基因组改组实现枯草芽孢杆菌数量性状位点定位

📅 2026-08-17 📰 Nat Commun 2026 Aug 5 📂 研究进展 👁 23

来源：Genome shuffling enables quantitative trait locus mapping in Bacillus subtilis.（Nat Commun）| 编译：DNA Lab Space

导读

数量性状位点（QTL）定位是真核遗传学的经典工具，但在细菌中应用有限——细菌缺乏性重组，难以产生足够的重组群体。本研究以枯草芽孢杆菌为对象，通过原生质体融合进行迭代双亲本基因组改组，构建了含350株高度重组菌株的QTL定位群体。利用该群体成功定位了芽孢萌发和群集运动两个复杂性状的因果基因座，并通过CRISPR介导的基因交换完成验证。该方法可推广至多种革兰氏阳性和阴性菌。

研究背景

高通量测序技术揭示了细菌庞大的遗传景观，但将DNA序列与可观察性状联系起来仍是难题。即使在研究最深入的模式菌株中，大量基因功能未知，复杂表型背后的遗传网络以及自然序列变异的效应也鲜有报道。全基因组缺失文库、转座子插入测序、CRISPR方法等筛选手段虽推动了细菌功能基因组学研究，但这类方法依赖功能缺失或获得实验，难以捕捉更微妙的遗传变异，也无法解析多基因数量性状的复杂遗传结构。

全基因组关联研究（GWAS）和QTL定位在真核遗传学中行之有效，前者利用自然群体，后者依赖由确定亲本杂交产生的实验重组群体。QTL定位通常需要性重组来打破基因连锁，而细菌的同源重组频率不足以产生合适的定位群体。本研究试图弥合这一鸿沟——通过原生质体融合驱动的迭代基因组改组，在枯草芽孢杆菌中构建高重组QTL定位群体。

研究方法

菌株与培养条件

本研究所用细菌菌株列于补充表1。枯草芽孢杆菌亚种B. subtilis subsp. subtilis RO-NN-1、B. subtilis subsp. subtilis NCIB 3610、B. subtilis DK1042、BKK349007、BKE131807、B. spizizenii TU-B-10、B. velezensis FZB42和B. velezensis GB03均购自芽孢杆菌遗传保藏中心（BGSC）。B. subtilis DSM1970购自德国微生物与细胞培养物保藏中心（DSMZ）。E. coli DH10B和JM109用于质粒构建和扩增。除非另有说明，E. coli、B. subtilis和B. velezensis菌株在Lysogeny broth（LB）培养基（酪蛋白胨10 g/l，NaCl 10 g/l，酵母提取物5 g/l）或添加1.5%（w/v）Bacto琼脂的LB固体培养基中培养。C. thermocellum培养于复合CTFUD或化学成分确定的CTFUD-NY培养基。N. aromaticivorans菌株培养于R2A培养基或以0.2%葡萄糖为唯一碳源的最小457培养基（DSMZ）。S. stutzeri菌株培养于LB肉汤或化学成分确定的最小琥珀酸盐培养基。E. coli培养于37°C，B. subtilis和B. velezensis培养于30°C或37°C，C. thermocellum培养于50°C或60°C，N. aromaticivorans培养于30°C，S. stutzeri培养于37°C。根据需要添加抗生素，浓度如下：卡那霉素（50 μg/ml）、红霉素（20 μg/ml）加林可霉素（12.5 μg/ml）、氯霉素（E. coli 25 μg/ml，B. velezensis 20 μg/ml，B. subtilis和N. aromaticivorans 15 μg/ml）、羧苄青霉素（100 μg/ml）、壮观霉素（100 μg/ml）、新霉素（300 μg/ml）、甲砜霉素（10 μg/ml）、阿普拉霉素（50 μg/ml）和链霉素（100 μg/ml）。用于菌株构建和验证的所有质粒和寡核苷酸汇总于补充表2和3。

