来源：Systematic enzyme and cofactor engineering for efficient ursolic acid biosynthesis in Yarrowia lipolytica.（Synth Syst Biotechnol）| 编译：DNA Lab Space
导读
熊果酸是一种具有广泛药理活性的五环三萜类化合物，其微生物合成长期受制于细胞色素P450酶催化效率低下及辅因子供应不足。本研究以高产α-香树脂醇的解脂耶氏酵母为底盘，通过P450酶筛选、氧化还原伴侣融合、结构引导的酶工程改造以及FAD/血红素/铁离子等多层次辅因子系统强化，最终在5L发酵罐中实现813 mg/L熊果酸产量，为三萜类化合物的酵母异源合成提供了可推广的工程策略。
研究背景
熊果酸广泛分布于药用植物中，具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗癌、抗糖尿病及保肝等多种药理活性，被视为具有重要医药和营养价值的高值化合物。此外，熊果酸还可作为其他高价值三萜类化合物的生物合成前体。目前熊果酸主要依赖植物提取，但该方法存在产量低、能耗高、受季节影响大且难以规模化等问题，无法满足日益增长的工业需求。代谢工程与合成生物学的发展使微生物细胞工厂成为三萜类化合物生物合成的有前景平台。熊果酸的生物合成途径始于角鲨烯经角鲨烯环氧化酶转化为2,3-氧化角鲨烯，再由氧化角鲨烯环化酶环化生成α-香树脂醇，最终由植物来源的CYP716家族细胞色素P450单加氧酶催化C-28位氧化生成熊果酸。
研究方法
2.1 菌株与培养基
本研究以高产α-香树脂醇的解脂耶氏酵母PO1f菌株作为主要宿主。质粒构建与扩增在大肠杆菌JM109中进行，该菌株在含有10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl和100 μg/mL氨苄青霉素的Luria–Bertani (LB)培养基中、37°C条件下培养16小时。感受态大肠杆菌细胞使用商业试剂盒（TaKaRa Bio Inc., Osaka, Japan）制备。解脂耶氏酵母在酵母蛋白胨葡萄糖（YPD）培养基中培养，该培养基含10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨和20 g/L葡萄糖，培养条件为30°C、220 rpm振荡。对于酵母转化，工程细胞涂布于酵母氮碱（YNB）培养基上，该培养基含6.74 g/L YNB、20 g/L葡萄糖和5 g/L亮氨酸，用于筛选转化子。
【数据】培养基：LB（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl、100 μg/mL氨苄青霉素）；大肠杆菌培养温度：37°C；时间：16h；YPD培养基：10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖；酵母培养温度：30°C；转速：220 rpm；YNB筛选培养基：6.74 g/L YNB、20 g/L葡萄糖、5 g/L亮氨酸
2.2 质粒构建与酵母转化
菌株和引物的详细信息列于表S3、S4、S5。来自长春花的α-香树脂醇合酶（CrMAS）（GenBank: JN991165）、蒺藜苜蓿的MtCYP716A12（GenBank: FN995112）、积雪草的CaCYP716A83（GenBank: KU878849）、长春花的CrCYP716AL1（GenBank: JN565975）、油橄榄的OeCYP716A48（GenBank: AB706294.1）以及拟南芥的AtCPR1（GenBank: BT008426.1）经密码子优化后由GENEWIZ Biotech Co., Ltd.（中国苏州）合成。合成基因的DNA序列列于表S7。天然基因使用表S2中列出的解脂耶氏酵母基因组构建。所有质粒构建使用Gibson组装试剂盒（Sangon Biotech Co., Ltd., 中国上海）[26]，以pYLXP'1质粒为模板。所有组装完成的质粒通过Sanger测序确认，所用引物由Sangon Biotech Co., Ltd.