来源：The potential role of Escherichia coli as an indicator of environmental antimicrobial resistance in an urban river in Japan.（Sci Rep）| 编译：DNA Lab Space
导读
城市河流既是人类活动影响的直接受体，也是耐药基因传播的重要环境库。本研究以日本大阪市平野川为对象，在2023年10月至11月间开展10次采样，系统考察了强降雨事件（可能触发合流制溢流）前后大肠杆菌与非大肠杆菌群大肠菌群的浓度变化及其对氨苄青霉素和四环素的耐药比例。研究发现，强降雨后两类指示菌浓度均上升超过两个数量级，且大肠杆菌的耐药比例显著高于非大肠杆菌群大肠菌群，提示其可作为城市河流环境耐药性监测的敏感指示菌。
研究背景
水生病原体主要通过粪便污染进入水生环境。长期以来，大肠菌群丰度被用作粪便污染指示，但其可靠性受环境因素及非粪便来源限制——部分大肠菌群可自然存在于土壤和水中。随着差异性和选择性培养基的发展，大肠杆菌的计数因更高的特异性和可靠性而成为评估粪便污染的标准方法。尽管肠道是大肠杆菌的主要栖息地，它能在土壤、水和沉积物等次生环境中长期存活，甚至可在非宿主环境中生存和生长。
检测和定量大肠杆菌及其他粪便大肠菌群，不仅关乎共存肠道病原体（包括有毒力的大肠菌群菌株）对人类健康风险的评估，还涉及它们在环境耐药性传播中的潜在角色。在"One Health"框架下，城市河流作为人类、动物与环境交界的关键节点，其微生物耐药性状况值得深入考察。
研究方法
采样于2023年10月17日至11月14日期间，在大阪市平野川的一座桥梁处（34.63530° N, 135.54944° E）进行。该采样点上游100 m处有一个合流制溢流（CSO）排放口。气象数据（包括总降水量、最大降雨强度和持续时间）取自日本气象厅。降雨事件分类采用Matsui和Miki提出的降雨强度指数，计算公式为：（总降水量[mm] × 最大降雨强度[mm h⁻¹]）/ 持续时间[h]。根据该研究的标准，未取整的指数值超过10即归类为强降雨事件。本研究仅用此分类识别可能触发CSO的降雨事件，并不作为CSO实际发生或采样时正在进行的直接证据。气象观测站距采样点约6 km。
现场测量使用pH计（D-71, Horiba, 京都, 日本）测定水温和pH，使用多参数仪（Multi 3420, WTW, 不来梅, 德国）测定电导率和溶解氧（DO）。采样桶在使用前按环境DNA采样规程清洗：将3.0%次氯酸钠泡沫清洁剂喷洒在桶内表面和绳索末端，数分钟后用自来水彻底冲洗，并在采样前风干2天。未使用硫代硫酸钠，因为冲洗后长时间风干被认为足以使残余氯消散。
使用连接绳索的清洁桶从水面以下10–30 cm深度采集河水样品。采样频率为每3天一次，持续1个月（2023年10月17、20、23、26、29日，11月1、4、8、11、14日，其中11月4日至8日间隔略有调整），共采集10个样品。采样于上午11:00进行，采集的样品立即放入带冰袋的保温箱中运回实验室，所有实验操作在采样后6小时内启动。
大肠杆菌和非大肠杆菌群大肠菌群的可培养浓度以菌落形成单位（CFU）定量，使用CHROMagar™ ECC显色琼脂培养基（Kanto Chemical, 东京, 日本）。耐药菌株的检测采用相同培养基，但分别添加50 µg/mL氨苄青霉素或10 µg/mL四环素。这些浓度用于区分耐药群体与敏感群体，因此未分离单个菌株进行下游药敏试验（AST）。临床最低抑菌浓度（MIC）折点为氨苄青霉素32 µg/mL、四环素16 µg/mL。在高于临床折点的浓度（50 µg/mL）下生长定义为对氨苄青霉素完全耐药；而在低于临床折点的四环素添加培养基（10 µg/mL）上生长则解释为中间耐药。类似阈值在先前研究中亦有使用。