【数据】培养基：LB（酪蛋白胨10 g/l，NaCl 10 g/l，酵母提取物5 g/l）；琼脂：1.5%（w/v）；温度：E. coli 37°C，B. subtilis/B. velezensis 30°C或37°C，C. thermocellum 50°C或60°C，N. aromaticivorans 30°C，S. stutzeri 37°C；抗生素浓度：卡那霉素50 μg/ml，红霉素20 μg/ml+林可霉素12.5 μg/ml，氯霉素15-25 μg/ml，羧苄青霉素100 μg/ml，壮观霉素100 μg/ml，新霉素300 μg/ml，甲砜霉素10 μg/ml，阿普拉霉素50 μg/ml，链霉素100 μg/ml

枯草芽孢杆菌双亲本定位群体的构建

以B. subtilis RO-NN-1和DK1042为亲本菌株，通过三轮和四轮原生质体融合基因组改组，创建遗传多样的重组菌株用于QTL定位。QTL群体的构建过程见补充图1。原生质体制备、融合和再生的方法参照此前报道。用于基因组改组的细胞在选择性培养基中于37°C过夜培养。次日，培养物以1:100比例稀释于新鲜培养基，培养至OD600为0.4–0.6。取5 ml培养物的细胞，离心（8000 × g，5 min，室温）收集，用1 ml SMM缓冲液（0.5 M蔗糖，20 mM MgCl2，20 mM马来酸）洗涤三次。洗涤后的细胞重悬于1 ml含1 mg/ml溶菌酶的SMMD缓冲液（SMM缓冲液补充5 μg/ml DNase I），37°C孵育1 h。原生质化后，各取500 μl亲本细胞系混合，离心（2000 × g，20 min，12°C）收集。混合的原生质体池用SMMD缓冲液洗涤一次，重悬于400 μl原生质体融合缓冲液（SMM缓冲液补充35%聚乙二醇（PEG）6000和10 mM CaCl2），室温孵育20 min。随后原生质体用SMMD缓冲液洗涤，重悬于100 μl补充1%牛血清白蛋白（BSA）的SMMD缓冲液，点样于无选择的DM3再生培养基。次日，从再生平板刮取细胞，重悬于最小培养基（MM），涂布于选择性LB或MM平板以分离株间重组子。

第一轮改组（S1）中，菌株RO-NN-1与DK1042 ΔhisB::kan ΔmetE::erm（“DK1042 HK ME”）杂交，菌株DK1042与RO-NN-1 ΔhisB::kan ΔmetE::erm（“RO-NN-1 HK ME”）杂交。ΔhisB::kan metE+（“S1 HK”）和ΔmetE::erm hisB+（“S1 ME”）重组后代分别在选择培养基上筛选——补充组氨酸（300 μM）和卡那霉素的MM琼脂，以及补充甲硫氨酸（1 mM）、红霉素和林可霉素的MM琼脂。S1 HK和S1 ME池通过刮取选择性平板上的所有菌落制成。细胞重悬于500 μl ddH2O，各取5 μl细胞悬液接种于5 ml选择性MM，37°C过夜培养。池以甘油储备形式保存。从S1 HK和S1 ME池中选择个体菌株进行重测序，RO-NN-1被鉴定为后代基因组的主要贡献者。

第二轮改组（S2）中，S1 HK池与DK1042 ΔmetE::erm（“DK1042 ME”）杂交，S1 ME池与DK1042 ΔhisB::kan（“DK1042 HK”）杂交，S1 HK与S1 ME杂交。各杂交的原养型（hisB+ metE+，“WT”）和双抗性后代（ΔhisB::kan ΔmetE::erm，“HK ME”）分别在MM琼脂和补充卡那霉素与红霉素的LB琼脂上筛选。各杂交产生的WT和HK ME池如上所述制备并保存为甘油储备。从各池中选取个体菌株进行重测序。每株菌的遗传变异数通过Geneious Prime（v2019.0和v2024.0）的单核苷酸多态性（SNP）调用功能及RO-NN-1参考基因组进行估算。S1 ME × DK1042 HK杂交产生的S2 WT和S2 HK ME菌株表现出最高的遗传多样性，被选入下一轮改组。

