来源：Overexpression of β-carboxysomes increases photosynthesis and growth in Synechocystis sp. PCC 6803.（Plant Physiol）| 编译：DNA Lab Space
导读
蓝藻作为光合自养细胞工厂，可将CO₂转化为高价值化学品，但Rubisco的低效催化成为光合固碳的限速步骤。羧酶体是蓝藻特有的蛋白质细胞器，负责浓缩CO₂并提升Rubisco催化效率。本研究在集胞藻PCC 6803中通过过表达内源β-羧酶体全套或部分组分，系统考察了羧酶体蛋白过表达对蛋白质化学计量、细胞器形态与丰度、光合活性及细胞生长的影响，为工程化改造蓝藻底盘细胞提供了新框架。
研究背景
全球能源需求持续攀升，化石燃料的过度依赖导致CO₂等温室气体大量排放，环境危机日益严峻。蓝藻作为藻类和植物叶绿体的进化祖先，在碳封存与生物资源生产方面具有独特优势。然而，与异养微生物相比，蓝藻的平均产量往往偏低——生长较慢和生物量积累不足是制约其商业化应用的主要瓶颈。
光合作用是驱动能量转换、支撑全球碳循环的核心生物学过程。当前公认的三大光合效率提升策略包括：改善光捕获效率、增强光合电子传递、优化CO₂固定酶Rubisco及其相关酶系。Rubisco存在严重的催化低效与竞争性加氧问题，是光合作用中的限速步骤。为抑制加氧反应并增强羧化效率，蓝藻、藻类、C₄植物和CAM植物等光合生物各自演化出了不同的CO₂浓缩机制。其中，羧酶体作为蓝藻CO₂浓缩机制的核心组件，由数千个亚基构成——六聚体和五聚体蛋白形成外壳，将Rubisco和碳酸酐酶封装其中。
研究方法
菌株与载体构建
本工作采用两种遗传策略构建集胞藻PCC 6803（Syn6803）突变株，以促进内源β-羧酶体表达（图1a）。第一种突变株（命名为CB OE）通过将14个编码货物、外壳和支架组分的羧酶体基因插入slr0168染色体中性位点，置于psbA2启动子和rbcL终止子控制之下，同时保留天然羧酶体表达。第二种突变株（shell OE）仅过表达10个编码外壳和支架蛋白的基因。两种质粒均分别转化至野生型（WT）和RbcL-GFP突变体细胞中，以获得纯合突变株（图1b）。
PCR验证
通过PCR验证CB OE和shell OE突变体的完全分离。以WT基因组作为1号泳道模板，CB OE基因组作为2号和4至7号泳道模板，shell OE基因组作为3号和8至10号泳道模板。WT中slr0168的筛选片段大小为847 bp。
全细胞吸收光谱分析
在环境空气条件下，WT和突变株的全细胞吸收光谱显示叶绿素a、类胡萝卜素和藻胆体的吸收峰几乎一致，表明色素组成和培养色泽基本未变。在2% CO₂条件下培养时，CB OE突变株的主要光合色素吸收峰较WT略有增加。吸收光谱在750 nm处归一化。
免疫印迹分析
使用免疫印迹分析评估RbcL、CcmK2和CcmM的表达水平。每孔上样40 μg总蛋白。蛋白条带下方的数字表示相同培养条件下突变株相对于WT水平的蛋白信号比值。绿色数值表示下调超过10%的蛋白，红色数值表示上调超过10%的蛋白。同时检测CcmM73/CcmM48的比值。
透射电子显微镜（TEM）分析
采用超薄切片透射电子显微镜确定CB OE和shell OE突变株在环境空气和2% CO₂两种条件下的羧酶体数量和形态。对电镜图像进行统计分析：每个细胞的羧酶体数量（n > 40，单因素方差分析后行Dunnett检验）和每个羧酶体的大小（n > 60，单因素方差分析后行Dunnett检验）。小提琴图中散布的小圆点代表原始数据点，中心虚线代表中位数，上下虚线代表四分位数（第25和第75百分位数）。
活细胞超分辨荧光显微镜
对WT和突变株进行活细胞超分辨荧光显微镜观察。绿色信号代表GFP标记的RbcL，指示WT和突变株细胞中的羧酶体结构；品红色信号代表类囊体膜的叶绿素自发荧光。对荧光图像进行定量分析：每个细胞的羧酶体数量和荧光强度（n > 230，单因素方差分析后行Dunnett检验）。
生长曲线与生理参数测定
所有生长曲线实验中，30 mL培养物调整至OD₇₃₀ = 0.1，置于滤膜摇瓶中培养。测定参数包括：生长曲线、Fv/Fm、光合速率/OD₇₃₀、叶绿素a/OD₇₃₀。数据点误差棒代表n = 3个生物学重复的均值±标准差。统计显著性判定：ns = 无显著性，P > 0.05；0.01 < P < 0.05；0.001 < P < 0.01；0.0001 < P < 0.001；****P < 0.0001。
