来源：Characterization of three glycerol transporters with broad sugar specificities from Aspergillus niger.（Appl Microbiol Biotechnol）| 编译：DNA Lab Space
导读
黑曲霉是工业生物技术中的重要模式菌株，能够利用己糖、戊糖和多元醇等多种糖类化合物，但其绝大多数糖转运蛋白尚未被功能鉴定。本研究针对黑曲霉中三个预测的甘油转运蛋白GlpA、GlpB和GlpC，综合运用基因缺失突变、异源表达和生长表型分析等手段，揭示了它们在甘油摄取中的不同分工——GlpA是主要甘油转运蛋白，GlpB起辅助作用，而GlpC虽间接影响甘油摄取，却意外地展现出从多元醇到己糖的广泛底物特异性。这些发现为真菌糖转运蛋白的生理功能解析和菌株工程改造提供了重要候选靶点。
研究背景
黑曲霉（Aspergillus niger）作为工业微生物，长期用于有机酸（尤其是柠檬酸）和多种酶制剂的生产。该物种具有"泛食性"生活方式，可通过多样的糖代谢途径利用己糖、戊糖和多元醇等广泛糖类底物，这种代谢可塑性使其在循环生物经济中具有重要应用潜力。甘油是磷脂和甘油三酯的骨架分子，天然存在于所有脂肪和油脂中，同时作为碳源、维持氧化还原平衡并保护细胞免受渗透胁迫。工业上，甘油被用作低热量甜味剂、化妆品保湿剂和药物制剂添加剂，而生物柴油产业产生的大量粗甘油则为微生物转化提供了丰富且廉价的原料。然而，黑曲霉中绝大多数预测的糖转运蛋白仍缺乏实验表征，限制了基于菌株工程改造的甘油高值化利用策略的开发。
研究方法
候选甘油转运蛋白的鉴定与生物信息学分析
从JGI MycoCosm门户网站（https://mycocosm.jgi.doe.gov/Aspni_NRRL3_1.home.html）获取黑曲霉三个预测甘油转运蛋白的氨基酸序列，即NRRL3_00235（GlpA）、NRRL3_00817（GlpB）和NRRL3_00935（GlpC）。通过文献检索收集已实验表征的真菌甘油转运蛋白，其氨基酸序列从NCBI或UniProt数据库获得。使用AlphaFold3预测黑曲霉Glp和酿酒酵母Stl1转运蛋白的蛋白质结构，并在PyMOL中可视化。利用DeepTMHMM 1.0鉴定黑曲霉Glp转运蛋白的跨膜结构域，并使用TMRPres2D进行可视化。多序列比对使用MAFFT完成，结果用Jalview可视化。
【数据】数据库：JGI MycoCosm、NCBI、UniProt；软件：AlphaFold3、DeepTMHMM 1.0、TMRPres2D、MAFFT、Jalview、PyMOL
菌株、培养基与培养条件
用于质粒扩增的大肠杆菌DH5α在含100 mg L⁻¹氨苄青霉素的Luria–Bertani（LB）培养基中、37°C下培养。黑曲霉菌株在30°C下培养于极限培养基（MM）或完全培养基（CM；MM添加2 g L⁻¹胰蛋白胨、1 g L⁻¹酵母提取物、1 g L⁻¹酪蛋白氨基酸）中，补充1.22 g L⁻¹尿苷和相应糖作为碳源。固体培养时培养基额外添加1.5%（w/v）琼脂。本研究所用菌株见表1。
酿酒酵母IMK1010菌株用于黑曲霉甘油转运蛋白的功能表征。酿酒酵母在合成培养基（SM）中培养，补充过滤灭菌（0.45 μm，VWR®）的维生素溶液（Verduyn et al. 1992），30°C培养。培养基含适量糖或2%（v/v）乙醇作为碳源，并补充150 mg L⁻¹尿嘧啶以满足营养缺陷型需求。所有培养基在121°C灭菌20分钟。
【数据】大肠杆菌培养温度：37°C；黑曲霉培养温度：30°C；氨苄青霉素浓度：100 mg L⁻¹；尿苷浓度：1.22 g L⁻¹；琼脂浓度：1.5%（w/v）；乙醇浓度：2%（v/v）；尿嘧啶浓度：150 mg L⁻¹；灭菌条件：121°C、20 min
黑曲霉突变株的构建、原生质体转化与纯化