第三轮改组（S3）中，S2 WT池与DK1042 HK ME杂交，产生S3 HK1和S3 ME1重组后代；S2 HK ME池与DK1042杂交，产生S3 HK2和S3 ME2改组菌株。所有S3 HK1和S3 HK2菌株合并为S3 HK池。

第四轮改组（S4）中，S3 HK池与菌株RO-NN-1 ME杂交，产生S4 HK ME重组后代。

573株S3 HK1、S3 HK2和S3 ME1菌株及50株S4 HK ME菌株排列于96深孔板，使用短读长测序对其基因组进行重测序。对这些基因组序列的详细分析显示，约10%的样本含有混合读段——同一位置出现来自多个菌株的遗传变异，提示这些样本并非纯培养物。为解决此问题，所有孔中的培养物均在选择性平板上划线分离单菌落。共382株独立改组菌株、48个随机重复及亲本对照排列于五个96深孔板（补充图3），并对其基因组进行重测序。SNP被鉴定，从各亲本遗传的基因组片段边界按下述方法确定。过滤掉近乎相同的菌株、稀有遗传变异和板特异性变异后，最终获得350株遗传多样的菌株用于遗传定位。

【数据】离心条件：8000 × g，5 min，室温；2000 × g，20 min，12°C；SMM缓冲液：0.5 M蔗糖，20 mM MgCl2，20 mM马来酸；SMMD：补充5 μg/ml DNase I；溶菌酶：1 mg/ml；孵育：37°C，1 h；PEG 6000浓度：35%；CaCl2：10 mM；融合时间：室温20 min；BSA：1%；OD600：0.4–0.6；稀释比例：1:100；组氨酸：300 μM；甲硫氨酸：1 mM；最终定位群体：350株，59,571个SNP

三亲本基因组改组

三亲本杂交通过上述原生质体融合进行。将来自RO-NN-1 × DK1042双亲本杂交的24株S4 HK ME菌株的池与野生型B. spizizenii TU-B-10改组。两种潜在重组基因型（ΔhisB::kan metE+“HK”或Δmet::erm hisB+“ME”）的菌株分别在补充组氨酸（300 μM）和卡那霉素的MM琼脂及补充甲硫氨酸（1 mM）、红霉素和林可霉素的MM琼脂上筛选。个体重组菌株被分离并重测序。

【数据】三亲本改组亲本：24株S4 HK ME菌株池 + B. spizizenii TU-B-10；筛选标记：ΔhisB::kan metE+ / Δmet::erm hisB+；组氨酸：300 μM；甲硫氨酸：1 mM

B. velezensis菌株的基因组改组

B. velezensis GB03和S4 ΔhisB::kan ΔmetE::erm细胞的原生质体形成、融合和再生参照此前报道进行，并作部分修改。细胞在选择性LB肉汤中过夜培养，在选择性最小培养基中稀释100倍，37°C过夜培养。次日，取10 ml培养物调整至OD600为3，离心（7000 × g，5 min，室温）收集。沉淀用1 ml SM缓冲液I洗涤三次……

【数据】稀释倍数：100倍；OD600：3；离心：7000 × g，5 min，室温；洗涤：SM缓冲液I，三次

研究结果

高重组细菌QTL定位群体的开发

此前工作表明，芽孢杆菌菌株对之间单轮基因组改组产生的重组菌株，其基因组主要来自一个亲本，但含有多个来自第二亲本的非选择DNA片段，随机重组于整个染色体。例如，当B. subtilis 168和RO-NN-1改组时，来自B. subtilis 168的DNA片段平均替换了B. subtilis RO-NN-1基因组的2.7%（图1g），重组区域大小分布广泛，包括短插入（<100 bp）和大多基因片段（>60 kb）。这两个菌株在表型上存在差异，其核心基因组在68,538个单核苷酸多态性（SNP）位点不同（约98%核苷酸一致性），平均每50 bp一个SNP。此外，189个基因为RO-NN-1菌株独有，496个基因为DK1042染色体独有。因此，作者推断，具有这种遗传分化水平的菌株染色体之间高频重组将产生足够的核心基因和附属途径混合，从而驱动目标表型的可定位变异。

