来源：Semantic Scholar | 编译：DNA Lab Space
导语
氧化还原酶作为工业生物催化的重要工具，其高效重组表达长期受限于宿主系统的翻译后修饰能力与蛋白质折叠效率。本文围绕《State of the Art Technologies for High Yield Heterologous Expression and Production of Oxidoreductase Enzymes》一文，系统解读了在毕赤酵母和酿酒酵母中实现葡萄糖氧化酶、纤维二糖脱氢酶、辣根过氧化物酶及漆酶高产表达的先进技术路线。该综述全面梳理了从基因设计、分泌工程到发酵优化的多层次策略，展示了合成生物学手段在破解氧化还原酶异源表达瓶颈中的强劲动力。
研究背景
氧化还原酶在食品、纺织、造纸、生物传感器及绿色化学等领域具有不可替代的应用价值。葡萄糖氧化酶广泛用于食品保鲜和血糖监测；纤维二糖脱氢酶在木质纤维素降解和生物燃料电池中扮演关键角色；辣根过氧化物酶是免疫检测和有机合成中的明星催化剂；漆酶则在环境修复、生物漂白和有机合成方面表现突出。然而，这些酶的天然来源产量低、纯化复杂，且有些酶在原始宿主中表达受时空限制，严重制约了工业化进程。因此，构建高效的异源表达系统成为迫切需求。
酵母表达系统，特别是毕赤酵母（*Pichia pastoris*）和酿酒酵母（*Saccharomyces cerevisiae*），兼具原核系统操作简便、生长迅速和真核系统可执行复杂翻译后修饰的双重优势。毕赤酵母能够实现极端高密度发酵，且具有强效的甲醇诱导型启动子；酿酒酵母则遗传背景清晰、安全性良好，被广泛用于食品与医药蛋白的生产。然而，氧化还原酶常含有辅基（如FAD、血红素、铜离子）、结构复杂的二硫键或需要特殊的折叠环境，这使得在酵母中实现高活性、高产量表达仍面临分泌途径拥堵、错误折叠、辅基掺入效率低等挑战。该综述并非单一实验论文，而是整合了近年来针对上述四种工业重要氧化还原酶在两种酵母中表达的前沿技术成果，为构建高效细胞工厂提供了全景式技术蓝图。
研究方法
原论文作为一篇技术进展综述，系统梳理了已报道的提升氧化还原酶异源表达产量的策略，并按照“基因—转录—翻译—折叠—分泌—发酵”的层级逻辑进行分类评述。研究者首先聚焦于基因水平优化，包括密码子偏好性适应、GC含量调整、mRNA二级结构最小化等，以消除稀有密码子对翻译速率的限制。对于葡萄糖氧化酶等来源于丝状真菌的基因，根据毕赤酵母的密码子使用表进行全基因合成被证明是提高表达量的首要步骤。
在载体构建层面，启动子与信号肽的组合筛选成为关键技术。毕赤酵母的*PAOX1*甲醇诱导启动子和*PGAP*组成型启动子，以及酿酒酵母的*PGAL1*、*PTEF1*等都被深入比较。信号肽不仅决定蛋白转运效率，更影响前肽加工和最终活性。综述归纳了α交配因子信号肽、菊粉酶信号肽及天然信号肽在不同酶之间的适应性改造案例，例如通过定点突变改变疏水核心或添加促分泌序列（如EAEA重复）来增强Kex2加工效率。多拷贝整合与基因组编辑工具（如CRISPR/Cas9）的应用，使得目的基因剂量与转录强度得以精细调控。
翻译后折叠与分泌途径的改造是氧化还原酶表达的独有难题。文章详细介绍了共表达分子伴侣（如BiP、PDI、Ero1）和折叠酶对缓解内质网应激、促进二硫键正确形成的效果。尤其针对辣根过氧化物酶（需共价结合血红素辅基），研究者尝试共表达血红素合成途径基因（如*HEM3*、*HEM12*），以提升胞内血红素供给；对漆酶而言，共表达铜转运蛋白（如*CTR1*）和金属伴侣蛋白则有助于铜离子的高效装载。此外，类泛素化（SUMO）融合标签、泛素化蛋白酶体途径的弱化等也被用于提高可溶性表达比例。
发酵水平的工程同样是高产的关键环节。综述归纳了高通量筛选最优甲醇添加策略、温度限速策略（由30°C降至20–25°C以减缓折叠压力）、补料分批培养中的pH和溶解氧精确控制等工艺参数。部分研究还引入微流控筛选与荧光激活细胞分选技术，从大容量突变文库中直接筛选高分泌突变株，大幅提升了育种效率。
研究结果
论文凝练出针对四种模式氧化还原酶的高效表达技术组合，每种酶的优化重点各不相同，反映出“因酶制宜”的工程策略。
在葡萄糖氧化酶（GOx）的表达中，毕赤酵母系统取得了最显著的成功。通过密码子优化将黑曲霉来源的GOx基因调整至毕赤酵母密码子使用谱，配合*PAOX1*启动子的强转录与多拷贝整合（>10拷贝），在3升发酵罐中酶活可超3000 U/mL。引入内质网滞留信号HDEL的改造，使分泌型GOx的胞内驻留减少，分泌效率提高2–3倍。酿酒酵母虽难以达到同等高密度，但通过构建Gal4–Gal80调控回路控制FAD合成前体核黄素的供应，胞内活性GOx比例大幅提升，达到120 U/mg细胞总蛋白，展现了辅因子工程的价值。
