巴斯德毕赤酵母编码两种功能性Pho4转录因子

来源：Komagataella phaffii Encodes Two Functional Pho4 Transcription Factors.（Int J Mol Sci）| 编译：DNA Lab Space

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导读

磷酸盐是生命活动不可或缺的营养物质，真菌通过Pho4转录因子响应磷饥饿。长期以来学界认为PHO4基因在真菌中仅有一个拷贝，但工业酵母K. phaffii却含有两个候选基因。本研究对这两个基因进行了系统的功能解析，发现它们功能部分重叠、对不同刺激响应各异，共同构成多重胁迫适应的重要组件。该发现不仅修正了Pho4单拷贝的传统认知，也为工业菌株的胁迫耐受改造提供了新靶点。

研究背景

无机磷酸盐（Pi）是真核生物能量代谢、核酸合成、膜形成及信号转导所必需的基础营养。环境中磷浓度波动剧烈，酵母必须通过感知磷水平变化、激活高亲和力磷转运系统、动员胞内磷储备并调整代谢途径来维持生长。在S. cerevisiae中，Pi充足时肌醇磷酸通过SPX结构域抑制Pho81，进而激活Pho85-Pho80 CDK复合物，该复合物磷酸化Pho4转录因子的多个SP基序，使其被Msn5出核而失活。磷饥饿时Pho81抑制Pho85-Pho80激酶，Pho4去磷酸化并入核，激活约20个PHO调节子基因的表达。然而，K. phaffii基因组中可能存在两个Pho4编码基因——这一现象打破了真菌Pho4通常由单基因编码的普遍认知，但这两个基因从未被功能鉴定过。

研究方法

4.1 生长条件与重组DNA技术

E. coli DH5α菌株在37°C的LB培养基中培养。作为质粒宿主时，培养基添加潮霉素B（100 µg/mL）。E. coli转化及标准重组DNA技术按文献[57]进行。K. phaffii细胞（X-33）在28°C的YP培养基（酵母提取物1%，蛋白胨2%）中添加2%甘油（YPGly）作为碳源（除非另有说明），并按照文献[58]所述方法使用Gene Pulser电穿孔仪（Bio-Rad）进行电转化。本工作使用的S. cerevisiae菌株为BY4741（MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0）及其同源pho4::kanMX4衍生株[59,60]，以及DBY746（MATα his3Δ1 leu2-3 leu2-112 ura3-52 trp1-289）及其同源衍生株MAC008（pho4::kanMX）。MAC008菌株通过将pho4::kanMX4 cassette（以寡核苷酸pho4_5′_amp和pho4_3′_amp从菌株ASC15基因组DNA扩增，见补充表S3A）转化DBY746细胞制备。S. cerevisiae细胞在28°C的YP培养基（含2%葡萄糖，YPD）或合成培养基（SC，必要时缺失尿嘧啶和亮氨酸）中培养[62]，并采用醋酸锂方法的变体进行转化[63]。固体培养基添加2%细菌琼脂（Condalab），测试磷限制生长时改用纯化琼脂（Condalab，Cat. #1806）。

【数据】E. coli培养温度：37°C；潮霉素B浓度：100 µg/mL；K. phaffii培养温度：28°C；碳源：2%甘油；S. cerevisiae培养温度：28°C；碳源：2%葡萄糖；琼脂浓度：2%