为构建定位群体，选择B. subtilis RO-NN-1作为第一亲本——此前工作中其在基因组改组中表现成功；DK1042作为第二亲本——该菌株具有遗传感受态，且表现出驯化菌株168中丢失的表型。识别因果基因座的统计置信度由重组程度及定位群体中遗传变异连锁的相应降低决定。为减少基因座间连锁，作者通过回交策略进行重复基因组改组循环以最大化重组（补充图1）。将位于染色体大致相对区域的氨基酸生物合成基因（hisB和metE）替换为抗生素抗性标记，分别构建RO-NN-1和DK1042的营养缺陷型菌株，然后与野生型DK1042和RO-NN-1杂交。每次杂交中，筛选含有来自双亲所有可能标记组合的重组菌株，产生S1后代。然后将S1菌株池回交至DK1042，产生S2后代，相同过程再重复一次产生S3后代。递归原生质体融合有效增加了全基因组重组——S3后代菌株平均继承约18.0%来自DK1042的基因组片段，在其染色体上创造了广泛的遗传多样性（图1g）。连续轮次的改组和选择引入了来自DK1042的长重组片段，侧翼为所选标记。为渐渗这些区域，通过将S3菌株池回交至RO-NN-1生成了一组S4重组菌株（补充图1和2）。作者测定了573株S3菌株和50株S4菌株的基因组结构。去除近乎相同的菌株后，保留了共350株含59,571个SNP的遗传多样菌株作为定位群体（图1h，补充图3和4）。由于杂交和选择方案（补充图1），QTL群体中大多数改组菌株在hisB基因座周围有重组，部分在metE基因座附近有重组（图1h）。然而，所有菌株均表现出广泛的全基因组非选择重组。

▲ a Replacing amino acid biosynthesis genes with antibiotic resistance markers in genetically divergent parents allows for selection of recombinant hybrid strains containing different marker allele combinations following genome shuffling by protoplast fusion (Supplementary Fig. 1 ). b Repeated rounds

【数据】单轮改组重组比例：168 DNA平均替换RO-NN-1基因组的2.7%；重组片段大小：<100 bp至>60 kb；亲本间SNP数：68,538；核苷酸一致性：约98%；SNP频率：平均每50 bp一个；RO-NN-1独有基因：189个；DK1042独有基因：496个；S3后代平均继承DK1042基因组片段：约18.0%；最终定位群体：350株，59,571个SNP

细菌QTL定位识别编码区和调控元件中的因果遗传变异

接下来测试定位群体能否用于识别复杂表型的因果等位基因。芽孢萌发是重要的发育表型，与食品工业和人类疾病直接相关。此前研究已鉴定B. subtilis RO-NN-1和168之间芽孢萌发的差异，促使作者将此性状作为QTL定位的初始测试案例。为分析芽孢萌发的遗传力，从两个QTL亲本和全部改组菌株产生芽孢，然后测量它们对L-丙氨酸作为唯一萌发剂的响应。如先前所述，观察到两个亲本芽孢萌发能力的显著差异（图2a和补充图5）。DK1042的芽孢萌发迅速，而RO-NN-1的芽孢在L-丙氨酸孵育120 min后未能萌发。重组菌株表现出高度表型变异，呈双峰分布（图2b，补充图6和补充数据1）。因此，使用芽孢萌发作为二元表型进行QTL定位。为估算QTL群体中遗传变异引起的内在噪声，首先使用真实基因型配合随机化二元芽孢萌发表型进行独立置换分析，均未显示任何显著关联（补充图7）。芽孢萌发数据的QTL定位识别出一个18.5 kb的高置信度强效应基因座，最显著的遗传变异位于编码萌发受体GerA的三基因操纵子内（图2c和补充图8）。两个亲本菌株的gerA操纵子包含166个序列变异，对应46个氨基酸差异（补充图9和10）。对重组后代中gerA区域的分析显示，在能利用L-丙氨酸萌发的改组菌株中DK1042变异更普遍，而在不能萌发的菌株中RO-NN-1变异更常见，证明了基因型-性状关联的显著性（补充图11）。