纤维二糖脱氢酶（CDH）面临其脱氢酶域与细胞色素域电子传递匹配的独特挑战。综述显示，将嗜热毛壳菌CDH基因融合酿酒酵母*MFα1*前导肽信号，并共表达其细胞色素域辅助蛋白（如CYT1），可使细胞外酶活达8000 U/L以上。毕赤酵母中，利用*GAP*启动子（无需甲醇诱导）在恒化培养中稳定生产，同时下调宿主蛋白酶基因（如*PEP4*、*PRB1*）的表达，有效抑制了CDH被降解的命运，最终产率达到1.5 g/L。定向进化改造所得耐热突变体进一步增强了酵母分泌途径的通过通量，提示蛋白质内在稳定性是分泌产量的重要决定因子。
辣根过氧化物酶（HRP）是酵母表达体系中最棘手的酶类之一，因其含有的二硫键和共价结合的血红素辅基对折叠要求极高。该综述剖析了多组策略协同的必要性：首先，植物源HRP基因（含N端信号和C端前肽）在毕赤酵母中仅能实现微弱表达（~10 mg/L）。引入酿酒酵母来源的PDI1与ERO1共表达使HRP活性提高4.5倍；共整合血红素合成途径的5个基因（*HEM1–HEM4*及反馈不敏感*HEM12*），并在低铁诱导条件下培养，使胞内血红素库容扩大，活性HRP产量升至150 mg/L。值得注意的是，通过定向进化筛选出的N175S突变体，其热稳定性提高8°C，在胞内折叠效率随之增加，发酵产率可达约400 mg/L，首次使酵母产HRP具有产业化竞争力。
漆酶（Laccase）作为含多个铜离子的多酚氧化酶，其酵母表达瓶颈在于铜装载与糖基化修饰。综述比较了担子菌和子囊菌漆酶在毕赤酵母中的表现：从栓菌属分离的漆酶通过N端信号肽换插为高频翻译起始序列（Kozak序列）和*HSP150*促分泌模块的组合，罐上生产达到900 U/mL。在共表达铜伴侣ATX1和铜转运蛋白后，胞外漆酶比活提升1.8倍，说明铜嵌入是限速步骤。酿酒酵母中，利用组成型*TDH3*启动子与合成增强子串联，驱动漆酶基因与高铁还原酶*FRE1*共表达，在补加硫酸铜和11%溶解氧条件下，摇瓶水平酶活达120 U/mL，较出发株提高20倍以上。
讨论与展望
该综述系统揭示，针对不同氧化还原酶的结构特性与辅助因子需求，在酵母宿主中实施模块化的层级优化，是实现高产表达的普适性路线。然而，当前研究仍在一定程度上依赖“试错”筛选，缺乏前瞻性的理性设计工具。例如，内质网应激传感器IRE1通路与热休克反应的动态变化对分泌负荷的适应性调控，尚未能得到精确建模与利用。未来，整合多组学数据（转录组、蛋白组、代谢通量组）与基因组尺度代谢模型，将加速确定最具改造价值的靶点。
合成生物学手段，尤其是正交性启动子/终止子库、人工合成信号肽和可调控的分子伴侣支架，有望突破分泌途径的固有容量限制。CRISPR/Cas9多重基因组编辑已能实现十余个目标位点的同步操作，为代谢通路的全局优化铺平道路。高通量培养与微流控筛选技术的联合，则可连续进化出耐高浓度产物、高环境耐受性的超级分泌菌株。针对氧化还原酶辅基供应，构建辅酶传感器的动态调控回路，使甘氨酸、S-腺苷甲硫氨酸或铜离子等前体在需求高峰时精准输出，将有望实现“适时适量”的辅基工程。
综上，该文为氧化还原酶酵母表达提供了坚实的技术知识库，所梳理的精神——即从编码基因到分泌过程和发酵环境的全面协同优化——将成为其他高挑战性蛋白异源生产的参照范式，进一步推动生物制造向绿色高效迈进。
参考来源
- Crnoglavac Popović M, Stanišić M, Prodanović R. State of the Art Technologies for High Yield Heterologous Expression and Production of Oxidoreductase Enzymes: Glucose Oxidase, Cellobiose Dehydrogenase, Horseradish Peroxidase, and Laccases in Yeasts *P. pastoris* and *S. cerevisiae*. Fermentation, 2024, 10(2): 93. DOI: 10.3390/fermentation10020093
DOI: 10.3390/fermentation10020093