来源：Acetate as alternative carbon source for production of mono- and di-rhamnolipids in Pseudomonas putida KT2440.（Microb Cell Fact）| 编译：DNA Lab Space
导读
鼠李糖脂是重要的生物表面活性剂，传统生产依赖葡萄糖等糖类碳源。本研究以恶臭假单胞菌KT2440为底盘，系统比较了醋酸与葡萄糖作为碳源时鼠李糖脂产量、组成及蛋白质组差异，并探索了甲酸盐、乙醇等模拟电解产物的共喂养策略。研究发现醋酸虽略降低生长速率与产量，但双鼠李糖脂比例保持约75 mol%，且碳氮消耗比恒定（C/N≈15）。蛋白质组分析揭示了ATP非依赖性乙酰辅酶A循环与乙醛酸支路-甘油代谢偶联的节能策略。该研究为利用废弃碳源可持续生产鼠李糖脂提供了新视角。
研究背景
恶臭假单胞菌KT2440通过表达外源rhlABC基因，可安全地生产单鼠李糖脂与双鼠李糖脂。葡萄糖虽是常用碳源，但来自废物流或电解过程的醋酸等可持续替代碳源正受到关注。这两种碳源通过不同入口进入核心碳代谢——葡萄糖直接进入鼠李糖途径，醋酸进入脂肪酸合成途径——其对蛋白质组和鼠李糖脂同系物组成的影响尚不清楚。本研究使用P. putida JAG1菌株，比较其在葡萄糖和醋酸上的生长过程中鼠李糖脂产量与组成的变化，同时评估甲酸盐作为不可同化电子供体的影响，以及模拟电化学CO₂基碳混合物的应用潜力。
研究方法
菌株构建
为获得无质粒的高生物合成能力鼠李糖脂生产菌株，两个异源操纵子被逐步整合到P. putida KT2440 Δupp中。首先，通过将来自铜绿假单胞菌PAO1的双顺反子rhlAB操纵子置于rpsM启动子控制下，整合到PP_0867与PP_0868之间的基因间隔区，构建了单鼠李糖脂生产菌株P. putida RAC10（Δupp, PrpsM::rhlAB）。该构建中，rpsM启动子以及yehX和PP_0867同源区从P. putida KT2440基因组DNA扩增，而rhlA和rhlB从P. aeruginosa PAO1基因组DNA扩增。所有片段组装到pJOE6261.2中，所得质粒pCRA32通过upp反选择系统用于无标记染色体整合。pCRA32的全序列见补充材料（Additional file 1）。
第二次整合以P. putida RAC10为前体菌株，通过mini-Tn7递送转座载体pTn7-M在attTn7位点进行两个独立的染色体整合。一种方案整合rhlCAB操纵子，生成菌株JAG1；第二种方案整合rhlAB操纵子，生成菌株JAG2，两者均受合成型组成型启动子SynPro8控制。构建rhlCAB递送质粒时，rhlC从铜绿假单胞菌基因组DNA扩增，通过Gibson Assembly插入pJG-rhlAB，得到质粒pJG-rhlCAB。随后，SynPro8oT-rhlCAB和SynPro8oT-rhlAB操纵子分别从pJG-rhlCAB和pJG-rhlAB扩增，组装到pTn7-M骨架上，得到pTn7-rhlCAB和pTn7-rhlAB。这些质粒通过四亲本杂交导入P. putida RAC10，分别生成菌株JAG1和JAG2。JAG1和JAG2均在染色体上整合了2拷贝rhlAB，而JAG1额外整合了1拷贝rhlC。所有整合通过Sanger测序验证。所有构建的菌株、质粒及用于构建和验证的引物列于补充表S1和S2（见Additional file 1）。
【数据】菌株：P. putida KT2440 Δupp、RAC10、JAG1、JAG2；启动子：rpsM、SynPro8；整合位点：PP_0867-PP_0868间隔区、attTn7；rhlAB拷贝数：2；rhlC拷贝数：JAG1含1
培养基、取样与培养条件
除非另有说明，本研究使用的所有化学品购自Carl Roth GmbH。所有培养物在30°C、120转/分钟（rpm）的轨道摇床（New Brunswick™ Innova® 44R，Eppendorf AG，Hamburg，Germany）中培养，摇动直径为5 cm。M9预培养和实验培养使用250 mL带挡板摇瓶，初始工作体积为25 mL。
