来源：Deletion of low-essentiality, secretion-associated genes enhances recombinant protein production in Komagataella phaffii.（Microb Cell Fact）| 编译：DNA Lab Space
导读
巴斯德毕赤酵母（Komagataella phaffii）是生产生物药、食品蛋白和工业酶的重要宿主。本研究通过全基因组CRISPR-Cas9敲除筛选，结合基因必需性评分与分泌通路生物学知识，鉴定并敲除了细胞壁和液泡转运途径中的低必需性基因。结果显示，单基因敲除菌株在单克隆抗体（mAb）生产中表现出2-3倍的比生产率和产量提升，且生长和宿主细胞蛋白谱未受明显影响。该策略为工业菌株工程改造提供了新路径。
研究背景
K. phaffii 广泛用于制造生物药物、食品蛋白、试剂和材料。尽管应用日益广泛，进一步提升其生产率仍能带来可观的经济和操作效益。基因组工程是提高细胞比生产率的途径之一。作者提出假设：将基因相对必需性指标与蛋白分泌相关的生物学推断相结合，可鉴定出那些被破坏后能提高菌株比生产率的基因。
研究方法
基因必需性与基因分组
全基因组必需性筛选参照先前报道的方法进行[26]，并做了两处修改：(1) 筛选对象为基因组中全部基因，而非分泌蛋白组基因的子集；(2) 必需性通过未经转化的引导RNA文库与Cas9+文库之间丰度的对数倍数变化来间接估算。
概括方案如下：针对 K. phaffii 基因组中每个编码序列，设计5条靶向编码区前500 bp序列的单引导RNA（gRNA）。该引导文库在大肠杆菌（E. coli）中扩增，随后转化入基因组整合有Cas9酶的 K. phaffii 菌株（Cas9+菌株）。转化并生长后，细胞收获为混合细胞库，采用巢式PCR扩增gRNA cassette、添加条形码并连接测序接头。所得扩增子文库使用Illumina HiSeq 2000测序，以定制引物读取gRNA序列，TruSeq i7索引引物用于样本区分。将扩增子文库中每条gRNA的读数与未转化原始文库的读数比较，计算每条gRNA的倍数变化。对每个基因的对数倍数变化执行单侧Kolmogorov-Smirnov（KS）检验。必需性估计值以KS检验p值的-log10报告[26]。
基因分组采用先前发表的基因组注释[27]。未注释基因根据其与酿酒酵母基因数据库（Saccharomyces gene database）中注释基因的同源性进行分组[28]。
【数据】gRNA设计：每个编码序列5条，靶向编码区前500 bp；测序平台：Illumina HiSeq 2000；统计检验：单侧KS检验；必需性指标：-log10(KS p值)
菌株与载体
必需性筛选使用野生型 K. phaffii（NRRL Y-11430）菌株，Cas9整合于GQ67_01884位点，由PENO1启动子控制，如前所述[26]。
基础菌株（所有工程菌株的衍生来源）为野生型 K. phaffii（NRRL Y-11430）的修饰变体[RCR2_D196E, RVB1_K8E; AltHost Research Consortium Strain S-63]，先前已有报道[29]。
重组曲妥珠单抗（trastuzumab）使用Thermo Fisher Scientific密码子优化器针对 K. phaffii 进行密码子优化。重链和轻链整合入单一定制载体，以收敛方向排列[AltHost Research Consortium A Vector, D-1073]。曲妥珠单抗重链以甲醇诱导型启动子PAOX1克隆，轻链以甲醇诱导型启动子PDAS2克隆。重链和轻链均使用源自酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的pre-OST1/pro-alpha信号肽表达。信号肽与蛋白序列之间加入四个氨基酸（EAEA）以改善信号肽切割效率[30]。
重组人血清白蛋白（HSA）使用天然密码子序列。该序列克隆入先前使用的定制载体[AltHost Research Consortium L Vector, D-17][26]。HSA质粒使用PAOX1启动子，以酿酒酵母α-交配因子信号肽表达。曲妥珠单抗和HSA质粒均在PAOX1启动子内线性化，用于整合至AOX1位点。K. phaffii 通过电穿孔转化线性DNA，方法如前所述[31]。每次转化使用5 µg线性DNA，铺板细胞以适当抗生素（Zeocin™或卡那霉素或两者并用）进行回收。DNA通过DNA介导的多拷贝串联整合方式整合入基因组，利用同源臂在线性化启动子处进行重复整合。
