来源：Bioactive Silver Nanoparticles Synthesized Using Endophytic Bacillus subtilis CG1 and Their Antimicrobial and Antibiofilm Potential Against Drug-Resistant Pathogens.（Pharmaceuticals (Basel)）| 编译：DNA Lab Space
导读
多重耐药（MDR）病原菌的持续蔓延已成为全球公共卫生的重大威胁。本研究从药用植物没药（Commiphora gileadensis）中分离获得一株内生细菌，经16S rRNA基因测序鉴定为枯草芽孢杆菌CG1（Bacillus subtilis CG1），并利用其无细胞上清液绿色合成银纳米颗粒（AgNPs）。通过UV-Vis、FTIR、TEM、SEM-EDX及DLS等手段系统表征了纳米颗粒的理化性质，并评估了其对MRSA、K. pneumoniae、C. auris等八种临床相关耐药菌株的抗菌、抗真菌及抗生物膜活性。结果显示，该AgNPs呈球形、尺寸17–72 nm，对测试菌株表现出浓度依赖性抑制作用，MIC值低至6.25 µg/mL，展现出作为新型抗菌制剂的开发潜力。
研究背景
抗生素耐药性已成为全球人口面临的重大挑战。过度人口增长、全球移民增加和抗生素的广泛使用共同推动了耐药性的蔓延[1]。尽管抗生素长期以来是应对微生物感染的主要手段，但耐药性疾病的不断出现标志着抗生素发现时代的终结——新药开发持续乏力与不合理处方开具，是耐药性蔓延的关键风险因素[2]。自20世纪初青霉素发现以来，研究者一直在寻求对抗已对现有抗生素产生耐药性的细菌或念珠菌的新型抗生素[3]。耐药性的持续发展催生了多重耐药（MDR）菌的出现。金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌和肠杆菌属构成“ESKAPE”类群，是医院感染的主要病原体[4]。此外，念珠菌属是医疗相关感染的重要机会性真菌病原体，尤其威胁免疫功能低下及长期接受抗生素治疗的患者[5,6]。这些病原体引发的感染日益难以控制，迫切需要开发新型抗菌策略。银纳米颗粒因其独特的理化性质和广谱抗菌活性，被视为有前景的替代方案之一。
研究方法
4.1 植物采集与鉴定
健康的药用植物没药（Commiphora gileadensis）于2026年2月采集自沙特阿拉伯麦地那地区Al Mulaylih（位点坐标：24.8287354, 39.1490872）。采集茎、叶、根等不同部位的样品，置于灭菌密闭袋中，当日运送至沙特国王大学植物学与微生物学系微生物研究实验室进行内生细菌分离。植物样品经分类学鉴定，凭证标本保存于沙特国王大学植物学与微生物学系标本馆（KSUH-R.A. Baseni 3159）。
【数据】采集地点：Al Mulaylih, Madinah, Saudi Arabia；位点坐标：24.8287354, 39.1490872；采集时间：2026年2月；标本号：KSUH-R.A. Baseni 3159
4.2 内生细菌纯培养分离
植物样品先用无菌蒸馏水轻柔冲洗多次，以去除附着的土壤和碎屑。表面灭菌程序为：先用70%（v/v）乙醇处理60秒，随后浸入3%（w/v）次氯酸钠（NaClO）溶液中2分钟，再用70%（v/v）乙醇处理60秒。为彻底去除残留NaClO，样品用无菌蒸馏水（dH₂O）多次冲洗。所有灭菌操作均在无菌条件下进行[45]。
灭菌后的植物组织切片无菌置于含营养琼脂（NA）培养基的培养皿中。每个样品一式两份接种，于37°C培养48小时。培养后，将长出的细菌菌落反复转接到新鲜培养基上以获得纯培养物。纯化的细菌培养物随后保存在含30%甘油的冻存管中，于−20°C保存备用[46]。
【数据】灭菌剂：70%乙醇（60s×2次）+ 3% NaClO（2min）；培养基：营养琼脂（NA）；温度：37°C；时间：48h；保存条件：−20°C，30%甘油
4.3 内生细菌鉴定