4.2 *K. phaffii* PHO4(A)和PHO4(B)突变体的构建

通过CRISPR/Cas9介导的基因破坏[64]在PHO4(A)（PAS_chr1-1_0265）和PHO4(B)（PAS_chr2-1_0177）的ORF中引入不同突变。为此，每个基因构建了两个不同的单向导RNA（sgRNA）（补充表S3B），使用补充表S3A所述寡核苷酸和Q5 DNA聚合酶（New England Biolabs）通过重叠延伸PCR制备。片段经琼脂糖凝胶电泳纯化后，利用侧翼BpiI限制性位点通过Golden Gate组装反应连接到载体BB3cH_pGAP_23_pLAT1_Cas9[64,65]中。该载体从LAT1启动子表达hCas9，可在潮霉素存在下筛选（Addgene #104907）。Cas9靶序列的选择使用CHOPCHOP v3网络工具箱[66]。将不同构建体转化K. phaffii X-33菌株，涂布于含潮霉素（200 µg/mL）的YPD琼脂平板。菌落按文献[35]处理，用补充表S3A所列寡核苷酸对相关基因组区域测序以鉴定突变。双突变通过将p907_sgRNA-Pho4(B).1和p907_sgRNA-Pho4(B).2构建体（补充表S3B）转化菌株PJA-004（pho4(A)Δ110*）制备，筛选方法同上。这些菌株的具体基因型及突变对产生蛋白的影响见补充表S4。

为评估PHO89启动子驱动的GFP表达，将文献[32]所述pPHO89-GFP翻译报告构建体用PmeI消化（在AOX1启动子内切割一次），取100 ng DNA转化相应菌株（补充表S4）。转化子在含潮霉素（200 µg/mL）的YPD琼脂平板回收。通过PCR确认质粒正确插入染色体AOX1位点。携带pPHO89-GFP插入的野生型菌株（PJA-037）已有报道[32]。

【数据】sgRNA数量：每基因2个；潮霉素筛选浓度：200 µg/mL；pPHO89-GFP用量：100 ng；PmeI酶切位点：AOX1启动子内单次切割

4.3 RNA制备与转录组分析

为评估K. phaffii对磷饥饿的转录响应，细胞在20 mL合成培养基中生长约40 h，培养基使用Formedium预制混合物（ref. CYN0803，无氨基酸和磷酸盐的酵母氮碱）添加15 mM KCl、2%甘油和7.35 mM KH₂PO₄，调pH至5.8。对于磷饥饿（低Pi）培养，取细胞（10 OD₆₀₀）离心并用不含KH₂PO₄的培养基洗涤两次；对照培养（高Pi）取2.5 OD₆₀₀并用含7.35 mM KH₂PO₄的培养基洗涤两次。所有情况下细胞重悬于50 mL相应培养基，继续生长24 h。随后收集约5 OD₆₀₀培养物，置于冰上，立即在4°C离心（5 min，1000× g）。加入1 mL冷水，转移至预冷的1.5 mL螺帽管中，4°C离心（2 min，1000× g）。最后去除上清，样品在液氮中速冻并储存于−80°C。

总RNA提取按文献[32]方法进行，来自野生型、pho4(A)（菌株PJA-004）、pho4(B)（菌株PJA-021）和pho4(A) pho4(B)（PJA-026）细胞的三次独立培养。RNA浓度和完整性分别通过Qubit检测（ThermoFisher）和Agilent 5400 Fragment Analyzer系统评估。使用poly-T寡核苷酸磁珠从总RNA中纯化mRNA。片段化后，用随机六聚体引物合成第一链cDNA，随后用dTTP合成第二链cDNA。末端修复、A-tailing和接头连接后，片段经大小筛选、PCR扩增和纯化。文库混合后在NovaSeq X Plus（Illumina）上测序，由Novogene Co., Ltd完成。

原始读段（fastq格式）通过fastp[67]转化为清洁读段。平均获得2.4 × 10⁷ ± 3.3 × 10⁶条清洁读段（3.62 ± 0.49 Gb），其中97.2% ± 0.18达到Q30或以上。使用HISAT2（v2.2.1）软件[68]将双端清洁读段比对到K. phaffii GS115参考基因组（assembly GCA_000027005.1），平均比对率为95.02% ± 1.78。差异基因表达分析使用DESeq2版本1.52.0[69]，设定|log2(Fold Change)| ≥ 1且p值≤ 0.01。

基因本体富集分析使用g:Profiler[70]，采用Ensemble Genomes真菌数据库中K. phaffii GS115数据及默认设置。蛋白质互作网络使用STRING数据库v12.0[71]构建，最小互作评分0.5（中高置信度），K-means聚类（聚类数根据蛋白集不同为6至10）。