LB培养基（Lysogeny Broth）含5 g/L NaCl、10 g/L胰蛋白胨和5 g/L酵母提取物。M9培养基含7.51 g/L Na₂HPO₄×2H₂O、3 g/L KH₂PO₄、0.25 g/L NaCl、1 g/L (NH₄)₂SO₄、1 g/L MgSO₄×7H₂O，pH 7.0，微量元素终浓度如下：6×10⁻³ g/L FeSO₄×7H₂O、3.2×10⁻³ g/L ZnSO₄×7H₂O、3.3×10⁻⁴ g/L CuSO₄×5H₂O、3.7×10⁻⁴ CoSO₄×7H₂O、8×10⁻⁵ g/L H₃BO₃、1.16×10⁻³ g/L MnSO₄×H₂O、2.7×10⁻³ g/L CaCO₃。葡萄糖、醋酸钠、甲酸钠和乙醇按各实验要求添加。醋酸钠和甲酸钠用于提供醋酸或甲酸盐。为简便起见，浓度均以盐的阴离子计。
除非另有说明，细胞上清液通过4°C、4700×g离心15分钟收获，储存于-20°C。
【数据】LB培养基：5 g/L NaCl、10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物；M9培养基：7.51 g/L Na₂HPO₄×2H₂O、3 g/L KH₂PO₄、0.25 g/L NaCl、1 g/L (NH₄)₂SO₄、1 g/L MgSO₄×7H₂O、pH 7.0；培养条件：30°C、120 rpm、摇动直径5 cm；离心：4°C、4700×g、15 min
LB预培养
LB预培养时，取20 µL冷冻保存的P. putida JAG1接种到100 mL带挡板摇瓶中的10 mL LB培养基（含5 g/L NaCl、10 g/L胰蛋白胨和5 g/L酵母提取物），培养24小时。
【数据】接种量：20 µL冷冻菌液；培养基体积：10 mL LB；培养时间：24h；温度：30°C
M9预培养
为防止实验培养出现迟滞期，取250 µL LB预培养物接种到250 mL带挡板摇瓶中的25 mL M9培养基（含5 g/L醋酸或葡萄糖），培养24小时后用于接种实验培养物。
【数据】接种量：250 µL LB预培养物；培养基：25 mL M9 + 5 g/L醋酸或葡萄糖；培养时间：24h
醋酸与葡萄糖作为唯一碳源的比较
用M9预培养物接种含3、5或7 g/L葡萄糖或醋酸钠的M9培养基，目标初始OD₆₀₀为0.2。定期取样测定OD₆₀₀。生长阶段结束时，收获培养上清液并储存供后续分析。该实验中，3 g/L、5 g/L和7 g/L初始碳源浓度的重复数分别为ni=3、nj=6和nk=3。
【数据】碳源浓度：3、5、7 g/L葡萄糖或醋酸钠；初始OD₆₀₀：0.2；重复数：ni=3、nj=6、nk=3
醋酸与甲酸盐共喂养实验
用M9预培养物接种含5 g/L醋酸（含或不含0.9 g/L甲酸盐）的M9培养基，目标OD₆₀₀为0.2。定期取样，收获培养上清液并储存供后续分析。所有培养均设三次重复。
【数据】醋酸：5 g/L；甲酸盐：0.9 g/L；初始OD₆₀₀：0.2；重复数：3
碳化合物补充实验
用M9预培养物接种含可溶性碳化合物混合物的M9培养基（成分源自文献[16]）。一个实验中，醋酸、乙醇和甲酸盐各1 g/L。另一个实验中，使用1.6 g/L醋酸、1.0 g/L乙醇和0.25 g/L甲酸盐的组成。两个实验的目标初始OD₆₀₀均为0.1。定期取样，收获培养上清液并储存供后续分析。所有培养均设三次重复。
【数据】实验1：醋酸1 g/L、乙醇1 g/L、甲酸盐1 g/L；实验2：醋酸1.6 g/L、乙醇1.0 g/L、甲酸盐0.25 g/L；初始OD₆₀₀：0.1；重复数：3
蛋白质组学细胞取样
预培养准备时，250 mL带挡板摇瓶中的25 mL LB培养基接种100 µL P. putida JAG1冷冻保存液，于30°C、120 rpm培养24小时。随后取出10 mL预培养物，平均分至两个15 mL离心管中，每种碳源条件一管。为去除残留复合培养基成分，细胞在4°C、4700×g离心6分钟收获，每个沉淀重悬于10 mL含3 g/L醋酸或葡萄糖的M9培养基中。
重悬后，各取1 mL细胞悬液接种至五个100 mL摇瓶（含10 mL M9培养基，补充相应碳源，初始浓度3 g/L），初始OD₆₀₀为0.25。培养物在30°C、120 rpm培养至生长中期。当含葡萄糖样品达到OD₆₀₀为1.4、含醋酸培养物达到OD₆₀₀为1.2时取样（约代表这些条件下可达最大生物量浓度的一半）。蛋白质组分析时，整个培养物在4°C、4700×g离心7分钟，弃上清，细胞沉淀立即冷冻于-80°C。每种碳源条件制备五个生物学重复。