在靶向基因修饰菌株中，基因破坏使用定制CRISPR-Cas9载体[AltHost Research Consortium R Vector][31]和敲除片段[32]，方法如前所述。每个预期敲除选择两条CRISPR引导RNA。引导RNA设计尽可能靠近基因编码区起始位置。若一条引导RNA失败，则使用第二条。当检测到Cas9介导的双链DNA切割但未获得可行敲除菌株（即仅在CRISPR引导位点出现氨基酸缺失）时，该基因被重新归类为必需基因，无论全基因组筛选的必需性估计值如何。每个菌株的敲除片段整合通过PCR产物的Sanger测序确认（GENEWIZ from Azenta, Quintara Biosciences）。
这些靶向基因破坏在稳定整合了重组蛋白表达载体的菌株背景下进行，这些载体在基础菌株（S-63）中表现出高重组蛋白表达，以减少拷贝数差异对蛋白生产造成的混杂影响。
重组蛋白和CRISPR-Cas9酶的质粒序列见补充信息（CRISPR-Cas9酶质粒文件包含JSN1破坏的引导RNA [AltHost Research Consortium R Vector, D-1266]）。补充表格包含所用引导RNA列表（表S7和S11）。
【数据】转化DNA量：5 µg/次；筛选抗生素：Zeocin™/卡那霉素；整合方式：多拷贝串联整合；敲除确认：Sanger测序
高表达含蛋白菌株的筛选
整合了重组蛋白的基础菌株在基因工程前先进行最佳拷贝数筛选。重组蛋白转化入基础菌株后选取8个克隆。这些克隆使用下述3 mL筛选培养方法进行培养。收获的上清液样品通过SDS-PAGE分析，选择蛋白表达水平最高的克隆作为进一步工程的亲本菌株。
【数据】克隆筛选数量：8个；分析方法：SDS-PAGE
菌株培养：3 mL筛选培养
小规模筛选培养（3 mL）在24孔深孔板（Axygen® 10 mL V-bottom）中进行，室温（约23°C），板式摇床（3 mm轨道直径）600 rpm。培养从YPD平板划线开始，在5 mL YPD中过夜生长（约16 h）。以光密度（OD600）0.1接种于复合培养基（1.0 M磷酸钾缓冲液，pH 6.5，1.34%酵母氮碱（不含氨基酸），1%酵母提取物，2%蛋白胨）。
单编辑菌株的蛋白表达筛选培养以4% v/v甘油为碳源生长24 h。24 h后，细胞沉淀并重悬于含1.5% v/v甲醇和10 mM谷胱甘肽的新鲜复合培养基中。谷胱甘肽是CHO培养基中生产抗体的常见添加剂[33]。细胞在新培养基中培养24 h，之后通过离心收获上清液。
双基因破坏菌株的延长3 mL培养同样先以4% v/v甘油为碳源生长24 h。24 h生长后，细胞沉淀并重悬于含1.5% v/v甲醇和10 mM谷胱甘肽的新鲜培养基中。新鲜培养基中培养持续48 h，在生产期24 h时补加1.5% v/v甲醇。上清液再次通过离心收获。
所有平板培养均设三次重复，OD600每24 h测量一次。培养中期样品和收获时上清液使用下述分析方法进行蛋白定量和表征。
【数据】培养体积：3 mL；温度：约23°C；转速：600 rpm；轨道直径：3 mm；接种OD600：0.1；甘油浓度：4% v/v；甲醇浓度：1.5% v/v；谷胱甘肽：10 mM；培养时间：24 h（单编辑）/ 48 h（双编辑，24 h补加甲醇）
菌株培养：50 mL摇瓶培养
50 mL培养在250 mL带挡板摇瓶（Kimble®, PYREX®）中进行。摇瓶在培养箱中培养，25°C，300 rpm，轨道直径19 mm。培养从YPD平板划线开始，在5 mL YPD中过夜生长（约16 h）。摇瓶以光密度（OD600）0.1接种于复合培养基（1.0 M磷酸钾缓冲液，pH 6.5，1.34%酵母氮碱（不含氨基酸），1%酵母提取物，2%蛋白胨）。
与3 mL培养相同，细胞初始在含4% v/v甘油为碳源的培养基中生长24 h。
【数据】培养体积：50 mL；摇瓶规格：250 mL带挡板；温度：25°C；转速：300 rpm；轨道直径：19 mm；接种OD600：0.1；甘油浓度：4% v/v
（注：原文方法部分在此处截断，后续培养步骤、分析方法及生物反应器实验细节原文未完整呈现。）
研究结果