黑曲霉缺失突变株通过CRISPR/Cas9基因组编辑系统生成。使用Geneious Prime 2025.1.2软件设计引导RNA（gRNA）序列，靶向glpA、glpB和glpC基因位点，gRNA从相应质粒中表达。
构建修复模板时，使用基因特异性引物通过巢式PCR从黑曲霉基因组DNA中扩增靶基因的上游和下游侧翼区域。PCR扩增使用Phusion™高保真DNA聚合酶，按制造商说明书操作。上游反向引物和下游正向引物设计包含条形码序列[actgctaggattcgctatcg]，该序列作为巢式PCR中DNA片段融合的同源区域，产生线性修复模板。所得修复模板使用NucleoSpin® Gel和PCR Clean-up试剂盒纯化。本研究所用引物和质粒分别列于补充表S1和S2。
原生质体制备和转化遵循已发表的方案。以尿苷营养缺陷型且非同源末端连接缺陷的黑曲霉菌株N593 Δku70为亲本菌株。转化使用1 μg ANEp8-Cas9-pyrG-gRNA质粒DNA与5 μg纯化修复模板组合进行。纯化时，每个突变体从补充2%（w/v）D-果糖的MM平板上选取10个菌落，划线纯化三次。营养缺陷型菌株在补充尿苷的培养基中培养，使用5-氟乳清酸进行反选择以去除携带pyrG标记基因的自复制质粒。纯化转化子中的缺失突变体通过菌落PCR使用Phire DNA聚合酶确认。
【数据】转化DNA用量：1 μg质粒+5 μg修复模板；筛选碳源：2%（w/v）D-果糖；反选择试剂：5-氟乳清酸；纯化菌落数：10个/突变体
黑曲霉突变株的生长表型分析
黑曲霉孢子从固体CM培养基收获至ACES缓冲液（10 mM N-（2-乙酰氨基）-2-氨基乙磺酸，0.02% Tween 80，pH 6.8）中，用血球计数板计数。取2 μl浓度为5 × 10⁵ ml⁻¹的孢子悬液，以重复两份的方式接种于MM琼脂平板上，分别以25 mM D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、蔗糖、麦芽糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、甘油、D-甘露醇、D-山梨醇、L-阿拉伯醇、D-木糖醇、核糖醇、D-半乳糖醇或肌醇作为碳源。不添加碳源的MM琼脂作为对照。生物学重复培养物在30°C培养7天，通过目视检查评估生长情况。
【数据】孢子接种量：2 μl（5 × 10⁵ ml⁻¹）；碳源浓度：25 mM；培养温度：30°C；培养时间：7天；缓冲液：10 mM ACES、0.02% Tween 80、pH 6.8
表达黑曲霉glpA、glpB或glpC基因的酿酒酵母菌株构建
合成的glpA、glpB和glpC基因（带有与含GFP的pUDE453质粒兼容的重叠序列）在pTwist质粒中购买，经扩增后使用Gibson Assembly®克隆试剂盒克隆至pUDE453质粒。组装前，质粒骨架——
（原文此处截断，后续步骤原文未详述）
【数据】克隆方法：Gibson Assembly®；载体：pUDE453（含GFP）；合成基因：glpA、glpB、glpC
研究结果
黑曲霉含有90个预测糖转运蛋白，分为十个进化分支
根据各分支中已实验表征的糖转运蛋白推断底物特异性，黑曲霉含有90个预测的糖转运蛋白，分为十个进化分支（Xu et al. 2024）。从包含甘油、L-阿拉伯醇和戊糖转运蛋白的分支中，选取了三个候选基因NRRL3_00235、NRRL3_00817和NRRL3_00935（以下分别称为GlpA、GlpB和GlpC）进行深入研究。这三个糖转运蛋白在系统发育上彼此紧密相关，且与已表征的酵母甘油转运蛋白——酿酒酵母Stl1p和汉逊德巴利酵母DhStl1——亲缘关系密切，使其成为研究黑曲霉甘油摄取的有力候选。
【数据】预测糖转运蛋白总数：90个；进化分支数：10个；候选基因：NRRL3_00235（GlpA）、NRRL3_00817（GlpB）、NRRL3_00935（GlpC）
