来源：New Insights into Binding of G-segment DNA to the Active Site of Escherichia coli Topoisomerase III.（Sci Rep）| 编译：DNA Lab Space
导读
I型拓扑异构酶通过切断单链DNA来调控基因组拓扑结构，其与底物的结合机制一直是结构生物学的研究热点。本研究解析了五个大肠杆菌拓扑异构酶III（EcTopo3）与不同8碱基单链DNA复合物的晶体结构，分辨率达1.85–2.22 Å，意外发现了一种此前未被识别的"半开放"ssDNA结合模式。该发现颠覆了"底物结合必须伴随活性位点完全打开"的传统认知，为理解IA型拓扑异构酶的底物识别与催化机制提供了全新的结构证据。
研究背景
DNA拓扑异构酶通过操控基因组拓扑结构，支撑复制、转录和重组等关键细胞过程。I型拓扑异构酶在DNA上产生瞬时单链断裂以催化拓扑变化，而II型则通过瞬时双链断裂完成反应。IA型拓扑异构酶是唯一存在于所有生命域中的拓扑异构酶，其将DNA穿过单链断裂的能力对解开复制和重组中形成的特定中间体至关重要。
IA型拓扑异构酶还是唯一能催化RNA拓扑变化的拓扑异构酶亚家族。尽管人类拓扑异构酶IIIβ（hTop3B）的RNA拓扑异构酶活性最强且具有生理功能，其他真核生物、古菌和细菌的拓扑异构酶IA也具有可检测的RNA拓扑异构酶活性。有假说认为最后共同祖先（LUCA）含有RNA基因组，拓扑异构酶IA可能在其中负责结合和操控RNA底物。在进化过程中从RNA基因组向DNA基因组的转变，则需要拓扑异构酶IA结合并操控DNA底物以克服拓扑障碍。
本研究聚焦大肠杆菌拓扑异构酶III（EcTopo3）与不同单链DNA寡核苷酸的结合模式，通过晶体学手段揭示其底物识别的分子机制。
研究方法
克隆、蛋白纯化与结晶
编码EcTopo3（残基M1–K640）的基因片段经PCR扩增后克隆至T7表达载体pMCSG28中。将EcTopo3克隆入pMCSG28后，在C端引入了His₆标签，其前为TEV蛋白酶切割位点。
蛋白表达时，将质粒通过热激法转化至大肠杆菌SoluBL21细胞。小规模培养在含150 μg/mL氨苄青霉素的50 mL Luria Broth中进行，37°C过夜培养后按1:100稀释至1 L培养基进行大规模培养。细胞培养至37°C、OD₆₀₀达0.8–1.0后，冷却1小时至18°C，以0.4 mM IPTG诱导，18°C继续培养16小时。培养物于4°C、5,000 × g离心20分钟。细胞沉淀重悬于裂解缓冲液（50 mM HEPES pH 8.0、500 mM NaCl、20 mM咪唑、10 mM β-巯基乙醇（BME）、5%（v/v）甘油），使用10X FastBreak™细胞裂解试剂（Promega）配合10 µg/mL溶菌酶和Benzonase®核酸酶进行裂解。细胞悬液冰上孵育30分钟后，于25,000 × g离心75分钟。收集可溶组分，通过固定化金属亲和层析（IMAC）纯化蛋白，使用3 mL Ni²⁺-Sepharose（Cytiva）装填于Flex-Column柱中，在Vac-Man真空系统（Promega）上操作。柱子用裂解缓冲液（50 mM HEPES pH 8.0、500 mM NaCl、20 mM咪唑、5%甘油、10 mM β-巯基乙醇）平衡后，加入可溶组分，依次用30 mL裂解缓冲液和10 mL含50 mM咪唑的裂解缓冲液洗涤。蛋白用50 mM HEPES pH 8.0、500 mM NaCl、250 mM咪唑、5%甘油、10 mM β-巯基乙醇洗脱。洗脱蛋白与His标签TEV蛋白酶（TEV与蛋白摩尔比1:20）于4°C孵育16小时，并于4°C对裂解缓冲液透析过夜。第二次IMAC柱（用裂解缓冲液平衡）用于去除切割下来的His标签和His标签TEV蛋白酶。含有蛋白的柱流穿液和洗涤组分合并，用50 kDa浓缩器（Merck-Millipore）浓缩，随后缓冲液交换至20 mM HEPES pH 7.5、150 mM NaCl、2 mM TCEP。