【数据】初始培养时间：~40 h；培养基体积：20 mL；KCl浓度：15 mM；KH₂PO₄浓度：7.35 mM；pH：5.8；磷饥饿培养OD₆₀₀：10；对照培养OD₆₀₀：2.5；重悬体积：50 mL；继续生长时间：24 h；收集量：~5 OD₆₀₀；离心条件：5 min/1000× g/4°C；速冻储存：液氮/−80°C；清洁读段数：2.4 × 10⁷ ± 3.3 × 10⁶；Q30比例：97.2% ± 0.18；比对率：95.02% ± 1.78；差异表达阈值：|log2FC| ≥ 1，p ≤ 0.01；STRING最小互作评分：0.5

4.4 表型分析

K. phaffii和S. cerevisiae菌株在液体和固体培养基中评估多种表型。液体培养研究中，指数期培养物以OD₆₀₀ = 0.004接种于300 µL相应培养基的Bioscreen蜂窝微孔板（Torrance, CA, USA, #9502550）中，在28°C的Ika-Schuttler MTS-2轨道摇床（900次/min）培养18–24 h。为评估磷限制下的生长能力，使用转录组学部分所述的Formedium预制混合物（ref. CYN0803）。固体培养基表型分析中，培养物稀释至OD₆₀₀ = 0.05，制备5倍梯度稀释液。取3 µL稀释液点样于相应平板，培养指定时间后记录。低Pi平板使用1.5%纯化琼脂（Condalab, Ref. 1806）以确保Pi浓度< 15 µM。

【数据】液体接种OD₆₀₀：0.004；培养体积：300 µL；培养时间：18–24 h；温度：28°C；摇床转速：900次/min；固体点样OD₆₀₀：0.05；稀释倍数：5倍；点样体积：3 µL；纯化琼脂浓度：1.5%；Pi浓度：< 15 µM

4.5 *K. phaffii*中PHO89启动子驱动的GFP表达

为监测对磷饥饿和碱化处理的响应，携带pPHO89-GFP插入的相应菌株在5 mL缺磷培养基（添加15 mM KCl、2%甘油和7.35 mM KH₂PO₄，pH 5.8）中生长至饱和。培养物分成两份2.5 mL等分试样，室温离心（5 min，1000× g）。一份用相同培养基洗涤两次……（后续步骤原文未完整呈现）

【数据】培养基体积：5 mL；KCl浓度：15 mM；KH₂PO₄浓度：7.35 mM；pH：5.8；离心条件：5 min/1000× g/室温

研究结果

2.1 *K. phaffii*中PHO4候选基因的鉴定

以S. cerevisiae Pho4（Uniprot条目P07270）为诱饵对NCBI参考蛋白质组数据库进行BLASTp（版本2.17.0）分析，在K. phaffii GS115蛋白质组中发现两个可能命中（补充表S1）。第一个命中（E值4.0 × 10⁻¹⁰）对应由PAS_chr1-1_0265编码的380个氨基酸假定蛋白，命名为Pho4(A)；第二个（E值3.0 × 10⁻⁷）对应由PAS_chr2-1_0177编码的365个残基假定蛋白，命名为Pho4(B)。然而，相似性仅限于预测的碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）DNA结合结构域（图1B）。事实上，与S. cerevisiae Pho4的整体一致性相当低：Pho4(A)为30.9%，Pho4(B)为28.8%（图1C），且两个K. phaffii蛋白彼此也仅远缘相关（38.1%一致性）。与ScPho4类似，除bHLH样区域外，AlphaFold预测KpPho4(A)为固有无序结构（补充图S1）。KpPho4(B)也是如此，但前42个残基预测有α-螺旋区域。如引言所述，存在两个编码不同Pho4蛋白的基因是一种异常现象，因为通常情况下只发现一个推定的Pho4编码基因（图1D和补充表S1）。然而，仔细检查发现两个蛋白均含有多个推定的Pho85 SP磷酸化位点，以及可能的9氨基酸转录激活结构域（9aaTAD）。这些元件与S. cerevisiae中调控Pho4活性和亚细胞定位的相关元件相似（见图1B和第1节）。这表明尽管两者在初级序列上关系较远，但都可能作为真正的Pho4转录因子发挥功能。因此研究继续对它们进行功能鉴定。