glpA和glpB联合缺失完全消除黑曲霉在甘油上的生长
为研究glpA、glpB和glpC在黑曲霉中的生理功能，构建了单基因和双基因缺失突变株。其中ΔglpA菌株在甘油上的生长较参考菌株明显减弱（图1），证明GlpA在测试条件下促进甘油摄取。相比之下，ΔglpB和ΔglpC缺失突变株在甘油上未检测到生长缺陷。进一步构建了glpA与glpB或glpC的双基因缺失突变株以评估其对黑曲霉表型的影响。结果显示，双突变株ΔglpAΔglpB在甘油上的生长完全消失（图1），表明GlpA可能具有部分掩盖GlpB甘油摄取能力的补偿作用，这解释了ΔglpB单突变株缺乏生长表型的原因。然而，双突变株ΔglpAΔglpC的表型与ΔglpA相比无可见差异，提示GlpC在测试条件下可能不参与甘油摄取。所有缺失菌株在其他测试多元醇、己糖或戊糖上的生长与参考菌株相比均无表型变化。
【数据】碳源浓度：25 mM；培养温度：30°C；培养时间：7天；表型：ΔglpA生长减弱、ΔglpAΔglpB生长完全消失
双缺失突变株ΔglpAΔglpB和ΔglpAΔglpC在液体培养中丧失甘油摄取能力
基于预测的糖特异性和glp缺失突变株在固体甘油培养基上的表型，评估了glp基因单缺失和双缺失对黑曲霉液体培养中多元醇摄取的影响。通过HPAEC-PAD测定培养上清液中多元醇浓度随时间的变化，比较ΔglpA、ΔglpB、ΔglpC、ΔglpAΔglpB和ΔglpAΔglpC突变株对甘油、D-甘露醇、D-山梨醇、L-阿拉伯醇和D-木糖醇的消耗情况。如图2所示，ΔglpA突变株在28小时内仅消耗6.6 ± 1.94 mM甘油，而参考菌株在同一时间内消耗了大部分甘油。120小时后，ΔglpA培养上清液中仍检测到15 ± 0.68 mM甘油。这些发现强烈表明GlpA在黑曲霉甘油转运中发挥关键作用。
【数据】甘油初始浓度：25 mM；ΔglpA 28h消耗量：6.6 ± 1.94 mM；ΔglpA 120h残留量：15 ± 0.68 mM；检测方法：HPAEC-PAD；统计方法：非配对双尾Welch's t检验
液体培养中，ΔglpB菌株在28小时时甘油消耗速度略慢于参考菌株（P = 0.009；图2）。这支持了GlpB在黑曲霉甘油摄取中的生理作用，与ΔglpAΔglpB双缺失突变株的表型一致（图1）。在测试条件下，ΔglpC与参考菌株之间未观察到甘油摄取差异。
【数据】ΔglpB 28h统计显著性：P = 0.009；ΔglpC：与参考菌株无差异
如预期所示，ΔglpAΔglpB突变株不消耗甘油，120小时后液体培养基中检测到约30 ± 0.27 mM甘油（图2）。值得注意的是，ΔglpAΔglpC双突变株在液体培养中也无法消耗甘油，120小时后培养基中残留26 ± 1.08 mM甘油（图2）。这些发现进一步支持GlpB参与甘油摄取，并提示GlpC可能通过间接方式促进甘油摄取——可能在GlpA缺失时通过调控效应发挥作用。双缺失菌株培养基中甘油量的增加很可能是由于培养过程中蒸发浓缩所致。液体与固体表型之间的差异很可能源于黑曲霉在固体和液体培养中生长模式的差异。
【数据】ΔglpAΔglpB 120h残留量：30 ± 0.27 mM；ΔglpAΔglpC 120h残留量：26 ± 1.08 mM
在液体培养中，缺失突变株与参考菌株之间在D-甘露醇、D-山梨醇、L-阿拉伯醇或D-木糖醇摄取方面未观察到一致的差异。尽管ΔglpA表现出D-木糖醇摄取减少，ΔglpB和ΔglpC表现出D-甘露醇摄取增加（补充图S1），但这些观察结果不可重复，可能受实验期间菌丝聚集差异的影响。
【数据】D-甘露醇、D-山梨醇、L-阿拉伯醇、D-木糖醇摄取：无一致差异（原文未详述具体数值）
在酿酒酵母中表达glpA、glpB或glpC使酵母能够在多元醇和己糖上生长