扫描电子显微镜（SEM）
对Syn6803 WT、CB OE和shell OE突变株细胞进行扫描电子显微镜观察。红色箭头指示CB OE突变株细胞中的黏液纤维（MFs），蓝色箭头指示黏液鞘（M）。
高光强与富营养培养基实验
所有菌株在5× BG培养基中培养，光照强度从第1天的50 μmol photons m⁻² s⁻¹逐步提升至100 μmol photons m⁻² s⁻¹，最终在第3天设定为500 μmol photons m⁻² s⁻¹。培养7天后，对可溶性蛋白提取物进行免疫印迹分析，每孔上样40 μg总蛋白，并检测CcmM73/CcmM48比值。同时进行活细胞荧光显微镜观察。
生物量积累比较
培养7天后，收集各培养物1.5 mL细胞沉淀比较沉淀大小。分别取0.006、0.03和0.1 g干燥粉末样品，在空气、2% CO₂和含2% CO₂的5× BG培养基条件下进行比较。
【数据】菌株：Syn6803 WT、CB OE（14个基因过表达）、shell OE（10个基因过表达）；插入位点：slr0168染色体中性位点；启动子：psbA2；终止子：rbcL；PCR片段：847 bp；免疫印迹上样量：40 μg总蛋白；TEM统计：n > 40（数量）、n > 60（大小）；荧光统计：n > 230；培养体积：30 mL；初始OD₇₃₀：0.1；光照强度：50→100→500 μmol photons m⁻² s⁻¹；培养基：5× BG；CO₂条件：空气和2% CO₂；统计方法：单因素方差分析+Dunnett检验
研究结果
突变株的生成与β-羧酶体组装相关基因过表达的表征
此前研究已表明，通过基因工程大幅提升蓝藻中Rubisco含量及其生长速率存在较大难度。本工作成功构建了两种Syn6803突变株。在环境空气条件下，两种突变株（尤其是CB OE突变株）的羧酶体蛋白水平较WT有所降低。这与蓝藻和植物中Rubisco过表达常伴随Rubisco含量和活性下降的现象一致——天然Rubisco酶已接近其生理最适状态，尽管其催化效率存在固有局限。
在2% CO₂条件下，除CB OE突变株中的CcmK2外，羧酶体蛋白丰度较WT显著增加。CO₂可用性是促进β-羧酶体生物合成的关键调控因子；高CO₂会降低Rubisco水平并导致聚球藻PCC 7942中形成更小的羧酶体。本研究结果表明，合成羧酶体的异源表达有效抵消了高CO₂对天然羧酶体生物合成的抑制作用。
羧酶体架构是其物理机制的基础，并受环境变化动态调控。CcmM在Rubisco成核中发挥重要作用，其异构体CcmM73和CcmM48的化学计量组成对介导β-羧酶体组装和组织的调控至关重要。CcmM73:CcmM48比值随CO₂浓度升高而下降，并受羧酶体或外壳组分过表达的调控。类似地，在空气条件下生长的WT聚球藻7942细胞中，羧酶体含有略高水平的CcaA和CcmM58，但CcmM35含量低于2% CO₂条件下培养的细胞。高CO₂条件下，聚球藻7942的CcmM58:CcmM35比值较低，这与羧酶体数量减少相吻合。
羧酶体的组织与分布
透射电镜结果显示，在两种生长条件下，WT和CB OE细胞的羧酶体均呈现相似的多面体形态；相比之下，shell OE细胞的羧酶体形态变异性略高。在环境空气条件下，shell OE突变株的羧酶体丰度较WT显著增加；而在2% CO₂条件下，两种突变株的羧酶体数量均较WT增加。
定量分析显示，在空气条件下，CB OE（177.8 ± 2.3 nm，n = 88）和shell OE（168.8 ± 3.8 nm，n = 61）突变株的羧酶体直径均小于WT（296.5 ± 6.2 nm，n = 65）。在2% CO₂条件下也观察到类似趋势：WT羧酶体平均直径为283.1 ± 3.8 nm（n = 77），而CB OE和shell OE细胞分别为201.3 ± 2.9 nm（n = 63）和168.1 ± 3.4 nm（n = 64）。
这些结果表明：（i）CB OE和shell OE代表不同的化学计量扰动类型；（ii）两种突变株产生的羧酶体数量更多但体积更小；（iii）shell OE表现出最强的尺寸缩减和最高的数量增加——羧酶体蛋白化学计量的改变可能加速货物包被过程，导致形成更多但更小的细胞器。更小的羧酶体是否在底物渗透和周转方面具有竞争优势，有待进一步研究。