【数据】BLASTp版本：2.17.0；Pho4(A)长度：380 aa；Pho4(B)长度：365 aa；E值：4.0 × 10⁻¹⁰ / 3.0 × 10⁻⁷；Pho4(A) vs ScPho4一致性：30.9%；Pho4(B) vs ScPho4一致性：28.8%；Pho4(A) vs Pho4(B)一致性：38.1%

2.2 单双Pho4突变体的表型分析揭示专业化和冗余功能

在多种真菌中，Pho4功能缺失不仅导致无法转录响应磷饥饿，还增加对多种胁迫的敏感性。因此，研究将缺失Pho4(A)、Pho4(B)或两者均缺失的菌株暴露于一系列胁迫条件并评估表型。如图2A所示，PHO4(A)突变细胞在磷限制下的生长与野生型无异，而pho4(B)突变体在液体和固体培养中均表现出轻微生长缺陷，双突变体中缺陷加重。缺失Pho4(A)或Pho4(B)的细胞对碱性pH（图2B）或高浓度Ca²⁺表现出正常耐受性，而两个转录因子同时缺失导致对高pH耐受性的急剧丧失以及在钙存在下的显著生长缺陷。值得注意的是，pho4(A)细胞（而非pho4(B)突变体）对Mn²⁺阳离子敏感，且该表型在双突变体中加重。单突变和双突变体对NaCl的耐受性均未改变，但双突变体在0.4 M NaCl以上生长缓慢（图2B）。值得注意的是，这些细胞对Li⁺阳离子（Na⁺的毒性类似物）未表现出增加的敏感性，提示高浓度NaCl下的生长缺陷可能源于伴随的渗透压冲击。与该假说一致，pho4(A) pho4(B)细胞在高浓度山梨醇存在下生长不良（图2B）。pho4(A)突变体（而非pho4(B)）对Zn²⁺离子轻度敏感，该效应因PHO4(B)的额外突变而增强。双突变体还无法在37°C生长，而缺失Pho4(A)或Pho4(B)的细胞与野生型生长相似。最后，pho4(A)突变体在阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）存在下与野生型行为一致，而PHO4(B)突变导致敏感性增加，且因PHO4(A)的额外缺失而进一步加剧（图2B）。这些结果的总结见图2C。

综上所述，这些结果表明单个转录因子的缺失仅在特定条件下影响细胞适应性。因此，Pho4(B)的缺失使细胞对SDS敏感，更重要的是对磷剥夺敏感，提示Pho4(B)是K. phaffii响应磷饥饿的主要组分。同时，Pho4(A)的缺失使细胞对Mn²⁺和Zn²⁺阳离子敏感。相比之下，两个转录因子同时缺失在标准培养条件下无显著影响，但在几乎所有测试的胁迫条件下都导致显著生长缺陷。这表明两个蛋白的功能可能部分冗余，共同协调胁迫抵抗的关键机制。值得注意的是，每个基因都测试了两种不同突变，行为几乎完全相同。这表明观察到的表型源于编码TF的缺失而非非靶标脱靶突变。

【数据】磷限制生长：pho4(B)轻微缺陷，双突变加重；碱性pH耐受：双突变丧失耐受；Ca²⁺敏感：双突变生长缺陷；Mn²⁺敏感：pho4(A)敏感，双突变加重；NaCl耐受：双突变在>0.4 M NaCl生长缓慢；Li⁺耐受：无变化；山梨醇：双突变生长不良；Zn²⁺敏感：pho4(A)轻度敏感，双突变增强；37°C：双突变无法生长；SDS敏感：pho4(B)敏感，双突变加剧