#### 4.3.1 形态学与生化鉴定
形态学鉴定中，将细菌分离物划线接种于营养琼脂（NA）平板上，37°C培养24小时。记录菌落形态、大小、边缘、颜色、隆起度和表面质地等特征。随后利用新鲜培养的样品进行显微镜检查[47]。标准鉴定方案依据《Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology》执行[48]。革兰氏染色按标准方法进行[49]。过氧化氢酶活性通过常规过氧化氢试验评估[47,50]。淀粉水解试验通过将菌落接种于淀粉琼脂平板、37°C培养24–48小时进行评估。内生孢子染色采用Schaeffer–Fulton技术以评估分离物的产孢能力[47]。所有形态学和生化结果均记录在案，作为分子鉴定前的初步鉴定依据。
【数据】培养温度：37°C；培养时间：24h（形态学）/ 24–48h（淀粉水解）；染色方法：革兰氏染色、Schaeffer–Fulton内生孢子染色
#### 4.3.2 内生细菌的分子鉴定与系统发育分析
分子鉴定采用16S rRNA基因测序，该基因是广泛用于细菌分类学和系统发育研究的高度保守遗传标记[51,52]。保存于甘油冻存管中的新鲜培养物送至韩国首尔Macrogen Inc.进行遗传分析。服务内容涵盖基因组DNA提取、使用通用细菌引物进行16S rRNA基因PCR扩增——正向引物16S-27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和反向引物16S-1492R（5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′）、PCR产物纯化及双向测序，以确保约1500个碱基对的序列准确性和覆盖率[51]。原始测序读段组装成重叠群（contigs）并进行相似性分析。使用基本局部比对搜索工具（BLASTn网络服务器）将所得序列与NCBI数据库中存储的参考序列进行比对[53]。分类鉴定基于最高百分比相似性、查询覆盖率和E值（趋近0.0）。依据细菌分类学中普遍接受的阈值，序列相似性≥98%视为种水平上的紧密相关性，低于该阈值的则谨慎解读并报告为密切相关的物种[54,55]。此外，利用Mega 11程序对Macrogen Inc.获得的序列数据进行系统发育分析。从NCBI数据库获取BLASTn分析发现的最密切相关物种的参考序列，用于构建系统发育树。
【数据】引物：16S-27F / 16S-1492R；扩增片段：约1500 bp；物种鉴定阈值：16S rRNA相似性≥98%
4.4 枯草芽孢杆菌CG1无细胞上清液（CFS）的制备
为获得无细胞上清液（CFS），将枯草芽孢杆菌CG1在250 mL营养肉汤培养基中培养，37°C孵育三天。培养后，使用Model J2-21离心机（Beckman Instruments, Palo Alto, CA, USA）在10,000 rpm、4°C条件下离心15分钟以分离上清液。为确保完全去除细菌细胞，收集的上清液经0.22 µm膜过滤器过滤[56]。取100 µL CFS涂布于营养琼脂平板上，37°C培养24小时以验证无污染。无菌CFS随后储存于4°C，直至用于AgNPs生物合成。
【数据】培养基：营养肉汤（250 mL）；培养温度：37°C；培养时间：3天；离心：10,000 rpm，15 min，4°C；过滤：0.22 µm膜；验证：100 µL涂布NA平板，37°C，24h；保存：4°C
4.5 利用枯草芽孢杆菌CG1上清液生物合成AgNPs
AgNP生物合成方法：取50 mL枯草芽孢杆菌CG1上清液加入含450 mL 3 mM AgNO₃水溶液的750 mL锥形瓶中。初步试验在不同pH和温度条件下进行。基于初步观察结果，选择pH 10和60°C作为AgNP生物合成的最适条件，并用于后续所有实验。反应混合物在60°C孵育前用无菌1 N NaOH调节至pH 10。锥形瓶在旋转摇床中于150 rpm、黑暗条件下孵育72小时，以避免银离子的光还原。对照样品在相同条件下制备。处理设三组重复。纳米颗粒成功生成由颜色从浅黄色变为深棕色证实。合成的AgNPs通过15,000×g离心20分钟收集，用无菌双蒸水（ddH₂O）洗涤两次纯化，随后保存于−80°C供进一步分析[57]。
