来源：Semantic Scholar | 编译：DNA Lab Space
导语
漆酶作为一种多铜氧化酶，在工业废水处理、生物漂白和生物传感器等领域展现出巨大潜力，但其对非底物固体材料的结合能力较弱，限制了催化效率。近期，印尼艾尔朗加大学等机构的研究人员在*Biocatalysis and Agricultural Biotechnology*期刊上发表了一项合成生物学研究成果，成功将一种全新的碳水化合物结合模块Cbm36融合至漆酶Lcc2的N端，并在异源宿主中实现功能性表达。融合酶不仅保留了漆酶活性，还显著增强了对纤维素和木质纤维素基质的结合能力，为构建高效固定化生物催化剂提供了新策略。
研究背景
漆酶（laccase, EC 1.10.3.2）属于蓝色多铜氧化酶家族，能够催化多种酚类和非酚类化合物的氧化，同时将分子氧还原为水，反应条件温和、环保性突出。然而，游离漆酶在实际应用中面临稳定性差、重复使用困难，尤其是与固体底物接触不充分等瓶颈。将酶固定化于载体可以部分缓解上述问题，但传统物理吸附或共价偶联往往导致酶活性损失且传质受限。
自然界中，许多纤维素降解酶通过非催化性的碳水化合物结合模块（carbohydrate binding module, CBM）高效锚定于不溶性多糖表面，倍增局部催化浓度。CBM广泛存在于糖苷水解酶中，根据序列和结构特征分为多个家族，其中第36家族（CBM36）对木聚糖、纤维素等表现出特异性亲和力。近年来的合成生物学进展使得将异源CBM与目标氧化还原酶融合成为可能，但将CBM36与漆酶结合的研究尚属空白。
本研究聚焦于来源于*Trametes*属的漆酶Lcc2，该酶在木质素降解和染料脱色中表现优异。为赋予该酶自主结合纤维素的能力，团队设计并构建了N端融合CBM36的重组漆酶，利用异源表达系统实现可溶性表达，系统表征了融合酶的生化性质与底物结合特性。该研究有望为漆酶的绿色固定化和原位催化提供全新分子工具。
研究方法
研究团队采用结构导向的融合蛋白设计策略，通过柔性连接肽（GGGGS）将来自*Paenibacillus* sp.的CBM36模块融合至Lcc2成熟肽N端，并在编码序列5’端引入His标签便于纯化。构建的融合基因经密码子优化后，分别克隆至大肠杆菌（*E. coli* BL21(DE3)）和毕赤酵母（*Pichia pastoris* GS115）表达载体，以实现异源表达的比较筛选。
在大肠杆菌系统中，使用pET-22b(+)载体，在IPTG诱导下于20℃低温培养以促进可溶性表达，同时考察不同诱导剂浓度和诱导时间的影响。在毕赤酵母系统中，利用pPICZα A分泌型载体，通过电转化将线性化重组质粒整合至基因组，筛选高拷贝转化子。表达条件为30℃、甲醇诱导120小时，每24小时补加甲醇。
目标蛋白通过镍离子亲和层析纯化，SDS-PAGE和Western blot进行验证。漆酶活性测定以2,2’-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）为底物，在420 nm连续监测吸光度变化。融合蛋白与纤维素的结合能力通过纤维素结合试验评价：将等量酶与微晶纤维素（Avicel）在pH 5.0缓冲液中孵育1小时，离心后测定上清液残余酶活及蛋白浓度，计算结合比例。木质素吸附实验使用有机溶剂木质素作为固相基质。
为进一步解析融合对酶学性质的影响，测定了自由酶与融合酶的最适pH、最适温度、热稳定性及动力学参数（*k*cat、*K*m、*k*cat/*K*m）。利用圆二色光谱分析二级结构变化，内源荧光光谱监测构象微环境。最终，以靛蓝胭脂红和活性黑5等合成染料为目标底物，评估融合酶的脱色能力，并与游离酶进行对比。
研究结果
在大肠杆菌表达系统中，融合蛋白主要以包涵体形式存在，低温诱导仅部分改善可溶性，仍难获得足量活性蛋白。相比之下，毕赤酵母分泌表达系统成功实现了CBM36-Lcc2的高效可溶性分泌表达，SDS-PAGE显示分子量约68 kDa的单一主带，与理论值相符，经Western blot确认。摇瓶水平的漆酶产量达到约120 mg/L培养液上清。