【数据】预培养：25 mL LB、100 µL冷冻菌液、24h、30°C、120 rpm；洗涤：10 mL M9（3 g/L醋酸或葡萄糖）、4°C、4700×g、6 min；接种：1 mL至10 mL M9、初始OD₆₀₀ 0.25；取样OD₆₀₀：葡萄糖1.4、醋酸1.2；离心：4°C、4700×g、7 min；生物学重复：5
LC-MS/MS蛋白质组学样品制备
#### 比较蛋白质组分析的蛋白质提取
细胞沉淀解冻后悬浮于含2% SDS（十二烷基硫酸钠）、20 mM DTT（二硫苏糖醇）和150 mM Tris-HCl pH 8.5的裂解缓冲液中，95°C孵育10分钟。细胞裂解液在20,000×g、25°C离心5分钟澄清。澄清裂解液中的蛋白质通过氯仿-甲醇沉淀法沉淀。蛋白质沉淀重悬于含6 M尿素的50 mM Tris-HCl pH 8.5中，蛋白质浓度通过Bradford测定法（Roti-Quant，Roth）确定。取10 µg提取蛋白质进行溶液内酶解。加入DTT至终浓度10 mM，在Eppendorf Thermomixer中56°C孵育30分钟。还原的半胱氨酸随后用40 mM CAA（氯乙酰胺）在室温（RT）避光烷基化30分钟。加入50 mM DTT终止烷基化，样品再在室温孵育10分钟。裂解液用50 mM Tris-HCl pH 8.5稀释至最终浓度……（原文此处截断）
【数据】裂解缓冲液：2% SDS、20 mM DTT、150 mM Tris-HCl pH 8.5；孵育：95°C、10 min；离心：20,000×g、25°C、5 min；蛋白质沉淀：氯仿-甲醇法；重悬：6 M尿素/50 mM Tris-HCl pH 8.5；酶解量：10 µg；还原：10 mM DTT、56°C、30 min；烷基化：40 mM CAA、RT、30 min、避光；终止：50 mM DTT、RT、10 min
研究结果
鼠李糖脂前体合成涉及鼠李糖途径和从头脂肪酸合成。葡萄糖直接进入鼠李糖途径，而醋酸进入脂肪酸合成途径，但两种碳源产生的双鼠李糖脂比例相似，约为75 mol%。尽管碳源显著影响蛋白质组谱，但碳氮消耗比保持恒定（C/N≈15）。
比较两种碳源下P. putida JAG1的蛋白质组差异，提示ATP非依赖性乙酰辅酶A循环是一种节能策略。酶丰度还提示乙醛酸支路与甘油代谢的偶联是糖异生的策略。与葡萄糖相比，醋酸上的生长速率以及生物量和产物产量略低。
醋酸与甲酸盐共喂养相对于单独使用醋酸未引起显著变化。醋酸、甲酸盐和乙醇的同时消耗仅轻微影响单位生物量产物产量，但强烈地将组成转向单鼠李糖脂。此外，双鼠李糖脂生产菌株与单鼠李糖脂生产菌株的比较表明，双鼠李糖脂的形成与更高的摩尔产物产量相关。
【数据】双鼠李糖脂比例：约75 mol%；碳氮消耗比：C/N≈15；生长速率：醋酸低于葡萄糖；生物量产量：醋酸低于葡萄糖；产物产量：醋酸低于葡萄糖；共喂养甲酸盐：无显著变化；三碳源共喂养：组成转向单鼠李糖脂；双鼠李糖脂菌株摩尔产物产量：高于单鼠李糖脂菌株
讨论与解读
讨论
醋酸是一种可行的鼠李糖脂生产替代碳源，与葡萄糖相比仅有轻微不足。微生物细胞工厂P. putida JAG1在单一可同化碳源存在下的代谢呈现稳态特征，不影响鼠李糖脂同系物组成。然而，第二种可同化碳源的可用性使组成向单鼠李糖脂方向偏移。每碳原子的摩尔产物产量在双鼠李糖脂生产中高于单独生产单鼠李糖脂，这凸显了双鼠李糖脂作为未来研究有前景的目标产物。
编译者解读
本研究为鼠李糖脂的可持续生产提供了系统的碳源替代方案评估。方法上，蛋白质组学与生理数据相结合，揭示了醋酸代谢中ATP非依赖性乙酰辅酶A循环这一节能策略，为理解碳源切换的代谢适应提供了分子层面的解释。值得肯定的是，研究采用无质粒的染色体整合策略构建生产菌株，增强了工业应用的遗传稳定性。双鼠李糖脂更高的摩尔产物产量提示其可作为后续代谢工程改造的靶点。局限在于醋酸条件下的生长速率与产量仍低于葡萄糖，如何通过代谢工程弥补这一差距，将是该技术走向应用的关键。模拟电解产物的共喂养实验也为电化学-生物法耦合生产生物表面活性剂提供了初步依据。
参考来源
期刊：Microb Cell Fact；PMID: 42393666
PMID: 42393666