【数据】AgNO₃浓度：3 mM（450 mL）；上清液用量：50 mL；pH：10（1 N NaOH调节）；温度：60°C；转速：150 rpm；时间：72h；光照：黑暗；离心：15,000×g，20 min；洗涤：ddH₂O×2次；保存：−80°C
4.6 AgNPs的表征
生物合成AgNPs的表征参照Elias等人[58]的方法并稍作修改，采用多种技术手段。UV-Vis光谱用于评估200–800 nm范围内的光密度，以评价AgNP合成，使用6705 UV/Vis分光光度计（Jenway, Stone, Staffordshire, UK）。AgNPs中的官能团采用FTIR光谱在4000–400 cm⁻¹范围内测定（Thermo Fisher Scientific, Madison, WI, USA）。AgNPs的形态和平均尺寸利用透射电子显微镜（JEM-1011, JEOL Ltd., Tokyo, Japan）评估。样品按照制造商说明制备和处理。AgNPs的化学成分和元素组成使用JSM-6380 LA SEM（JEOL Ltd., Tokyo, Japan）和能量色散X射线（EDX）测量。由枯草芽孢杆菌CG1上清液合成的AgNPs的粒径分布和表面电荷使用动态光散射（DLS）测量。AgNPs的平均尺寸和表面电荷使用Zetasizer（ZS 90, Malvern Instruments Ltd., Malvern, Worcestershire, UK）测定。
【数据】UV-Vis范围：200–800 nm；FTIR范围：4000–400 cm⁻¹；DLS仪器：Zetasizer ZS 90
4.7 AgNPs的抗菌与抗生物膜活性
#### 4.7.1 微生物菌株
从沙特国王大学植物学与微生物学系微生物实验室获取八株耐药微生物菌株……（原文此处未详述具体菌株获取编号）
【数据】菌株来源：Microbiology Lab of Botany and Microbiology Department（原文未详述具体编号）
研究结果
2.1 内生细菌的分离与鉴定
#### 2.1.1 形态学与生化鉴定
从采集自沙特阿拉伯麦地那地区Al Mulaylih（位点：24.8287354, 39.1490872）的没药（Commiphora gileadensis）中分离获得内生细菌。对该细菌分离物进行了形态学和生化分析。表型特征显示，该分离物为革兰氏阳性、杆状细菌，呈现典型的芽孢杆菌样形态（图1）。该分离物过氧化氢酶阳性，能够形成内生孢子。此外，其淀粉水解试验呈阳性。
【数据】革兰氏染色：阳性；形态：杆状；过氧化氢酶：阳性；内生孢子：阳性；淀粉水解：阳性
#### 2.1.2 内生细菌的分子鉴定与系统发育
该内生细菌分离物通过16S rRNA基因测序成功完成分子鉴定。序列分析显示该分离物鉴定为枯草芽孢杆菌CG1菌株（GenBank登录号：PZ666008.1）。利用GenBank中与本研究菌株具有高相似度的菌株序列构建了邻接法系统发育树（图2）。
【数据】鉴定结果：Bacillus subtilis strain CG1；GenBank登录号：PZ666008.1
2.2 银纳米颗粒的绿色合成
通过枯草芽孢杆菌CG1上清液还原硝酸银实现AgNPs的绿色合成，通过观察颜色从浅黄色变为深棕色进行监测（图3）。反应在60°C、pH 10条件下进行。
【数据】反应温度：60°C；pH：10；颜色变化：浅黄→深棕
2.3 银纳米颗粒的表征
#### 2.3.1 UV光谱分析
AgNPs的合成通过UV-Visible分光光度法确认。AgNPs在400–420 nm范围内表现出特征性的表面等离子体共振（SPR）吸收带（图4）。
【数据】SPR吸收峰：400–420 nm
#### 2.3.2 FTIR光谱分析
B. subtilis-AgNPs的FTIR光谱在4000–400 cm⁻¹波数范围内呈现多个独特吸收带（图5），证实了多种官能团的存在。在约3710 cm⁻¹处检测到宽吸收带，表示未结合羟基的O–H伸缩振动。在2205–2156 cm⁻¹和2011–1950 cm⁻¹范围内检测到的其他吸收带分别归属于C≡N/C≡C和C≡C伸缩振动，表明存在腈基、炔基及相关官能团。