水样处理遵循ISO 9308-1:2014指南。水样经0.45 µm孔径混合纤维素酯滤膜（Advantec, 东京, 日本）过滤，滤膜直接置于CHROMagar™ ECC琼脂平板上，于37°C培养24小时。菌落按制造商规格区分：蓝色菌落鉴定为大肠杆菌，淡紫色菌落鉴定为非大肠杆菌群大肠菌群。在本研究中，淡紫色菌落组即称为非大肠杆菌群大肠菌群部分。该区分基于酶活性：大肠杆菌中的β-葡萄糖醛酸酶裂解显色底物产生蓝色/蓝绿色，而非大肠杆菌群大肠菌群中的β-半乳糖苷酶裂解另一底物产生粉色/红色。
为确保菌落计数落在每板20–200 CFU的可定量范围内，每个样品使用一系列过滤体积（0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、100、250和500 mL）。体积小于10 mL时，向过滤漏斗中加入10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）混合后再过滤。仅用10 mL PBS过滤的滤膜作为阴性对照，以确认无菌落形成。PBS和所有过滤设备在实验前均已高压灭菌。每个样品进行三次技术重复分析，结果以每100 mL的CFU表示。对于每个细菌组和每个采样日期，分别在无抗生素培养基和添加氨苄青霉素或四环素的培养基上，从三次技术重复中分别计算平均CFU值。氨苄青霉素耐药比例和四环素中间耐药比例的计算方法为：同一种细菌组在相应抗生素添加培养基上的平均CFU值除以无抗生素培养基上的平均CFU值，再乘以100。由于无抗生素和含抗生素培养基上的菌落计数未在重复水平配对，变异性未传播至这些比例，故未显示误差线。
所有统计分析使用R软件进行。Spearman秩相关分析使用"cor()"函数评估环境参数与细菌丰度（CFU）之间的单调关系，相关矩阵使用ggcorrplot v0.1.4.1包可视化，数字标签表示Spearman相关系数。由于样本量有限（n = 10），未对Spearman相关分析进行统计显著性检验，仅报告相关系数。红色和蓝色分别表示正相关和负相关。大肠杆菌与非大肠杆菌群大肠菌群浓度的差异使用lme4包中"lmer()"函数实现的广义线性混合效应模型（GLMM）评估，细菌类型（大肠杆菌或非大肠杆菌群大肠菌群）作为固定效应，采样日期作为随机截距。CFU数据在统计分析前进行log10转换以改善正态性和方差稳定性。显著性水平设定为α = 0.05。GLMM分析的p值使用lmerTest包获得。
【数据】采样点：平野川（34.63530° N, 135.54944° E）；CSO排放口距采样点：100 m（上游）；采样深度：10–30 cm；采样时间：11:00；采样次数：10次（2023年10月17日–11月14日）；培养基：CHROMagar™ ECC；培养条件：37°C、24h；氨苄青霉素浓度：50 µg/mL；四环素浓度：10 µg/mL；临床MIC折点：氨苄青霉素32 µg/mL、四环素16 µg/mL；滤膜孔径：0.45 µm；可定量范围：20–200 CFU/板；过滤体积系列：0.01–500 mL；PBS体积：10 mL；阴性对照：仅10 mL PBS过滤；重复数：3次技术重复；α = 0.05
研究结果
图1和表S1显示了研究期间平野川的降水数据和水质参数。2023年10月20日、10月27日、11月6日和11月10日记录到降雨事件。总体而言，水质参数相对稳定，但2023年11月11日出现电导率和DO的显著下降。2023年11月6日和11月10日降雨事件的预设降雨强度指数值（见方法）分别报告为156.2和10.0（保留一位小数）。对于11月10日的事件，未取整的指数值超过了预设阈值10。因此，两次事件均被归类为可能触发CSO的强降雨事件。2023年11月8日采样在降雨后33小时进行，而2023年11月11日采样在降雨后15小时进行。