（中国上海）合成。酵母转化使用Frozen-EZ Yeast Transformation II试剂盒（Zymo Research, CA, USA）进行，细胞涂布于YNB琼脂平板，30°C培养2–4天。转化子通过基因组DNA PCR确认，随后进行测序。对于26S核糖体DNA（rDNA）位点的多拷贝整合，阳性转化子在尿嘧啶缺陷型YNB平板上培养，随后按先前描述的方法去除URA3筛选标记[27]。引导RNA使用CHOPCHOP网站设计。所用整合位点在解脂耶氏酵母中为非必需位点[28]。α-香树脂醇和熊果酸标准品购自Macklin（中国上海）。
【数据】基因来源：CrMAS（长春花，JN991165）、MtCYP716A12（蒺藜苜蓿，FN995112）、CaCYP716A83（积雪草，KU878849）、CrCYP716AL1（长春花，JN565975）、OeCYP716A48（油橄榄，AB706294.1）、AtCPR1（拟南芥，BT008426.1）；组装方法：Gibson组装；转化试剂盒：Frozen-EZ Yeast Transformation II；培养温度：30°C；培养时间：2–4天
2.3 工程酵母的摇瓶与生物反应器发酵
将工程解脂耶氏酵母菌株的单菌落接种于YPD培养基中，30°C、250 rpm振荡培养24小时。随后，将1 mL培养物转移至含24 mL新鲜YPD的250 mL摇瓶中，在相同条件下培养。培养物于五天后收获。
为增强香树脂醇产量，工程菌株在5L生物反应器中采用补料分批发酵方式培养。种子培养通过将单菌落接种于10 mL YPD中，30°C、220 rpm培养24小时，随后转移至200 mL YPD中再培养24小时。所得培养物用于接种生物反应器中的2.2 L YPD。发酵在28°C下进行，pH通过氨水溶液维持在5.5，溶解氧通过搅拌级联（300–900 rpm）和3.0 vvm通气速率控制在25%。初始葡萄糖浓度为40 g/L，浓缩葡萄糖溶液（500 g/L）间歇补加以维持残糖水平低于1 g/L。初始葡萄糖耗尽后，以5–15 mL h⁻¹的速率开始补加营养液（100 g/L (NH₄)₂SO₄、35 g/L KH₂PO₄、5 g/L MgSO₄·7H₂O）进行补料分批培养。
【数据】摇瓶培养：30°C、250 rpm、24h种子培养、5天发酵；5L发酵罐：28°C、pH 5.5（氨水调节）、溶解氧25%（300–900 rpm搅拌级联、3.0 vvm通气）、初始葡萄糖40 g/L、补糖浓度500 g/L、残糖<1 g/L、营养液流速5–15 mL h⁻¹、营养液组成：100 g/L (NH₄)₂SO₄、35 g/L KH₂PO₄、5 g/L MgSO₄·7H₂O
2.4 分析方法
对于α-香树脂醇分析，将1 mL解脂耶氏酵母培养液转移至2 mL研磨管（MP）中，12,000 rpm离心10分钟。弃去上清液，将细胞沉淀与等体积的0.5 mm玻璃珠混合，并重悬于1 mL甲醇中。使用FastPrep仪器进行细胞破碎，共四个循环（6.0 m/s，每循环40秒）。裂解后，样品再次以12,000 rpm离心10分钟，上清液经0.22 μm滤膜过滤后进行气相色谱–质谱联用（GC–MS）分析。
对于熊果酸提取，除使用乙醇替代甲醇外，其余步骤相同。所得提取液经0.22 μm滤膜过滤后采用高效液相色谱（HPLC）分析。
α-香树脂醇使用配备RTX-5毛细管柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）的Shimadzu QP2010 GC-MS（Kyoto, Japan）分析。柱温以20°C/min程序升温至280°C，再以40°C/min升温至300°C并保持10分钟。氦气（1.0 mL/min）作为载气，进样1 μL。质谱扫描范围为35–500 m/z [29]。
熊果酸使用C18色谱柱（4.6 × 150 mm, 5 μm; Thermo Fisher, 中国上海）进行HPLC检测，UV检测波长为210 nm，柱温40°C。流动相为超纯水、乙腈和甲醇，比例为21:67:12（v/v/v）[29]。