【数据】FTIR范围：4000–400 cm⁻¹；特征峰：3710 cm⁻¹（O–H）、2205–2156 cm⁻¹（C≡N/C≡C）、2011–1950 cm⁻¹（C≡C）
#### 2.3.3 透射电子显微镜（TEM）
透射电子显微镜（TEM）分析证实了测试样品中AgNPs的成功形成。如图6A所示，由B. subtilis CG1合成的纳米颗粒呈球形，出现明显的聚集形成团簇，尺寸范围为17.567至72.631 nm（图6B）。
【数据】颗粒形态：球形；尺寸范围：17.567–72.631 nm
#### 2.3.4 扫描电子显微镜（SEM）与能量色散X射线（EDX）
采用扫描电子显微镜（SEM；JEM-1011）配合能量色散X射线（EDX）分析对B. subtilis CG1制备的纳米颗粒进行检测。SEM成像用于分析纳米颗粒的表面形态和结构特征，如图7A所示。同时，EDX分析提供了合成材料元素组成的定性和定量数据，证实存在77.17%的银和22.83%的氯，这些元素参与了合成过程。图7B展示了在2.983 keV处银（Ag）和2.621 keV处氯（Cl）的分离特征峰谱图。光谱显示强烈的银信号，验证了AgNPs的成功合成。
【数据】Ag含量：77.17%；Cl含量：22.83%；Ag特征峰：2.983 keV；Cl特征峰：2.621 keV
#### 2.3.5 Zeta电位与粒径测定
采用Zeta电位分析和动态光散射（DLS）检测B. subtilis CG1生物合成AgNPs的表面电荷和粒径分布（图8）。总体而言，合成的纳米颗粒呈负Zeta电位值，尺寸分布处于纳米尺度，表明该细菌分离物成功合成了相对稳定且分布广泛的AgNPs。B. subtilis-AgNPs的Zeta电位值为−24.2 mV，Z-平均粒径为113.9 ± 67.75 nm。强度分布主峰出现在95.07 ± 23.93 nm处，多分散指数（PDI）为0.354。这些发现证实B. subtilis CG1能够合成具有纳米级尺寸和不同程度胶体稳定性的AgNPs。
【数据】Zeta电位：−24.2 mV；Z-平均粒径：113.9 ± 67.75 nm；强度分布主峰：95.07 ± 23.93 nm；PDI：0.354
2.4 AgNPs的抗菌与抗生物膜活性
#### 2.4.1 抗菌活性
B. subtilis CG1生物合成AgNPs的抗菌活性对受试的所有细菌菌株均表现出浓度依赖性抑制作用（图9）。所选AgNPs浓度（240、160和80 µg/mL）依据已报道的纳米颗粒对临床相关多重耐药菌抗菌活性评估研究确定，受试菌包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和表皮葡萄球菌。最高浓度（240 µg/mL）表现出最强的抗菌活性，抑菌圈范围为10–16 mm；160 µg/mL浓度下抑菌圈为8–12 mm；而最低浓度（80 µg/mL）表现出相对降低的活性（7–9 mm），且对受试菌株的抑制效果不一致——对某些菌株显示抑制活性，对其他菌株则无可观察效果。
【数据】最高浓度（240 µg/mL）抑菌圈：10–16 mm；中浓度（160 µg/mL）抑菌圈：8–12 mm；低浓度（80 µg/mL）抑菌圈：7–9 mm；统计方法：two-way ANOVA（p < 0.05）+ Tukey检验
#### 2.4.2 抗念珠菌活性
除抗菌活性外，所制备的纳米颗粒对白色念珠菌（C. albicans）、耳念珠菌（C. auris）和热带念珠菌（C. tropicalis）也表现出抑制作用（图10），在最高AgNPs浓度（240 µg/mL）下形成15–20 mm的清晰抑菌圈；160 µg/mL浓度下抑菌圈为12–16 mm；最低浓度（80 µg/mL）的抑菌圈最小，范围为8–11 mm。在受试念珠菌物种中，白色念珠菌敏感性最高，耳念珠菌敏感性最低。观察到的抗念珠菌活性证实了纳米颗粒抑制念珠菌生长的能力。