2.3 Pho4(A)和Pho4(B)在磷饥饿转录响应中的作用

通过RNA-Seq检测两个K. phaffii Pho4候选基因对基因转录的影响（补充表S2）。首先考虑在磷酸盐充足（高Pi）条件下突变可能的影响，设定|log2 Fold Change| ≥ 1且p值≤ 0.01为阈值。如补充图S2所示，Pho4(A)缺失几乎无影响，仅一个基因中度诱导（PAS_chr4_0080，编码一个在其他真菌中有远缘同源物的未表征蛋白）。PHO4(B)突变导致10个基因诱导、无基因抑制。诱导基因集高度富集编码功能相关的ATP依赖性蛋白折叠伴侣，包括Hsp60、Hsp82、Hsp78、Hsp104、Ssa1、Fes1（Ssa1核苷酸交换因子）和Ssa3（补充图S2）。这些基因均未出现在双pho4(A) pho4(B)突变体的6个诱导基因中，后者包括两个氨基酸通透酶：PAS_chr1_4_0479（TAT2）和PAS_chr4_0287（DIP5-1）。双突变体中有10个基因中度抑制（2至3倍），包括PAS_chr4_0337（编码推定高亲和力磷酸盐转运蛋白Pho84-1）。

野生型细胞无磷酸盐生长24 h导致广泛的转录响应，803个差异表达基因（DEG），其中444个诱导、359个抑制（与含Pi条件相比）（图3A）。这些数值与pho4(A)突变体相似（413个基因诱导、383个抑制），但pho4(B)和双突变体略低，主要由于抑制基因数量较少（图3A）。磷饥饿后变化的成对比较（图3B）证实PHO4(A)突变在无Pi条件下对转录组谱几乎无影响。相反，Pho4(B)缺失有显著影响，且因PHO4(A)的额外突变而放大。

磷饥饿诱导基因的基因本体分析（图3C）表明膜转运和液泡相关基因被诱导，而这种诱导因两个Pho4蛋白的缺失而大部分消除。实例包括PHO84-1或ENA2转运蛋白，以及VCX1、VPH1、VMA10或VBA1等液泡相关基因。磷饥饿导致核糖体生物发生和翻译相关基因的剧烈抑制，该效应不受所测试突变的影响（图3C和补充表S2）。参与多种氨基酸生物合成途径的基因也显著抑制。然而，该效应因PHO4(B)突变而减弱，并在双突变体中进一步降低，但参与硫同化的几个基因除外……

【数据】高Pi条件下pho4(A)突变DEG：1个诱导；pho4(B)突变DEG：10个诱导、0个抑制；双突变DEG：6个诱导、10个抑制（2–3倍）；磷饥饿野生型DEG总数：803（444诱导/359抑制）；pho4(A)突变DEG：413诱导/383抑制；差异表达阈值：|log2FC| ≥ 1，p ≤ 0.01

讨论与解读

本研究证实K. phaffii含有两个功能性的Pho4转录因子基因，这在真菌中是罕见的。Pho4(B)是磷饥饿转录响应的主要调控者，而Pho4(A)在碱性pH胁迫下对PHO89诱导有贡献。两个蛋白功能部分重叠，共同缺失导致对多种胁迫（磷饥饿、碱性pH、高温、SDS、金属离子）的敏感性显著增加。在S. cerevisiae中异源表达两个基因均能回补pho4突变，证明它们确实是功能性Pho4同源蛋白。

编译者解读：该研究对工业底盘菌K. phaffii的胁迫适应机制提供了重要见解。从合成生物学应用角度看，双Pho4系统的发现意味着该菌株的磷代谢调控比预期复杂——改造磷利用效率或增强碱耐受时需同时考虑两个转录因子。值得注意的是，Pho4(A)和Pho4(B)对不同刺激（磷饥饿vs高pH）的分工响应为设计正交调控线路提供了天然元件。然而，两个蛋白在序列一致性上仅约30%，其下游靶基因的具体分工边界及磷酸化调控细节仍有待解析，这限制了精准工程改造的可行性。

参考来源

Albacar M, González A, Wang R, Casamayor A, Ariño J. Komagataella phaffii Encodes Two Functional Pho4 Transcription Factors. Int J Mol Sci. PMID: 42589218.

PMID: 42589218