生了195个MAGs（完整度>50%，污染度<10%）（表S5）。古菌MAGs（n=59）归属于6个门：Aenigmatarchaeota（n=4）、Hadarchaeota（n=13）、Halobacteriota（n=1）、Methanobacteriota_B（n=1）、Thermoplasmatota（n=7）和Thermoproteota（n=33）。细菌MAGs（n=136）归属于19个门，主要为Acidobacteriota（n=10）、Actinomycetota（n=8）、Aerophobota（n=16）、Bipolaricaulota（n=6）、Chloroflexota（n=51）、Desulfobacterota（n=8）、Planctomycetota（n=9）和WOR-3（n=7）（表S5）。
本研究考察了MAG招募、多样性和分类学范围是否随热状态而变化，热状态定义为冷=3°C–20°C、温=20°C–45°C、热>45°C[19]。经配对Wilcoxon检验，MAG读段招募在冷、温、热温度范围间无显著变化（图2A），但热样本的MAG读段招募中位数低于冷和温样本（表S6）。基于MAG丰度图谱的α多样性在冷和温沉积物样本中显著高于热沉积物（图2B），这与细胞密度降低（表S3）和随深度分类学多样性降低（图3）一致。热样本中MAG招募中位数较冷和温样本降低（表S6），表明在高温下更大比例的宏基因组序列无法组装成MAG，指示序列碎片化程度增加。为检查MAG招募的程度，对所有18个样本的质量过滤读段进行Kraken2/Bracken分类学分析显示，数个主要门级序列组存在于读段水平群落图谱中但未恢复为MAG（图S1）。这意味着MAG招募仅为现有微生物多样性提供了部分窗口（见补充材料"Metagenomic profiling before MAG assembly"）。
![MAG relative abundance and alpha diversity across different temperature regimes (<20°C; 20°C–45°C; >45°C; [ 19 ]). (A) Violin plots of distribution and abundance of MAGs measured in reads per kilobase per million mapped reads (RPKM) and displayed on a log₁₀ scale. Each point denotes one MAG; v](/d/file/research/202608/art_26_1786967848_1.webp)
![Overview heatmap of bacterial and archaeal MAG distribution on the Ringvent sites U1547B, U1547D, U1548B, and U1548C with temperature classes (<20°C; 20°C–45°C; >45°C; [ 19 ]) and by depth. Each column shows the percentage of total pre-processed metagenomic reads (relative abundance) that mapp](/d/file/research/202608/art_26_1786967848_2.webp)
MAG序列招募的分类学热图（样本按温度升序排列，图3）显示，冷沉积物中高度多样的细菌和古菌MAG招募如何随温度和热样本选择向更窄的系统发育范围转变，直到在45°C以上的样本中仅有少数细菌（Aerophobota、Dehalococcoidia）和古菌MAGs（Bathyarchaeota、Hadarchaeota）招募到任何读段。这种分类学限制性MAG招募的趋势随着总体地下细胞数呈指数下降而增强。与表层沉积物中丰富的微生物群落（约10⁸至10⁹细胞/ml）相比，在40°C–50°C温度界面附近细胞数已下降数个数量级（表S3）。
【数据】MAG总数：195个（古菌59个/6门，细菌136个/19门）；温度范围：13.7°C–81.8°C；深度范围：2.2–134.5 mbsf；细胞数下降：从10⁸–10⁹降至10³–10⁵ cells/ml
防御系统多样性与分布
分析在195个重建MAG中的91个中鉴定出353个抗病毒基因（表S7），涵盖42个防御系统家族（表S8）。大多数防御相关基因以碎片化位座而非完整操纵子形式恢复，这与MAG数据集的碎片化特性和可变完整度一致。大多数防御系统与RM系统、Abi系统、CRISPR-Cas系统和pAgo基因相关。恢复的原核MAGs在2.2至65.8 mbsf深度范围、最高54.6°C温度下编码了这些防御系统的各种组合（图4；表S8）。RM和Abi系统在大多数细菌和古菌MAGs中编码，从浅层沉积物（~2 mbsf）到65.8 mbsf的更深层位，跨越温至热（最高54.6°C）的温度状态（图4）。特定防御系统的出现因样本而异。鉴于潜在宿主的分类学组成随深度变化，温度和宿主系统发育可能在塑造存在的防御系统方面发挥作用。值得注意的是，来自脉岩样本（134.5 mbsf；81.8°C）的MAG仅编码一种防御系统——pAgo，下文详述。