【数据】最高浓度（240 µg/mL）抑菌圈：15–20 mm；中浓度（160 µg/mL）抑菌圈：12–16 mm；低浓度（80 µg/mL）抑菌圈：8–11 mm；敏感性排序：C. albicans > C. tropicalis > C. auris
#### 2.4.3 MIC、MBC与MFC
对上述多重耐药细菌和念珠菌菌株评估了B. subtilis CG1生物合成AgNPs的MIC、MBC和MFC。MIC试验中的微生物生长基于浊度进行目视评估。结果表明，AgNPs的抗菌和抗念珠菌活性因受试微生物菌株而异（表1和表2）。总体而言，细菌菌株的MIC值范围为6.25至25 µg/mL，所有念珠菌物种的MIC值为25 µg/mL；MBC值范围为6.25至50 µg/mL，MFC值范围为25至100 µg/mL。
【数据】细菌MIC：6.25–25 µg/mL；念珠菌MIC：25 µg/mL；MBC：6.25–50 µg/mL；MFC：25–100 µg/mL
#### 2.4.4 细菌生长动力学
采用各细菌菌株预先测定的MIC、1/2 MIC、1/4 MIC和1/8 MIC浓度评估B. subtilis-AgNPs对细菌生长动力学的影响。总体而言，生长曲线显示AgNPs对所有测试细菌的抑制效果呈浓度依赖性（图11、图12、图13、图14和图15）。MIC浓度处理组在整个培养期内表现出最大程度的细菌生长抑制——完全抑制或显著抑制生长。相比之下，亚MIC浓度处理组表现出不同程度的生长延迟——推迟生长起始时间、降低生长速率和光密度值，均低于未处理对照组。这些观察结果与MIC和MBC结果一致。1/2 MIC、1/4 MIC和1/8 MIC浓度下细菌生长的逐渐恢复证实了AgNPs的浓度依赖性抗菌活性。
【数据】测试浓度：MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC；生长抑制：浓度依赖性；MIC组：完全抑制或显著抑制
讨论与解读
面对日益严峻的全球抗生素耐药性挑战，寻找替代性抗菌和抗生物膜制剂变得愈发重要。本研究利用从沙特阿拉伯麦地那地区Al Mulaylih采集的没药中分离的内生细菌B. subtilis CG1，成功生物合成了AgNPs，并评估了其对多种致病性和多重耐药菌株的生物活性。结果表明，所合成的纳米颗粒具有显著的抗菌效果，凸显了其作为有前景的治疗制剂的潜力，支持进一步开展体内研究的必要性。
内生微生物是定殖于植物内部组织而不造成伤害的细菌，通常与宿主形成有益共生关系[19]。本工作中鉴定出一株内生细菌分离物，与植物组织内的芽孢杆菌相关类群有关。这一发现与近期强调内生细菌作为植物微生物组重要组成部分、促进植物健康、生长和胁迫恢复力的研究一致[20]。
芽孢杆菌属作为内生菌的生态成功可归因于其独特的生理和结构特征。这些革兰氏阳性、产孢细菌能够产生高度抗性的内生孢子，使其在不利环境条件下存活。
编译者解读
本研究采用“植物内生菌→绿色合成”路线制备银纳米颗粒，巧妙利用了内生芽孢杆菌丰富的胞外还原酶体系，在温和条件下实现Ag⁺的生物还原，避免了传统化学合成法中有毒试剂的使用。方法上，多手段联合表征（UV-Vis、TEM、SEM-EDX、DLS）确保了纳米颗粒理化性质的可靠性；抗菌实验覆盖细菌与真菌、浮游态与生物膜态，评价体系完整。值得注意的是，DLS水合粒径（113.9 nm）显著大于TEM干态粒径（17–72 nm），提示颗粒在溶液中存在一定聚集，这可能影响其胶体稳定性与生物活性的一致性。未来研究若能优化表面修饰以减少聚集，并推进体内毒理学与疗效验证，将加速其临床转化进程。
参考来源
Aljohani GS, Salmen SH. Bioactive Silver Nanoparticles Synthesized Using Endophytic Bacillus subtilis CG1 and Their Antimicrobial and Antibiofilm Potential Against Drug-Resistant Pathogens. Pharmaceuticals (Basel). PMID: 42515783.
PMID: 42515783