【数据】α-香树脂醇提取：甲醇、玻璃珠（0.5 mm）、FastPrep破碎（6.0 m/s × 4循环 × 40 s）、12,000 rpm离心10 min、0.22 μm滤膜过滤；熊果酸提取：乙醇替代甲醇；GC-MS条件：RTX-5柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）、程序升温20°C/min至280°C→40°C/min至300°C保持10 min、氦气1.0 mL/min、进样1 μL、扫描35–500 m/z；HPLC条件：C18柱（4.6 × 150 mm, 5 μm）、UV 210 nm、柱温40°C、流动相水:乙腈:甲醇=21:67:12（v/v/v）
2.5 序列检索与多序列比对
从GenBank数据库检索代表性植物物种的CYP716A细胞色素P450氨基酸序列（表S1）。使用CLUSTAL Omega以默认参数进行多序列比对。使用Jalview分析序列保守性和比对可视化，保守性得分基于比对序列中的氨基酸同一性和理化相似性计算（图S9和S10）。
【数据】比对工具：CLUSTAL Omega（默认参数）；可视化：Jalview；保守性评分依据：氨基酸同一性和理化相似性
2.6 分子对接
CYP716A48的三维结构从AlphaFold蛋白质结构数据库（UniProt ID: A0A090AQE0）获取，平均pLDDT得分>90.19。pLDDT（预测局部距离差异检验）得分提供每个残基的置信度估计，范围从0到100，数值越高表示预测原子位置的可靠性越高。使用MolProbity服务器（http://molprobity.biochem.duke.edu）验证所获查询蛋白模型结构的立体化学质量。α-香树脂醇（CID:73170）的三维结构以sdf格式从PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）下载。使用AutoDock Vina 1.2.0 [30]按照标准对接方案进行配体-蛋白质分子对接。所得蛋白质-配体复合物根据计算的结合能进行评估，使用PyMOL 3.1分子图形系统进行可视化和分析，配体5 Å范围内的残基纳入相互作用分析。
【数据】结构来源：AlphaFold（UniProt ID: A0A090AQE0，pLDDT>90.19）；对接软件：AutoDock Vina 1.2.0；分析软件：PyMOL 3.1；相互作用残基范围：配体5 Å内
2.7 计算隧道工程分析
血红素辅因子是CYP716A48作为细胞色素P450单加氧酶催化活性所必需的，使用AlphaFill将其引入，该方法通过局部结构比对将同源晶体结构中实验解析的配体转移到预测蛋白质模型中。使用同源细胞色素P450晶体结构（PDB ID: 2VE3）作为结构模板，与CYP716A48的序列相似性为46.15%，移植的血红素基团实现了3.08 Å的局部RMSD，表明空间定位可靠。使用PyMOL进行目视检查，确认卟啉环在保守的P450血红素结合口袋中的方向正确，并保留了典型的P450基序，包括特征性的Cys配体结合区域。
使用CAVER 3.0（PyMOL插件）在野生型和工程化CYP716A48变体的恒定参数下进行隧道分析：最小探针半径0.9 Å，壳层深度4 Å，壳层半径3 Å，聚类阈值3.5 Å，最大距离3 Å，期望半径5 Å。从每个变体的主导隧道簇中，CAVER计算了隧道几何参数。
【数据】模板结构：PDB ID: 2VE3（序列相似性46.15%）；血红素移植RMSD：3.08 Å；CAVER参数：最小探针半径0.9 Å、壳层深度4 Å、壳层半径3 Å、聚类阈值3.5 Å、最大距离3 Å、期望半径5 Å
研究结果
3.1 异源P450候选酶的筛选
