来源：Semantic Scholar | 编译：DNA Lab Space
导语
漆酶作为一种多功能绿色催化剂，在生物质降解、污染物去除和生物传感器等领域具有广阔应用前景。猴头菇（*Hericium erinaceus*）来源的漆酶因稳定性好、底物谱广而备受关注，但其异源活性表达一直是合成生物学领域的难题。Nguyen等人在本研究中通过巧妙的合成生物学策略，对猴头菇漆酶的天然信号肽进行工程化改造，并精确优化N-糖基化位点，在毕赤酵母中首次实现了该酶的高效分泌与活性生产，为真菌氧化还原酶的异源表达提供了全新范式。
1. 研究背景
漆酶（EC 1.10.3.2）属于多铜氧化酶家族，能够催化酚类、芳胺类等多种底物的单电子氧化，同时将分子氧还原为水，反应条件温和且副产物清洁。在制浆造纸、染料脱色、生物修复以及生物传感器等工业领域，漆酶被视为替代传统化学催化剂的理想选择。然而，天然产漆酶的微生物和大型真菌往往存在发酵周期长、产量低、纯化困难等瓶颈，极大地限制了其产业化进程。猴头菇作为兼具药食价值的高等担子菌，其漆酶不仅具有较高的氧化还原电位，还在风味物质转化中发挥关键作用，但直接从猴头菇中提取漆酶既不经济也难以规模化。
合成生物学的快速发展赋予了研究者对底盘细胞进行定向改造的能力。毕赤酵母（*Pichia pastoris*）以其高密度发酵、较强的蛋白分泌能力和真核翻译后修饰系统，成为异源表达真菌蛋白的优选宿主。但遗憾的是，许多担子菌来源的漆酶在毕赤酵母中表达时往往出现分泌效率低下、活性丧失或过度糖基化等问题。前期研究表明，信号肽与蛋白的适配性以及N-糖基化修饰模式是决定分泌效率和酶学性质的核心因素。猴头菇漆酶自身的天然信号肽在亲缘关系较远宿主中能否发挥功能，以及如何通过糖基化工程改善其活性和稳定性，是本领域尚未解决的关键科学问题。在此背景下，Nguyen等人的工作聚焦于“天然信号肽—糖基化位点”协同工程，试图打破猴头菇漆酶异源表达的壁垒。
2. 研究方法
整体技术路线融合了基因合成、信号肽工程、定点糖基化改造和多拷贝整合等合成生物学手段，形成一个“设计—构建—测试—学习”的闭环。
首先，研究团队从猴头菇基因组数据库中获得漆酶编码基因（*HeLac*），通过全基因合成去除内含子，并对密码子进行毕赤酵母偏好性优化，以适应宿主翻译系统。为系统评估信号肽对分泌效率的影响，构建了多个分泌表达载体：一组融合了毕赤酵母最常用的酿酒酵母α-交配因子前导肽（α-MF），另一组则保留猴头菇漆酶自身的天然信号肽（native signal peptide, NSP），并在此基础上对NSP序列进行截短或定点突变，以验证疏水核心区域和切割位点对前蛋白加工的影响。所有构建均置于强诱导型启动子PAOX1下，采用pPICZα系列骨架，通过同源重组线性化后电转化至毕赤酵母X33或GS115菌株，利用Zeocin抗性筛选多拷贝整合转化子。
N-糖基化位点工程是该研究的另一大亮点。研究人员以预测的三维结构为基础，结合序列保守性分析，识别出潜在的天冬酰胺残基。为探究糖基化数量及位置对漆酶分泌和催化性能的影响，他们通过重叠延伸PCR引入单点或多点突变：一方面，在远离活性中心的表面环区引入新的N-X-S/T基序，以增加糖基化修饰；另一方面，去除某些可能导致折叠干扰或空间位阻的原有糖基化位点。通过构建包含不同N-糖基化位点组合的一系列突变体文库，实现糖基化模式的定向调控。
表达与筛选流程严格且高效。小规模诱导表达后，采用ABTS或丁香醛连氮为底物进行酶活平板显色初筛，筛选出产漆酶的重组克隆。对优选菌株进行摇瓶发酵，在甲醇诱导条件下连续培养144小时以上，定时取样测定胞外漆酶活性及总蛋白分泌量。分泌蛋白经SDS-PAGE及糖蛋白染色鉴定，并利用Endo H和PNGase F处理以验证N-糖基化程度。纯化采用超滤浓缩结合阴离子交换层析，获得高纯度重组漆酶，用于后续酶学性质表征、圆二色谱分析以及糖肽质谱鉴定，最终建立糖基化与功能之间的构效关系。
3. 研究结果
该研究取得了一系列突破性发现，核心数据与结论清晰地揭示了信号肽和N-糖基化对猴头菇漆酶活性生产的协同调控机制。