酶活性测定显示，融合蛋白的ABTS氧化比活性为58.3 U/mg，较不含CBM36的重组Lcc2（61.7 U/mg）略有下降，但无统计学显著差异（p>0.05），表明CBM36的融合并未对漆酶催化中心造成重大干扰。最适pH和温度分别为pH 3.0和50℃，与母本酶一致；然而在极端pH（pH 7.0）和较高温度（60℃）下，融合酶表现出更好的稳定性：处理30分钟后残余活性较自由酶提高约15%，提示融合可能对整体构象具有一定稳定化效应。
纤维素结合试验是核心发现。母本Lcc2对微晶纤维素的非特异性吸附仅约8%，而CBM36-Lcc2的结合率达到72%，显著增强（p<0.001）。用1%纤维素酶处理纤维素后，结合率大幅下降，验证了CBM模块与纤维素氢键网络的识别特异性。此外，融合酶对木质素的吸附同样呈上升趋势，表明CBM36的芳香族氨基酸残基可能同时介导与木质素疏水表面的相互作用。
动力学参数测定显示，融合酶对ABTS的Km值为32.4 µM，与自由酶（30.1 µM）相近，催化效率（*k*cat/*K*m）维持在1.2×10⁶ M⁻¹s⁻¹水平。然而，当以大分子木质素磺酸盐为底物时，融合酶的表观*K*m降低了近40%，表明物理靠近效应显著提升了酶对不溶性大分子底物的表观亲和力。
染料脱色实验进一步展示了融合蛋白的应用优势。在无外加介体的体系中，CBM36-Lcc2对活性黑5的脱色率在60分钟内达到85%，而相同剂量的自由Lcc2仅为61%。值得关注的是，将融合酶预先与纤维素珠结合后再用于批次脱色，酶可重复使用5个循环而脱色率保持70%以上，显示了融合酶在纤维素基质上的自发固定化潜力。
结构表征方面，远紫外圆二色谱显示融合蛋白的二级结构组分（α-螺旋、β-折叠比例）与自由酶高度相似，表明融合未引起整体折叠的异常改变。内源荧光谱图在融合前后最大发射波长未明显位移，证明色氨酸微环境未受扰动。这些结果共同保证了融合策略的分子安全性。
讨论与展望
本研究首次将CBM36模块成功融合至漆酶Lcc2的N端，并在毕赤酵母表达系统中获得高活性分泌蛋白，为多糖结合型氧化还原酶的制备提供了可行路径。CBM36的引入有效克服了漆酶对固体纤维素基质结合力弱的固有缺陷，在保持催化活性的同时，实现了“一步固定化”——仅需将融合酶与纤维素载体简单孵育即可形成稳固的生物催化界面。这种自发结合模式避免了化学交联导致的活性损失，且纤维素载体廉价、可再生，显著提升了工艺的绿色性和经济性。
CBM36与纤维素的高亲和性也为木质纤维素精炼厂的多酶协同催化带来了想象空间。融合酶可与纤维素酶、半纤维素酶在同一反应器中协同作用，实现木质素降解与多糖水解的空间偶联，降低传质限制。染料脱色实验证实，融合酶经简单回收即可多次使用，为连续流废水处理装置的开发奠定了基础。
然而，某些挑战仍需关注。CBM家族与底物结合的pH依赖性和离子强度敏感性可能在复杂工业料液中削弱结合力。本研究虽已确认CBM36与漆酶的融合未显著影响酶活性，但连接肽长度及模块空间取向仍可进一步优化，以平衡结合与催化。未来研究可通过分子动力学模拟引导连接肽设计，或尝试将CBM36融合至Lcc2的C端，甚至构建双模块融合体，探索协同结合效应。此外，将融合策略拓展至其他漆酶同工酶和氧化还原酶（如过氧化物酶）亦值得尝试。
综上所述，该研究开辟了漆酶理性功能化的新方向，凸显了合成生物学在工业酶定制中的巨大价值。随着更多模块库的建立和筛选技术的发展，按需组装的多模态生物催化剂将逐步走出实验室，助力环境治理与生物制造产业。
参考来源
Kurniati A, Puspaningsih N, Putri K D A, et al. Heterologous fusion gene expression and characterization of a novel carbohydrate binding module (Cbm36) to laccase (Lcc2)[J]. *Biocatalysis and Agricultural Biotechnology*, 2022. DOI: 10.1016/j.bcab.2022.102377.
DOI: 10.1016/j.bcab.2022.102377