纯化的EcTopo3（约20 mg/mL）在无RNA酶环境中直接加入供应商（Sigma-Aldrich、IDT）提供的含冻干DNA/RNA颗粒的管中。每个混合物中EcTopo3与DNA或RNA寡核苷酸的摩尔比约为1:1。本研究所用DNA和RNA寡核苷酸详见表1。EcTopo3/DNA和EcTopo3/RNA混合物用Mosquito纳升液体处理器（TTP LabTech）以坐滴气相扩散法进行结晶筛选。结晶筛选使用MCSG1-4（Anatrace）筛选试剂盒，于16°C进行。每个结晶液滴含0.4 µL蛋白和0.4 µL沉淀剂，与含140 µL沉淀溶液的储液池平衡。EcTopo3与ssDNA寡核苷酸（包括8MerD1、8MerD2、8MerD3、8MerD7和8MerD8）的复合物各在一到两种条件下结晶。代表性结晶条件包括：0.2 M柠檬酸氢二铵 pH 5.0、20%（w/v）PEG3350（EcTopo3-8MerD1、EcTopo3-8MerD7和EcTopo3-8MerD8）；0.1 M醋酸锂、20%（w/v）PEG3350（EcTopo3-8MerD2）；以及0.1 M柠檬酸钠、20%（w/v）PEG4000和20%（v/v）2-丙醇（EcTopo3-8MerD3）。
表1 实验中使用的ssDNA和RNA寡核苷酸
| 寡核苷酸 | 序列 | 核苷酸结合位置 |
|---|---|---|
| DNA 8MerD1 | 5'-CGCAACTT-3' | +2 +1 −1 −2 −3 −4 −5 −6 −7 |
| DNA 8MerD7 | 5'-ACTGACTT-3' | T T C A G T C A |
| DNA 8MerD8 | 5'-CTGAACTT-3' | T T C A A G T C |
| DNA 8MerD9 | 5'-CCGAACTT-3' | |
| DNA 8MerD2 | 5'-AACTGTTG-3' | G T T G T |
| DNA 8MerD3 | 5'-GCAACTGG-3' | G G T C A A |
| DNA 8MerD4 | 5'-CGACACTT-3' | |
| DNA 8MerD5 | 5'-CGAAGTCT-3' | |
| DNA 8MerD6 | 5'-CGATGTTT-3' | |
| RNA 8MerR1 | 5'-CGCAACUU-3' | |
| RNA 8MerR2 | 5'-AACUGUUG-3' | |
相比之下，本系列实验中未获得EcTopo3-RNA复合物晶体。尽管在多种EcTopo3-RNA条件下形成了晶体，但所有晶体均为单独的EcTopo3，未结合RNA。提高RNA:EcTopo3摩尔比也未能产生EcTopo3-RNA复合物晶体；反而似乎逐渐抑制了EcTopo3的自结晶。
X射线衍射数据收集前，所有晶体均被捞取、用防冻保护液（相应母液中含25%（v/v）甘油或乙二醇）处理，并在液氮中快速冷冻。
X射线衍射与结构解析
X射线衍射数据在100 K下从冷冻晶体收集，使用阿贡国家实验室先进光子源24-ID-E和21-ID-F光束线以及布鲁克海文国家实验室国家同步辐射光源II 17-ID-2光束线。强度数据用HKL-3000程序套件或Xia2进行积分、缩放和合并。EcTopo3-DNA结构通过分子置换（MR）方法解析，使用先前确定的EcTopo3复合物结构（PDB条目1I7D）或本研究首次确定的复合物结构作为搜索模板。最终模型经Coot进行迭代模型重建和Phenix.refine进行约束精修后完成，并用Molprobity验证（表2）。
在EcTopo3-RNA共结晶条件中产生的无配体EcTopo3晶体衍射较弱，与先前报道一致。由于所得结构与已发表的无配体EcTopo3结构（PDB条目1D6M）几乎相同，未提供额外信息，因此本研究确定的无配体EcTopo3结构未存入蛋白质数据库。在以下展示和讨论中，使用PDB条目1D6M的结构作为代表性无配体EcTopo3结构。
表2 晶体学数据汇总
| 数据收集统计 | 8MerD1 | 8MerD7 | 8MerD8 | 8MerD2 | 8MerD3 |
|---|---|---|---|---|---|
| 空间群 | C2 | C2 | C2 | P2₁ | P2₁ |
| 晶胞参数（Å, °） | a=111.3, b=132.6, c=77.24, β=101.3 | a=109.9, b=132.4, c=78.77, β=134.2 | a=70.52, b=73.15, c=198.7, β=101.3 | a=39.92, b=123.1, c=86.28, β=98.74 | a=38.69, b=120.9, c=85.61, β=99.34 |