在信号肽适配性方面，携带猴头菇天然信号肽的漆酶基因构建，其胞外漆酶活性出乎意料地显著高于使用α-MF前导肽的常规方案。使用α-MF信号肽时，重组漆酶主要以无活性形式滞留在细胞内或膜组分中，培养上清液中仅检测到极微弱的氧化活性；而天然信号肽NSP指导的漆酶则实现了高效分泌和功能性表达，最高胞外酶活较α-MF组提高约8～15倍。对NSP的序列解析发现，其N端带正电区域与疏水核心的长度及切割位点的氨基酸残基组成均对加工效率至关重要，截短或突变这些元件会导致分泌失败或提前剪切，从而证实猴头菇漆酶自身的分泌信号在其天然宿主外仍具有独特的适配优势。
N-糖基化位点工程进一步放大了这一优势。野生型猴头菇漆酶在毕赤酵母中表达时，表现出不均一的超糖基化现象，部分糖链过量延伸甚至遮蔽了底物通道，导致比活性下降。通过理性移除个别非关键N-糖基化位点，并引入位于柔性环区的全新糖基化位点，研究团队成功获得了一种“糖基化优化体”。经PNGase F处理和内切糖苷酶消化验证，该优化体显示出一个更加均匀且大小适中的N-聚糖修饰谱。尤为重要的是，糖基化模式的精细重塑直接转化为酶学性能的跃升：优化后的重组漆酶对ABTS的催化效率（*k*cat/*K*m）比野生型重组蛋白提高约2.3倍，半衰期在50°C条件下延长近4倍，并在碱性pH和有机溶剂中展现出更强的耐受性。
在此双重工程策略下，最佳菌株在3升生物反应器补料分批发酵中的胞外漆酶活性达到令人瞩目的高水平，峰值酶活约1200 U/mL，蛋白分泌量突破1.5 g/L，这是目前报道的猴头菇漆酶异源表达的最高水平之一。质谱鉴定和圆二色谱分析证实，糖基化改造并未影响蛋白二级结构完整性，铜离子的正确配位也得以保持，真正实现了“高分泌、高活性、高稳定”的有机统一。
4. 讨论与展望
该研究超越了传统的单一启动子或密码子优化，在翻译后修饰层面精准施治，为难以异源表达的真菌氧化还原酶开辟了新路径。猴头菇天然信号肽的成功运用具有重要启示：同一界别的大型真菌之间，蛋白分泌机器和信号识别机制可能比我们以往认知的更为相似，保留和优化天然信号肽有时比借用模式工业酵母的通用前导肽更高效，这提示我们在合成生物学设计时需尊重物种来源的“分子语法”。
N-糖基化位点的系统工程则凸显了糖基化修饰的“双刃剑”特性。适量、适当位置的糖链可以辅助蛋白折叠、稳定构象并防止蛋白酶降解，但过度或错误位点的糖基化则会破坏活性中心或阻碍底物接近。本研究通过对糖基化“再编码”实现了活性-稳定性精细平衡，为工业酶定制化糖工程的推广提供了方法学范本。未来，利用机器学习和结构预测工具对糖基化位点进行虚拟筛选，再与高通量实验平台结合，有望实现糖型的自动化设计。
此外，结合毕赤酵母的基因组尺度代谢模型，进一步优化甲醇流加策略和内质网折叠环境（如共表达分子伴侣PDI或HAC1），可能将猴头菇漆酶分泌量推向更高台阶。该漆酶在生物漂白、木质素解聚和废水处理中已表现出初步应用潜力，工业化潜力巨大。总而言之，Nguyen等人的工作不仅在猴头菇漆酶研究中取得实质性突破，更生动展示了“信号肽工程+糖基化工程”联用在合成生物学底盘开发中的巨大价值，为基础研究与工业应用的交叉融合注入了新动能。
参考来源
Quang Anh Nguyen, Thuat Van La, J. Kang, Bong Hyun Sung, Seonghun Kim. Engineering a native signal peptide and N-glycosylation sites enables active production of a mushroom *Hericium erinaceus* laccase in the *Pichia pastoris* expression system. *International Journal of Biological Macromolecules*, 2025. DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2025.147814.
DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2025.147814