2023年11月11日，河水中大肠杆菌和非大肠杆菌群大肠菌群浓度与2023年11月8日相比显著升高。非大肠杆菌群大肠菌群浓度从2023年11月8日的1.14 ± 0.20 × 10⁴ CFU/100 mL上升至2023年11月11日的2.26 ± 0.18 × 10⁶ CFU/100 mL。同样，大肠杆菌浓度从8.00 ± 0.87 × 10² CFU/100 mL上升至1.59 ± 0.12 × 10⁵ CFU/100 mL，表明降雨事件后指示菌种群大幅增加，可能与CSO相关输入有关。在此期间，观察到电导率相对低于该河流系统的典型条件，且DO处于低水平。类似模式在其他地区亦有报道：塞纳河中，CSO事件后大肠杆菌和肠道肠球菌浓度增加了两个数量级；McGinnis等人报告了人类拟杆菌、总大肠菌群与近期CSO及降雨事件之间的显著相关性。
在CSO事件中，未经处理的污水可将粪便指示菌连同溶解离子和有机物一起引入受纳水体。因此，电导率主要应被解释为离子组成变化的指标，而非细菌或有机物浓度的直接度量。先前研究也表明，电导率与溶解性有机物（DOM）的荧光组分变化相关，反映了离子强度与DOM特性之间的关系。在城市河流中，电导率已被报道与粪便指示菌浓度相关，可作为微生物污染的快速筛查指标，尽管这种关系具有位点特异性。然而，在CSO事件期间，电导率并不一定单调增加；相反，随着雨水输入增加和污水部分被稀释，电导率可能下降。2023年11月11日观察到的电导率下降可能反映了这一稀释过程。尽管电导率降低，大肠杆菌和非大肠杆菌群大肠菌群浓度仍比旱季条件高两个数量级。如先前研究所指出，电导率在CSO事件期间可能不是粪便指示菌丰度的一致指标。
在本数据集中，大肠杆菌浓度与电导率（ρ = −0.68）和DO（ρ = −0.54）呈负Spearman相关，而非大肠杆菌群大肠菌群浓度与电导率（ρ = 0.21）和DO（ρ = 0.16）呈弱正相关（图3）。因此，尽管大肠杆菌和非大肠杆菌群大肠菌群表现出相似的时间模式（图2），但在这组数据中，它们与电导率和DO的关联在方向和强度上均有所不同。鉴于采样日期数量有限（n = 10）且未进行统计显著性检验，这些相关性应被描述性地解读，并不能确定两种细菌群体受到不同的环境控制。
非大肠杆菌群大肠菌群和大肠杆菌在河流中持续被检出，即使在旱季也是如此。除2023年11月11日强降雨事件（被归类为可能触发CSO）后的湿季样品外，非大肠杆菌群大肠菌群浓度在3.0 × 10³至2.0 × 10⁴ CFU/100 mL之间，而大肠杆菌浓度在1.0 × 10²至5.0 × 10² CFU/100 mL之间（图2）。对log10转换的CFU数据应用GLMM分析表明，大肠杆菌浓度与非大肠杆菌群大肠菌群浓度存在显著差异（估计值 = −1.58，95% CI −1.69至−1.48，P < 0.001），平均低约30至50倍。因此，平野川中大肠杆菌浓度约为非大肠杆菌群大肠菌群部分的2–3%。
从地貌学上看，该河属于大和川水系。使用相同的CHROMagar™ ECC培养基，Uranishi等人在大和川中检测到大肠菌群水平在1.0 × 10²至1.0 × 10⁵ MPN/100 mL之间，大肠杆菌水平在1.0 × 10¹至2.0 × 10³ MPN/100 mL之间，该数据基于2020年全年每月采样（12次采样事件）。这些浓度与同一水系中先前观察到的结果相似。