| 分子量Da（氨基酸数） | 72,122 (640) | 72,122 (640) | 72,122 (640) | 72,122 (640) | 72,122 (640) |
| 不对称单元分子数 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 波长（Å） | 0.979 | 0.979 | 0.979 | 0.979 | 0.979 |
| 分辨率（Å） | 2.22–55.7 | 2.20–54.4 | 2.10–34.4 | 1.90–61.60 | 1.85–60.50 |
| 独立反射数 | 39,262 (2,897) | 40,486 (3,006) | 47,324 (3,478) | 63,110 (4,699) | 64,910 (4,763) |
| Rmerg (%) | 5.8 (104) | 29.4 (105.0) | 39.2 (76.7) | 10.1 (90.6) | 9.7 (91.7) |
| Rpim (%) | 3.4 (59.4) | 24.3 (47.8) | 35.8 (50.7) | 8.6 (79.7) | 5.1 (48.1) |
| CC ½ | 0.999 (0.688) | 0.988 (0.473) | 0.997 (0.884) | 0.985 (0.618) | 0.996 (0.454) |
| 完整度（%） | 98.9 (99.2) | 99.1 (98.2) | 99.9 (99.6) | 99.9 (99.8) | 99.6 (98.7) |
| 冗余度 | 3.9 (3.9) | 5.7 (5.7) | 6.7 (6.2) | 3.4 (3.4) | 4.5 (4.6) |
| I/σ(I) | 10.3 (1.0) | 8.8 (1.3) | 8.6 (1.5) | 6.2 (1.2) | 8.2 (1.5) |
| 溶剂含量（%） | 56.6 | 56.6 | 56.6 | 53.5 | 54.9 |
| 定相 | | | | | |
| 分辨率范围（Å） | 3.00–55.7 | 3.00–54.4 | 3.00–34.4 | 3.00–61.6 | 3.00–60.50 |
| 相关系数（%） | 69.0 | 53.9 | 50.5 | 32.6 | 58.8 |
| 精修 | | | | | |
| 分辨率范围（Å） | 2.22–55.7 | 2.20–54.4 | 2.10–34.4 | 1.90–61.6 | 1.85–60.50 |
| 反射数 | 39,113 | 40,292 | 47,021 | 62,849 | 64,581 |
| 完整度（%） | 98.3 | 98.5 | 98.9 | 99.4 | 97.8 |
| Rwork/Rfree (%) | 22.1/26.0 | 21.8/23.6 | 22.7/26.5 | 19.1/22.8 | 17.8/21.2 |
| 原子数 蛋白/DNA/HETATM | 4,905/158/84 | 4,911/162/140 | 4,929/162/166 | 5,015/104/42 | 4,967/125/434 |
| 键长（Å） | 0.003 | 0.003 | 0.003 | 0.009 | 0.013 |
| 键角（度） | 0.584 | 0.563 | 0.503 | 0.925 | 1.141 |
| B因子（Ų）蛋白主链/侧链、DNA | 84.3/85.6, 76.0 | 64.6/66.5, 77.6 | 61.1/63.2, 53.8 | 35.4/39.2, 33.8 | 29.4/33.1, 40.5 |
| Wilson B因子（Ų） | 58.4 | 46.0 | 39.4 | 26.4 | 24.7 |
| Molprobity验证 | | | | | |
| Ramachandran异常值（%） | 0.00 | 0.16 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
| Ramachandran favored（%） | 96.44 | 97.09 | 97.57 | 98.38 | 98.38 |