为在解脂耶氏酵母中建立熊果酸生物合成途径，本研究使用实验室保藏菌株YU-0作为出发菌株，该菌株在摇瓶条件下产生197 ± 6 mg/L的α-香树脂醇（图S1，表S5）。将四种植物细胞色素P450单加氧酶MtCYP716A12、CrCYP716AL1、CaCYP716A83和OeCYP716A48分别整合到工程化亲本菌株YU-0中，并与AtCPR1共表达，产生四个重组菌株，分别命名为YU-1至YU-4。HPLC–UV和LC–Q-TOF/MS分析确认所有工程菌株均成功合成熊果酸（图S2、S3、S4、S6）。其中，菌株YU-4表现最佳，产生13 ± 1 mg/L熊果酸，而α-香树脂醇滴度降至175 ± 7 mg/L（图2B，S8）。OeCYP716A48在所评估的P450变体中表现出优异的催化效率并产生最高的熊果酸滴度，因此被选用于后续优化研究。
为增强OeCYP716A48在解脂耶氏酵母中的催化效率，本研究通过使用不同长度和柔性的肽接头将OeCYP716A48与其氧化还原伴侣AtCPR1连接，构建了一系列融合酶（图2A）。所得变体在菌株YU-0中表达并评估熊果酸产量。不同融合构建体之间的熊果酸产量差异显著（图2C–S8）。在所测试的接头中，柔性(GGGGS)₂接头表现最佳，在YU-6菌株中产生最高熊果酸滴度25 ± 2 mg/L，而α-香树脂醇滴度降至147 ± 4 mg/L，相对于YU-4菌株增加了约92%。尽管如此，熊果酸滴度仍然相对较低，表明需要额外的代谢和蛋白质工程策略来进一步提高酶性能。
【数据】出发菌株YU-0：α-香树脂醇197 ± 6 mg/L；YU-4菌株：熊果酸13 ± 1 mg/L、α-香树脂醇175 ± 7 mg/L；YU-6菌株（(GGGGS)₂接头）：熊果酸25 ± 2 mg/L、α-香树脂醇147 ± 4 mg/L、相对YU-4提高约92%
3.2 OeCYP716A48工程改造增强熊果酸生物合成
对来自不同植物物种的CYP716A同源物进行多序列比对，以识别具有潜在功能相关性的残基（表S1）。分析揭示了核心催化区域（如血红素结合半胱氨酸环）内的强保守性，而底物识别位点（SRSs）和表面暴露区域表现出更高的变异性（图S10–S11）。这些可变位置被视为蛋白质工程的潜在靶点。在所分析的同源物中，OeCYP716A48与CrCYP716AL1的序列相似性最高（83.92%），表明两者进化关系密切（图S9）。
为确定底物相互作用，将α-香树脂醇对接至OeCYP716A48活性位点。底物占据一个主要为疏水性的口袋，残基A107、W108、W109、V113、D114、F117、S120、T123、S124、S125、E128、L211、D281、K282、G285、L286、V288、G289和R424位于5 Å范围内（图3A）。将对接结果与保守性分析整合后发现，W108、W109、F117、E128、G285、G289和R424等残基完全保守，表明它们在催化或结构完整性中发挥重要作用，突变可能破坏酶功能。高度保守的残基A107、D281、K282、L286、V288、S124和S125有助于底物识别和结构稳定性，可能耐受细微修饰。相比之下，中度保守的残基（包括D114、S120、T123和L211）表现出部分可变性，提示它们参与底物结合，同时保持足够的功能测试灵活性。
为评估所选残基的功能作用，进行了丙氨酸扫描诱变，所得变体在YU-0菌株中与AtCPR1共表达。在所测试的突变体中，D114A和L211A对熊果酸产量的影响最为显著（图4A和B）。D114A变体产生27 ± 2 mg/L熊果酸，较野生型提高2倍，α-香树脂醇降至148 ± 4 mg/L。类似地，L211A产生28 ± 2 mg/L熊果酸（提高2.2倍），α-香树脂醇降至145 ± 5 mg/L。基于这些结果，对残基D114和L211进行饱和诱变。在所得变体中（图4E、F、S7），D114Q表现出最大改善，产生45 ± 3 mg/L熊果酸（提高3.5倍），α-香树脂醇降至130 ± 3 mg/L。L211F变体产生37 ± 2 mg/L熊果酸（提高2.8倍），α-香树脂醇为139 ± 5 mg/L。为进一步提高催化性能，将有益突变进行组合（图4C和D）。双突变体D114Q/L211F产生66 ± 3 mg/L熊果酸，较野生型提高5倍，α-香树脂醇降至109 ± 3 mg/L。
使用Caver分析OeCYP716A48的底物进入隧道，以评估D114Q/L211F双突变对底物可及性的影响。与野生型酶相比，D114Q/L211F变体的隧道通量从0.71增加到0.76，表明底物通过能力增强。同时，隧道成本从0.33降至0.27，表明底物扩散的能垒更低。瓶颈半径从1.12 Å扩展至1.52 Å，反映出更宽的收缩口，可能更好地容纳大体积底物。此外，隧道长度从18.37 Å缩短至16.87 Å，曲率参数也相应改善。