▲ a B. subtilis DK1042 and RO-NN-1 exhibit different spore germination abilities with L-alanine. Spores of the two strains were incubated with 1 mM L-alanine, and the decrease in optical density was monitored as phase-bright spores transitioned to dark-phase germinated spores. n = 4 independent experi

【数据】芽孢萌发表型：DK1042萌发迅速，RO-NN-1在120 min内不萌发；L-丙氨酸浓度：1 mM（50 mM结果一致）；QTL大小：18.5 kb；gerA操纵子序列变异：166个；氨基酸差异：46个；n = 4次独立实验；数据表示为均值±SD；Bonferroni校正阈值：p ≤ 0.05

群集运动表型的QTL定位

群集运动是另一种复杂表型，对生物膜形成和致病性有重要意义。两个亲本菌株的群集运动能力差异显著——DK1042在5 h内覆盖了较大面积，而RO-NN-1几乎不运动（图3a、b）。QTL群体中群集运动表型呈连续分布（图3c）。QTL定位在50 kb基因组区域内识别出一个与群集运动相关的基因座（图3d）。通过CRISPR介导的基因交换验证了该关联，并鉴定出两个候选因果遗传变异（图3e）。

▲ a 比较枯草芽孢杆菌DK1042和RO-NN-1在5小时和24小时内的群集运动性。显示了三个生物学实验的代表性数据。b 培养5小时后测得的DK1042和RO-NN-1群集覆盖面积。n = 3次独立实验。数据以平均值±标准差表示，并使用双尾学生t检验进行分析。*** p = 0.00024。c QTL群体中群集运动性表型的分布。显示了培养5小时后群集面积的直方图（补充数据2）。d 曼哈顿图的插图（补充图18）。

【数据】群集运动测量时间：5 h和24 h；DK1042 vs RO-NN-1群集面积：5 h时差异显著，***p = 0.00024（双尾Student's t检验）；n = 3次独立实验；QTL区域：50 kb；Bonferroni校正阈值：p ≤ 0.05

多表型筛选揭示QTL群体的广泛适用性

从QTL群体中选取23株遗传多样性最高的菌株，测试多种表型的变异（补充图3和补充数据4）。测试的表型包括：生物膜促进条件下的菌落形态（图4a）、胞外木聚糖酶活性（图4b）、pulcherrimin生物合成（图4c）、CRISPR-Cas9基因编辑效率（图4d），以及使用靶向trpC的CRISPR-Cas9质粒和修复模板（图4e）或空CRISPR-Cas9质粒（图4f）的转化效率。所有菌株（除RO-NN-1和一株携带暗灰色条的改组菌株外）均携带pulcherrimin生物合成基因簇。

▲ Phenotypic variability was tested across the 23 most genetically diverse strains from the QTL population (Supplementary Fig. 3 and Supplementary Data 4 ) for a variety of traits. a Distribution of colony morphology phenotypes under biofilm-promoting conditions. A histogram summarizing colony morphol

【数据】测试菌株数：23株；表型类别：菌落形态、木聚糖酶活性、pulcherrimin产量、CRISPR-Cas9编辑效率、转化效率（含/不含sgRNA靶向trpC）；pulcherrimin基因簇携带情况：除RO-NN-1和一株改组菌株外全部携带