非大肠杆菌群大肠菌群包括多种环境物种，如克雷伯菌属、肠杆菌属和柠檬酸杆菌属，因此它们在河水中的检出并不令人意外。尽管WHO休闲水质指南强调大肠杆菌作为指示菌的高特异性，但近期研究已记录其独立于温血宿主在环境中持续存在甚至自然化的现象。Devane等人的综述考察了自然化粪便指示菌的现象，这些细菌可以在环境储库（如河流沉积物）中持续存在并可能增殖。另一篇综述对30年来关于水生栖息地中粪便微生物群衰减和持续性的研究进行了综合总结。本研究在旱季和湿季条件下均持续检出大肠杆菌，支持了上述观察结果，并提示其存在是慢性环境存在而非仅在可能涉及CSO相关输入的降雨事件后出现。
大肠菌群，尤其是大肠杆菌，在抗生素耐药基因的获取、维持和传播中发挥核心作用。临床监测中其他大肠菌群（如肺炎克雷伯菌和阴沟肠杆菌）的高耐药比例提示，监测这些物种在环境中的耐药潜力也可能很重要。在One Health框架下，识别主要的耐药性携带者强调了人类、动物和环境储库之间的相互关联性。尽管肺炎克雷伯菌和阴沟肠杆菌具有广泛的环境分布，但关于它们在总大肠菌群中所占比例的定量数据仍然有限。
【数据】非大肠杆菌群大肠菌群浓度（11月8日）：1.14 ± 0.20 × 10⁴ CFU/100 mL；非大肠杆菌群大肠菌群浓度（11月11日）：2.26 ± 0.18 × 10⁶ CFU/100 mL；大肠杆菌浓度（11月8日）：8.00 ± 0.87 × 10² CFU/100 mL；大肠杆菌浓度（11月11日）：1.59 ± 0.12 × 10⁵ CFU/100 mL；降雨强度指数：11月6日事件156.2、11月10日事件10.0；采样距降雨时间：11月8日33h、11月11日15h；Spearman相关：大肠杆菌-电导率ρ = −0.68、大肠杆菌-DO ρ = −0.54、非大肠杆菌群大肠菌群-电导率ρ = 0.21、非大肠杆菌群大肠菌群-DO ρ = 0.16；旱季浓度范围（非大肠杆菌群大肠菌群）：3.0 × 10³–2.0 × 10⁴ CFU/100 mL；旱季浓度范围（大肠杆菌）：1.0 × 10²–5.0 × 10² CFU/100 mL；GLMM估计值：−1.58（95% CI −1.69至−1.48，P < 0.001）；大肠杆菌占比：非大肠杆菌群大肠菌群的2–3%
讨论与解读
在可能触发CSO的强降雨事件后，非大肠杆菌群大肠菌群和大肠杆菌浓度上升超过100倍。这种与降雨的时间关联可能反映了CSO相关输入以及其他粪便污染来源（如家养动物或野生动物的径流），但本研究无法确定这些来源的相对贡献。
尽管大肠杆菌和非大肠杆菌群大肠菌群浓度升高，但测得的氨苄青霉素耐药比例和四环素中间耐药比例并未随降雨事件而上升。在旱季和湿季条件下均持续观察到大肠杆菌中的耐药性，提示河水中存在耐药大肠杆菌的持续存在。大肠杆菌浓度仅为非大肠杆菌群大肠菌群部分的约2–3%，但表现出更高的耐药比例——氨苄青霉素耐药平均23.1%，四环素中间耐药平均12.3%，而后者分别为3.7%和0.8%——支持大肠杆菌作为可培养大肠菌群中耐药性敏感指示菌的潜在价值。相比之下，非大肠杆菌群大肠菌群部分贡献了更大绝对浓度的耐药大肠菌群菌落。影响大肠杆菌动态的环境参数可能不同于影响其他大肠菌群物种的参数。
【编译者解读】
本研究巧妙利用"指示菌浓度+耐药比例"的双重指标，在城市河流场景中检验了大肠杆菌作为环境耐药性哨兵的可操作性。方法上，采用显色培养基结合抗生素添加平板的方式，无需分离单菌即可快速获得耐药比例数据，成本低、通量高，适合常规环境监测。数据显示大肠杆菌耐药比例远高于非大肠杆菌群大肠菌群，支持其作为AMR指示菌的灵敏度优势。局限在于未进行菌株分离和药敏试验确认，且样本量仅10次，相关分析缺乏显著性检验。未来若能将此方案与宏基因组测序或高通量qPCR结合，可更全面评估城市水系统中的耐药传播风险。
PMID: 42366199