【数据】序列相似性：OeCYP716A48与CrCYP716AL1为83.92%；D114A：熊果酸27 ± 2 mg/L（2倍提高）、α-香树脂醇148 ± 4 mg/L；L211A：熊果酸28 ± 2 mg/L（2.2倍提高）、α-香树脂醇145 ± 5 mg/L；D114Q：熊果酸45 ± 3 mg/L（3.5倍提高）、α-香树脂醇130 ± 3 mg/L；L211F：熊果酸37 ± 2 mg/L（2.8倍提高）、α-香树脂醇139 ± 5 mg/L；D114Q/L211F：熊果酸66 ± 3 mg/L（5倍提高）、α-香树脂醇109 ± 3 mg/L；隧道参数：通量0.71→0.76、成本0.33→0.27、瓶颈半径1.12 Å→1.52 Å、长度18.37 Å→16.87 Å
3.3 核黄素与血红素生物合成的系统强化
为支持高OeCYP716A48活性，对细胞内FAD、血红素和铁的可获得性进行了系统强化。通过逐步过表达核黄素生物合成基因（RIB1、RIB2、RIB3、FMN1和FAD1），熊果酸产量逐步提高。同时，通过过表达HEM2、HEM3、HEM12并删除HMX1强化血红素生物合成途径，进一步提升了熊果酸产量。具体数据原文未详述。
【数据】核黄素途径基因：RIB1、RIB2、RIB3、FMN1、FAD1；血红素途径基因：HEM2、HEM3、HEM12；基因删除：HMX1
3.4 高亲和力铁摄取系统强化与5L发酵
通过逐步过表达铁摄取基因（FTR1、FET3和FRE1），熊果酸产量进一步提高。最佳菌株YU-25在5L补料分批发酵中，熊果酸产量达到813 ± 24 mg/L，为目前解脂耶氏酵母中报道的最高产量。发酵过程中监测了熊果酸产量、葡萄糖消耗和细胞生长（OD₆₀₀）的时间曲线。
【数据】5L发酵：熊果酸813 ± 24 mg/L；监测指标：熊果酸产量、葡萄糖消耗、OD₆₀₀
讨论与解读
本研究以高产α-香树脂醇的解脂耶氏酵母底盘为起点，系统解析了熊果酸生物合成的下游限制因素。亲本菌株已积累大量α-香树脂醇，因此末端细胞色素P450依赖的氧化步骤成为限制熊果酸合成的关键瓶颈。四种CYP716A单加氧酶中OeCYP716A48效率最高，但熊果酸产量仍低而α-香树脂醇持续积累，表明催化转化效率不足。将OeCYP716A48与AtCPR1融合后，柔性(GGGGS)₂接头显著提高了熊果酸产量，证实了P450与还原酶之间的空间组织对催化性能的重要影响。结构引导的诱变进一步证明，活性位点架构和底物进入通道几何形状是限制底物转化的内在结构约束。D114Q/L211F双突变通过扩大底物进入隧道、降低扩散能垒，使熊果酸产量提高5倍。辅因子工程（FAD、血红素、铁）的系统强化使产量进一步提升14.4倍。最终，多拷贝整合与5L补料分批发酵相结合，实现了813 ± 24 mg/L的熊果酸产量。
编译者解读：该研究展示了典型的"酶工程+辅因子工程"双轮驱动策略在酵母三萜合成中的应用价值。值得关注的是，作者将蛋白质结构计算（AlphaFold预测、分子对接、隧道分析）与实验验证紧密结合，精准识别了限制P450催化的结构位点，避免了盲目的随机突变。辅因子工程的系统化思路——从FAD到血红素再到铁离子摄取——体现了对P450催化机制的深刻理解。不过，813 mg/L的产量虽创下解脂耶氏酵母中的纪录，距离工业化仍有差距；且P450融合表达和辅因子过表达带来的代谢负担未充分讨论。未来若能与动态调控策略结合，有望进一步释放该平台的潜力。
参考来源
Elsharawy H, He Q, Zeng W, Zhou J. Systematic enzyme and cofactor engineering for efficient ursolic acid biosynthesis in Yarrowia lipolytica. Synth Syst Biotechnol. PMID: 42502842.
PMID: 42502842