【数据】防御基因总数：353个；分布：91/195个MAGs；家族数：42个；深度范围：2.2–65.8 mbsf；最高温度：54.6°C；脉岩样本（134.5 mbsf、81.8°C）仅编码pAgo
MAG完整度与防御基因密度的相关性
MAG完整度与防御基因密度（每100个编码序列中的防御基因数）之间存在相关性（R=0.3，P<0.0037）。MAG数据点按温度着色（<20°C；20°C–45°C；>45°C），95%置信区间以阴影区域显示。
【数据】相关系数：R=0.3；P<0.0037；防御基因密度单位：每100个编码序列
防御系统随深度和温度的分布
跨瓜伊马斯盆地地下群落的防御系统发生随深度和温度的分布显示：每个面板代表一个不同的防御系统类别——RM（限制修饰）、Abi（流产感染）、CRISPR-Cas、pAgo（原核Argonaute）和其他。数据点代表含有防御基因的单个样本（n=14个样本，跨度2.2–134.5 mbsf和13.7°C–81.8°C）；x轴显示原位温度，y轴显示沉积物深度（向下增加）。气泡大小表示累积相对丰度（给定样本中编码该防御系统的所有MAGs的RPKM值之和）；气泡阴影表示每个样本中检测到的编码该防御类型的MAG数量。
【数据】含防御基因样本数：n=14；深度跨度：2.2–134.5 mbsf；温度跨度：13.7°C–81.8°C
Argonaute蛋白的系统发育分析
对Argonaute蛋白序列与最接近的GenBank匹配序列（BlastX和BlastP鉴定）及精选数据库中的序列构建最小进化系统发育树（平均距离）。古菌数据库基因以红色突出显示，细菌数据库基因以绿色显示。分类单元标签保留其GenBank条目的分类学注释。节点稳定性通过1000次完整启发式bootstrap迭代检验。（A）C端Piwi结构域（Piwi_piwi-like_ProArk结构域）的系统发育以深分支的HrAgo1基因为根——来自Asgard古菌Ca. Harpocratesius repetitus。（B）N端AlbA DNA结合结构域和N端TIR2结构域的系统发育以中点为根。
![Minimum evolution phylogeny (averaged distances) of Argonaute protein sequences and closest GenBank matches identified with BlastX and BlastP, and in curated databases [ 46 ]. Archaeal database genes are highlighted in red, bacterial database genes in green. Taxon labels retain the taxonomic annotat](/d/file/research/202608/art_26_1786967848_6.webp)
【数据】系统发育方法：最小进化（平均距离）；Bootstrap：1000次；比对工具：BlastX/BlastP
讨论与解读
防御基因：增益还是负担？
瓜伊马斯盆地地下沉积物中多样而普遍的细胞防御机制保护微生物细胞免受病毒感染——否则病毒感染将损害细胞完整性，并将宿主ATP的相当大一部分从细胞维持和生长转向病毒复制。这类防御对于生活在偶尔或经常性能量限制构成生存挑战的栖息地中的微生物可能非常重要。另一方面，深部生物圈中的慢性能量限制选择了更小、更易维持的基因组。能量受限的微生物可能偏好持久的防御策略，在基因组经济性与病毒保护的长期利益之间取得平衡。这一权衡可能有助于解释RM和Abi系统的普遍存在——它们用少量基因提供组成型保护，不需要间隔序列获取或免疫记忆，而适应性CRISPR-Cas系统则需要间隔序列获取、多样化CRISPR阵列的维持以及对不断变化的病毒种群的持续适应。
CRISPR-Cas多样性与功能
在MAGs中鉴定到的CRISPR-Cas系统及相关cas基因主要为I型和IV型亚型，已知可识别并干扰来自噬菌体或质粒的入侵DNA。III型CRISPR-Cas亚型及相关的csm和cs基因靶向RNA和DNA（原文讨论部分在此截断，后续内容原文未提供）。
编译者解读
本研究以瓜伊马斯盆地热液地下生物圈为天然实验室，系统描绘了极端环境中原核防御系统的分布图景。方法上采用样本特异性分箱策略而非多样本共分箱，虽保守但保障了温度梯度解析的准确性。核心发现——高温深部仅存pAgo单一防御系统——提示pAgo可能在能量极度受限条件下作为"最小防御模块"发挥作用，这对理解深部生物圈微生物的生存策略具有启示意义。局限在于MAG碎片化导致多数防御基因位座不完整，且脉岩样本仅一个成功测序，统计效力有限。未来若能结合长读长测序与培养验证，将更精确地解析极端环境防御系统的功能机制。
PMID: 42604377