| Rotamer异常值（%） | 1.34 | 0.19 | 0.57 | 0.37 | 0.56 |
| Clashscore | 2.97 | 3.45 | 3.92 | 2.63 | 4.36 |
| PDB条目 | 1GX | 1YY | 1FC | 1KB | 1LB |
注：不包括C末端载体来源的六个残基ENLYFQ。括号内为最高分辨率壳层数据。
【数据】载体：pMCSG28；表达菌株：E. coli SoluBL21；IPTG浓度：0.4 mM；诱导温度：18°C；诱导时间：16h；离心：5,000 × g/4°C/20min；裂解缓冲液：50 mM HEPES pH 8.0/500 mM NaCl/20 mM咪唑/10 mM BME/5%甘油；TEV比例：1:20；结晶温度：16°C；液滴体积：0.4 µL；储液池体积：140 µL；分辨率范围：1.85–2.22 Å
研究结果
在本研究中，我们解析了EcTopo3与不同8mer ssDNA寡核苷酸复合物的五个晶体结构，分辨率范围为1.85 Å至2.22 Å。所有结构均经过精修，得到具有高立体化学质量的模型（M1至P620），见表2。表达构建体的C末端片段（G621至K640）在结构中未解析，推测为无序区域。拱形D2结构域的一部分在两个结构中呈现部分无序。
拓扑异构酶IA相对于切割位点不对称地结合G段（ssDNA）。EcTopo3的ssDNA结合位点以一个主要位于D4内、由D1突出部分补充的ssDNA结合沟为特征。D4/D1 DNA结合沟延伸至D1和D3之间的结构域间空间（D1/D3结合位点），图1A。这两个DNA结合位点在结构和功能上各不相同，如下所述。
EcTopo3与8MerD1（5'-CGCAACTT-3'）的复合物
DNA寡核苷酸8MerD1是先前研究中唯一用于制备EcTopo3-DNA复合物的寡核苷酸。在本研究中，该寡核苷酸作为酶与DNA共结晶的对照。其复合物在低pH（pH=5.0）条件下结晶，晶体用25%甘油进行冷冻保护。该条件和处理方式与结构为PDB条目2O19的EcTopo3-8MerD1晶体等相似。新的EcTopo3-8MerD1结构的构象与PDB条目2O19结构中存在的两个复合物之一（B-D链，开放构象）几乎相同，如图1A所示。在开放构象中，催化残基Y328被定位为与可切割核苷酸的磷酸基团相互作用（图1A）。使用二级结构匹配（SSM）对两个开放构象结构进行比对，得到均方根偏差（RMSD）值为1.03 Å。简单的目视检查显示D4结构域比对更好，而其他结构域存在一些相对移动。拓扑异构酶IA结构中的拱形D2结构域在机制模型中以其结构流动性而闻名。在PDB条目2O19结构中，D1和D3结构域似乎彼此更接近；特别是D1似乎向上位移。因此，D1和D3结构域之间较窄的空间似乎将3'端的两个核苷酸稍微推出D1/D3结合位点，使其呈现更弯曲的构象。目前尚不清楚同一蛋白结合同一DNA寡核苷酸（8MerD1）的两个结构之间的这些整体构象差异是源于不同的结晶条件、晶体中的分子堆积还是冷冻保护剂处理。在这一特定案例中，PDB条目2O19的结构包含一个来自C端表达标签的短螺旋（His-tag螺旋），结合在D1和D4之间（图1A）。这种晶体学伪影可能诱导了非预期的结构变化。
两个EcTopo3-8MerD1结构的D4结构域叠加显示，结构域本身以及五个5'端核苷酸的骨架高度对齐，除了末端5'核苷酸有轻微位移。D4结构域在G段结合时的构象保守性已在先前研究中被注意到，下文将进一步讨论。然而，即使在这个相对保守的D4/D1结合沟内，同一酶也能以不同方式与同一底物相互作用（图1B、C）。−4和−5核苷酸之间扭结以外的相互作用模式大体保守，包括R178与−5位置鸟嘌呤之间形成的双齿氢键，以及R178的胍基、W61的吲哚环和−6位置胞嘧啶碱基之间的堆积相互作用。在新的EcTopo3-8MerD1结构中（图1B），E47与−2和−3位置的腺嘌呤形成氢键。Q48通过水介导的桥与−4位置的胞嘧啶相互作用。相比之下，在PDB条目2O19的结构中，−2、−3和−4位置的碱基似乎主要由水分子协调，未观察到这些碱基与酶之间的直接接触。直接氢键被水介导的氢键网络取代通常与晶体结构中溶剂含量和含水量的增加相关。新EcTopo3-8MerD1结构晶体的溶剂含量约为56.6%（表2），而PDB条目2O19结构晶体的溶剂含量明显更高，为68.0%。