基因组改组在其他细菌物种中的推广

为验证基因组改组QTL定位方法的普适性，在四种系统发育多样的细菌中进行了单轮原生质体融合基因组改组。B. velezensis中，GB03与S4的双抗性营养缺陷型突变体杂交，筛选ΔmetE::erm后代，蓝色条表示来自S4的重组序列（图5a）。C. thermocellum中，DSM1313的双抗性营养缺陷型菌株与野生型S14杂交，筛选pyrF+ ΔtrpC::cat后代，橙色条表示来自S14的重组基因组区域（图5b）。N. aromaticivorans F199的双抗性营养缺陷型菌株与野生型B0695通过原生质体融合杂交，筛选ΔhisB::kan leuB+后代，粉色条表示来自B0695的重组序列（图5c）。S. stutzeri DSM4166用A1501双抗性营养缺陷型突变体的基因组DNA转化，筛选双抗性营养缺陷型重组子，绿色条表示通过自然感受态来自A1501的重组序列（图5d）。每个同心圆代表四次杂交中一个重测序的重组菌株。蓝、橙、粉、绿箭头指示选择标记的位置，黑色箭头指示复制起点。

▲ 通过原生质体融合，在近缘菌株（a：贝莱斯芽孢杆菌；b：嗜热梭菌）之间进行了一轮基因组重排。对于贝莱斯芽孢杆菌，菌株GB03与S4的双抗营养缺陷型突变体杂交，筛选ΔmetE::erm后代。蓝色条表示来自S4的重组序列，其余基因组序列来源于GB03。对于嗜热梭菌，DSM1313的双抗营养缺陷型菌株与野生型S14杂交，筛选pyrF+ ΔtrpC::cat后代。橙色条表示来自S14的重组基因组区域。

【数据】B. velezensis：GB03 × S4双抗性营养缺陷型，筛选ΔmetE::erm；C. thermocellum：DSM1313双抗性营养缺陷型 × S14野生型，筛选pyrF+ ΔtrpC::cat；N. aromaticivorans：F199双抗性营养缺陷型 × B0695野生型，筛选ΔhisB::kan leuB+；S. stutzeri：DSM4166 × A1501基因组DNA转化，筛选双抗性营养缺陷型

讨论与解读

本研究通过迭代双亲本原生质体融合基因组改组，在枯草芽孢杆菌中成功构建了含350株高度重组菌株的QTL定位群体。三轮改组后，S3后代平均继承约18.0%来自DK1042的基因组片段，显著高于单轮改组的2.7%，证明递归改组有效降低了遗传连锁。利用该群体，研究定位了芽孢萌发（18.5 kb基因座，gerA操纵子）和群集运动（50 kb区域，两个候选变异）的因果基因座，并通过CRISPR介导的基因交换完成实验验证。方法在B. velezensis、C. thermocellum、N. aromaticivorans和S. stutzeri中均成功实现种间基因组重组，展示了广泛的适用性。

编译者解读： 这项工作的核心价值在于将真核QTL定位范式移植到细菌中，用原生质体融合绕开了细菌缺乏减数分裂重组的天然瓶颈。方法上的精巧之处在于双标记选择策略——hisB和metE位于染色体相对区域，迫使每次杂交都筛选不同标记组合的重组子，从而系统性累积全基因组重组。350株的定位群体规模在细菌遗传学中相当可观，59,571个SNP的分辨率足以定位到~15-20 kb的基因座。局限在于改组过程中选择标记附近的连锁拖拽效应——多数菌株在hisB附近都有重组，可能引入非随机性。从合成生物学应用看，该策略可直接用于工业菌株的多性状优化——通过改组聚合不同亲本的优良等位基因，同时利用QTL定位追踪因果变异，实现"育种"与"解析"的闭环。

参考来源

Vasileva DP, Chhetri HB, Hochanadel LH, Streich JC, Lagergren JH. Genome shuffling enables quantitative trait locus mapping in Bacillus subtilis. Nat Commun. PMID: 42557239.

PMID: 42557239

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