为研究黑曲霉GlpA、GlpB和GlpC转运蛋白的体外功能，将相应基因异源表达于酿酒酵母IMK1010菌株中——该菌株缺失所有内源糖转运蛋白和二糖水解酶。对表达转运蛋白-GFP融合蛋白的酿酒酵母菌株进行荧光显微镜观察，结果显示三种转运蛋白均在酵母细胞周围产生绿色光环（图3），确认了它们在质膜上的正确定位。表达空载体的阴性对照菌株在质膜处未显示明显荧光。
【数据】定位验证：GFP融合蛋白；阴性对照：空pUDE453载体；观察方法：荧光显微镜
功能表征方面，评估了产生黑曲霉GlpA、GlpB或GlpC的酿酒酵母IMK1010菌株在含有不同多元醇或己糖作为碳源的固体和液体培养基上的生长情况。在固体培养基上，所有表达glp的酿酒酵母IMK1010菌株在1%甘油、D-甘露醇、D-山梨醇和D-木糖醇上均表现出至少轻微的生长，而阴性对照在六天培养后无生长（图4a）。这表明所有三种黑曲霉Glp蛋白（包括GlpC）均具有将这些多元醇转运进入酵母细胞的功能能力，恢复了糖转运蛋白缺陷的IMK1010菌株的生长。尽管ΔglpC菌株在生理表征中未对测试多元醇表现出任何表型或摄取减少（图1和图2），但令人惊讶的是，表达glpC的酵母菌株能够在多元醇上生长。此外，该菌株还能在8% D-果糖、8% D-葡萄糖和2% D-甘露糖上生长（图4b），表明GlpC的底物特异性范围从多元醇扩展至己糖。仅表达glpC的酿酒酵母菌株能在——
（原文此处截断）
【数据】固体培养基碳源浓度：1%多元醇、0.2%/2%/8%己糖；培养时间：6天；GlpC额外底物：8% D-果糖、8% D-葡萄糖、2% D-甘露糖
【数据】液体培养碳源：不同浓度D-果糖；阴性对照：空pUDE453载体（EV）；阳性对照：内源Hxt5
【数据】结构预测方法：DeepTMHMM（跨膜拓扑）、AlphaFold3（三维结构叠加）；可视化软件：TmrPres2D、PyMOL
【数据】比对方法：MAFFT v7；可视化工具：Jalview v2；参考结构：大肠杆菌XylE晶体结构；糖结合残基来源：XylE晶体结构、Stl1p分子对接预测
讨论与解读
本研究对黑曲霉中三个预测的甘油转运蛋白GlpA、GlpB和GlpC进行了生理和功能表征。glpA单基因缺失导致甘油生长减弱和摄取显著降低，而glpA和glpB双基因缺失完全消除了甘油的生长和摄取。此外，glpB单基因缺失在液体培养中导致甘油摄取出现统计学显著下降。综合这些发现，GlpA主要负责黑曲霉的甘油转运，GlpB的贡献程度较小。
glpB单独缺失不影响黑曲霉在固体培养基上的表型，表明GlpA很可能补偿了GlpB的缺失，两种糖转运蛋白在测试条件下功能冗余。类似发现在解脂耶氏酵母中也有报道——多个底物特异性重叠的糖转运蛋白掩盖了单个转运蛋白基因缺失的生理影响。ΔglpC菌株的生长和甘油消耗效率与参考菌株相同，表明在GlpA存在时GlpC并非黑曲霉甘油摄取所必需。双突变株ΔglpAΔglpC的表型与ΔglpA相似。
编译者解读
本研究的方法学设计值得称道：将黑曲霉内的基因缺失生理分析与酿酒酵母异源表达功能验证相结合，两种策略互为补充——前者揭示转运蛋白在天然宿主中的真实生理分工，后者则排除内源背景干扰、精准测定底物谱。GlpC在生理表征中"沉默"却在异源系统中展现出从多元醇到己糖的广谱转运能力，这一反差凸显了单一方法可能带来的认知盲区。从合成生物学应用角度看，GlpC这类广谱转运蛋白是菌株工程改造中极具价值的元件——可用于构建以粗甘油为底物的细胞工厂，实现废弃物向高附加值化学品的高效转化。未来研究若能解析GlpC的底物识别机制并优化其在工业宿主中的表达水平，将有力推动甘油基生物炼制的发展。
参考来源
Nummela L, Lyra C, Pitkänen L, Maina HN, Mäkelä MR. Characterization of three glycerol transporters with broad sugar specificities from Aspergillus niger. Appl Microbiol Biotechnol. PMID: 42104138.
PMID: 42104138