【数据】分辨率：2.22 Å；RMSD（SSM比对）：1.03 Å；溶剂含量：56.6%（新结构）vs 68.0%（PDB 2O19）；结晶条件：0.2 M柠檬酸氢二铵 pH 5.0、20% PEG3350；冷冻保护：25%甘油
EcTopo3与8MerD7和8MerD8的复合物
与8MerD1相比，8MerD7、8MerD8和8MerD9（表1）在5'端含有3到4个核苷酸替换，但只有EcTopo3-8MerD7和EcTopo3-8MerD8复合物在用于EcTopo3-8MerD1的条件下获得了晶体。这些晶体属于相同的空间群，并表现出相当的晶胞参数、溶剂含量和分辨率极限（表2），表明整体晶体堆积环境高度相似。
与此一致，EcTopo3-8MerD7、EcTopo3-8MerD8和EcTopo3-8MerD1的结构叠加给出的两两RMSD值小于0.7 Å，结合的ssDNA的磷酸-糖骨架几乎无法区分。因此，尽管结合的寡核苷酸存在序列差异，特别是在D4/D1结合沟内，酶以最小的整体结构变化适应这些底物。一个关键的保守特征是R178与−5位置核苷酸碱基之间的双齿氢键（图1B和图2A、B）。在三个结构中，该核苷酸分别是鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶，表明该位点容忍多种碱基，只要维持所需的氢键几何。由于−5碱基不与相邻碱基或芳香族蛋白侧链形成堆积相互作用，该位点的稳定可能主要依赖于与R178的双齿相互作用，Q50或局部氢键网络起次要作用。相比之下，腺嘌呤在该位置不利，因为腺嘌呤N6和精氨酸侧链都是氢键供体，不太可能形成有利的相互作用（图2A）。这可能构成EcTopo3 ssDNA序列偏好性的结构基础之一。
有趣的是，−6位置的碱基……
【数据】两两RMSD：<0.7 Å；保守相互作用：R178双齿氢键（−5位）；−5位可容纳碱基：G/C/T；不利碱基：A（供体-供体排斥）；空间群：C2；分辨率：2.10–2.20 Å
半开放ssDNA结合模式
【数据】半开放结构：8MerD2、8MerD3复合物；结合核苷酸数：仅5个3'端核苷酸；未解析核苷酸：3个5'端核苷酸；金属结合位点：甘氨酸富集环；配位方式：主链羰基+保守水分子
讨论与解读
本文报道的五个EcTopo3–ssDNA复合物结构提供了比早期工作更细致的IA型拓扑异构酶ssDNA识别视图。这些结构共同表明，EcTopo3通过两个结构和功能上不同的区域与G段结合：一个高度保守的D4/D1沟，容纳大部分结合的ssDNA骨架；以及一个更构象可变的D1/D3位点，更靠近催化酪氨酸。数据进一步表明，D4/D1沟的占据不需要D1/D3区域完全打开，从而揭示了一种先前未被识别的半开放结合模式，可能代表DNA结合途径中催化相关的中间态，尽管不能排除其为非生产性中间体的可能性（图6）。这种构象接近中间状态，其中D1/D3结构域间空间未完全打开，从而阻止−1、+1和+2位置的核苷酸采用催化活性构象。类似中间体也曾在EcTopo1–ssDNA复合物中报道。此外，半开放结构中结合在D4/D1沟内的ssDNA寡核苷酸可能代表G段切割后产生的非共价结合切割产物，而与催化酪氨酸连接的共价5'-磷酸酪氨酰中间体则有助于打开T段通过的闸门。
编译者解读
本研究通过系统的共结晶策略，用五种不同序列的8碱基ssDNA寡核苷酸捕获了EcTopo3的开放与半开放两种结合构象，方法学上值得借鉴——用序列变异"钓取"构象中间态的策略，对研究其他核酸结合蛋白的动态过程具有参考价值。半开放结合模式的发现提示，IA型拓扑异构酶的底物识别可能是分步进行的，这对设计靶向该酶催化循环特定步骤的抑制剂具有指导意义。不过，半开放态是否为催化中的真实中间体，仍需与溶液态实验（如FRET或NMR）交叉验证。此外，RNA共结晶的系统性失败也提示，EcTopo3对RNA底物的结合可能采用了不同的机制，值得后续结构研究关注。
参考来源
Tan K, Annamalai T, Stols L, Bhuiyan MAR, Tse-Dinh YC. New Insights into Binding of G-segment DNA to the Active Site of Escherichia coli Topoisomerase III. Sci Rep. PMCID: PMC13476441.
PMCID: PMC13476441