【数据】空气条件下羧酶体直径：CB OE 177.8 ± 2.3 nm（n=88）、shell OE 168.8 ± 3.8 nm（n=61）、WT 296.5 ± 6.2 nm（n=65）；2% CO₂条件下羧酶体直径：WT 283.1 ± 3.8 nm（n=77）、CB OE 201.3 ± 2.9 nm（n=63）、shell OE 168.1 ± 3.4 nm（n=64）；统计检验：单因素方差分析+Dunnett检验；显著性水平：ns P>0.05、*0.01 生长与生理参数的比较 在空气或2% CO₂条件下，对CB OE和shell OE突变株的生长及生理参数进行了系统比较。生长曲线显示不同菌株间的生长差异。Fv/Fm、光合速率/OD₇₃₀和叶绿素a/OD₇₃₀等参数在各菌株间呈现不同程度的差异。扫描电镜观察显示，CB OE突变株细胞表面存在黏液纤维，而WT和shell OE细胞表面可见黏液鞘结构。 【数据】培养条件：30 mL培养物，OD₇₃₀=0.1，滤膜摇瓶；生物学重复：n=3；数据表示：均值±标准差；显著性水平：ns P>0.05、*0.0001 高光强与富营养培养基条件下的生长表现 在含2% CO₂的5× BG培养基中，所有菌株在逐步提升的光照条件下（第1天50至100 μmol photons m⁻² s⁻¹，第3天设定为500 μmol photons m⁻² s⁻¹）进行培养。生长曲线、Fv/Fm、光合速率/OD₇₃₀和叶绿素a/OD₇₃₀的测定结果显示各菌株间存在显著差异。培养7天后的免疫印迹分析检测了CcmM73/CcmM48比值的变化。活细胞荧光显微镜观察揭示了WT和突变株细胞内的羧酶体结构和亚细胞组织。 【数据】光照强度：50→100 μmol photons m⁻² s⁻¹（第1天）、500 μmol photons m⁻² s⁻¹（第3天）；培养基：5× BG；CO₂：2%；培养时间：7天；免疫印迹上样量：40 μg总蛋白；生物学重复：n=3；显著性水平：ns P>0.05、0.001 不同CO₂和培养基条件下的生长性能与生物量积累比较 培养7天后，从1.5 mL各培养物中收集细胞沉淀，比较沉淀大小。同时制备了0.006、0.03和0.1 g干燥粉末样品，在空气、2% CO₂和含2% CO₂的5× BG培养基三种条件下进行比较，直观展示了不同条件下的生物量积累差异。 【数据】取样体积：1.5 mL；培养时间：7天；干粉样品量：0.006、0.03、0.1 g；培养体积：30 mL；初始OD₇₃₀：0.1；条件：空气、2% CO₂、2% CO₂+5× BG培养基 Rubisco催化卡尔文-本森循环中CO₂同化的第一步，是光合碳固定的主要生化限制因素。此前提升蓝藻Rubisco含量或生长速率的尝试往往成效有限。本研究证明，在Syn6803中靶向上调β-羧酶体蛋白，伴随CcmM73/CcmM48及其他结构组件化学计量的改变，在升高的CO₂和营养富集条件下显著改变了体内羧酶体形态、光合效率和细胞生长，引发了深刻的分子与生理重塑。 尽管高CO₂和富营养条件改善了CB OE和shell OE突变株的光合作用与细胞生长，但体内蛋白表达的精确调控以及特定蛋白丰度变化与观察到的表型改善之间的机制联系仍需全面研究。环境因素在调节胞内β-羧酶体蛋白中的作用也有待进一步阐明。这些深入认识将有助于在不同环境条件下合理设计和开发快速生长的蓝藻底盘细胞。 编译者解读 本研究巧妙绕开了"单点过表达Rubisco"的传统思路，转而从羧酶体整体生物合成入手——通过全组分（CB OE）和外壳组分（shell OE）两种策略的对比，揭示了蛋白化学计量扰动对细胞器形态与丰度的差异化调控。值得注意的是，高CO₂条件下过表达突变株反而表现出更显著的生长优势，提示工程化羧酶体可能重塑了细胞对CO₂浓度的响应阈值。从合成生物学应用角度看，该策略为蓝藻底盘细胞的定向改造提供了可推广的设计逻辑；然而，突变株在空气条件下羧酶体蛋白水平下降的现象也提醒我们，内源调控网络对外源过表达的反馈抑制仍是需要攻克的工程障碍。 Hu J, Zhao K, Chen Y, Ge X, Yang J. Overexpression of β-carboxysomes increases photosynthesis and growth in Synechocystis sp. PCC 6803. Plant Physiol. PMID: 42093082. PMID: 42093082讨论与解读
参考来源