K. phaffii（NRRL Y-11430）的基因必需性通过CRISPR-Cas9全基因组敲除筛选进行预测。基于该筛选结果，作者从两个与分泌密切相关的基因群——即细胞壁相关和液泡转运相关基因——中选取并随后破坏了最低必需性的基因。来自这些基因集的单基因破坏 K. phaffii 菌株在单克隆抗体（mAb）生产中表现出显著提升。与亲本菌株相比，这些菌株在生长或宿主细胞蛋白表观谱方面未表现出可辨别的差异。性能最佳的菌株在不同规模（3–150 mL）、不同培养形式（平板、摇瓶、生物反应器）和不同操作方式（分批和补料分批）中一致地显示出2-3倍的比生产率和产量提升。
图1展示了全基因组敲除筛选的表征结果。A面板显示 K. phaffii（NRRL Y-11430）基因组中所有基因的必需性，每个四分位数的必需性截断值为1280个基因。B面板显示通过过表达分析（ORA）定义的最必需基因（上四分位数）中代表性最强的基因群。C面板显示ORA定义的最低必需基因（下四分位数）中代表性最强的基因群。D面板比较了 K. phaffii（NRRL Y-11430和GS115）及相关物种（K. marxianus、S. cerevisiae、Y. lipolytica、S. pombe）中已报道必需性筛选的共有性比较。条形长度代表每个筛选鉴定出的必需基因数量。颜色表示每个筛选鉴定出的物种特异性基因数量以及已报道筛选与本研究中基因的共同数量。
图2展示了最低必需性细胞壁基因破坏的表征。A面板显示已鉴定细胞壁群中基因的必需性。B面板显示靶向细胞壁基因破坏对糖基化IgG1（曲妥珠单抗）分泌的影响。结果包括3 mL培养上清液的SDS-PAGE凝胶、相应的比生产率（mg/L/OD600）、产量（mg/L）和基因必需性评分。误差线代表标准差。C面板显示3 mL培养的光密度（OD600）随时间的变化。误差线代表标准差。统计学显著性通过普通单因素方差分析（one-way ANOVA）后进行Dunnett多重比较检验确定，将每个菌株与基础菌株进行比较。
图3展示了最低必需性液泡基因破坏的表征。A面板显示液泡通路相关基因的必需性。B面板显示靶向液泡基因破坏对糖基化IgG1（曲妥珠单抗）分泌的影响。结果包括3 mL培养上清液的SDS-PAGE凝胶、相应的比生产率（mg/L/OD600）、产量（mg/L）和基因敲除必需性评分。误差线代表标准差。C面板显示3 mL培养的光密度（OD600）随时间的变化。误差线代表标准差。统计学显著性通过普通单因素方差分析后进行Dunnett多重比较检验确定，将每个菌株与基础菌株进行比较。
图4展示了性能最佳菌株在延长培养和组合敲除中的表征。A面板显示细胞壁基因破坏菌株在延长50 mL培养中生产曲妥珠单抗的光密度（OD600）、比生产率（mg/L/OD600）和产量（mg/L）。阴影误差线代表标准差。B面板显示液泡基因破坏菌株在延长50 mL培养中生产曲妥珠单抗的光密度（OD600）、比生产率（mg/L/OD600）和产量（mg/L）。阴影误差线代表标准差。C面板显示组合细胞壁破坏菌株在3 mL培养中生产48 h后的产量（mg/L）和比生产率（mg/L/OD600）。D面板显示ΔJSN1（细胞壁破坏）菌株和基础菌株在250 mL补料分批生物反应器（150 mL工作体积）中使用限定培养基生产的曲妥珠单抗归一化产量。产量归一化至基础菌株在第一次采样时间点的产量。统计学显著性通过普通单因素方差分析后进行Dunnett多重比较检验确定，A和B中每个菌株与基础菌株比较，C中与单敲除菌株比较。
【数据】比生产率提升：2-3倍；产量提升：2-3倍；规模范围：3–150 mL；培养形式：平板、摇瓶、生物反应器；操作方式：分批、补料分批；统计检验：one-way ANOVA + Dunnett多重比较
讨论与解读
本研究证明了将基因必需性数据与目标表型（此处为蛋白分泌）相关生物学通路的先验知识相结合，可以为菌株工程提供指导以增强目标表型。本研究扩展了具有改进生产率的 K. phaffii 基因工程菌株目录。这些菌株支持利用该宿主实现低成本、高产量的重组蛋白生产这一长期目标。对这些菌株的进一步工程改造和发酵工艺优化，可能实现与其他用于生产mAb和复杂重组蛋白的成熟宿主相当的单位体积生产率。
编译者解读
本研究的方法论亮点在于将全基因组规模的必需性数据转化为可操作的菌株工程靶点，避免了传统随机诱变或仅凭经验筛选的低效。从合成生物学应用角度看，选择"低必需性但分泌相关"的基因作为敲除对象，在保证菌株稳健性的前提下提升了蛋白输出，具有明确的工业化价值。值得注意的是，2-3倍的提升在不同规模培养中保持一致，说明该策略的稳健性。局限在于敲除靶点集中于细胞壁和液泡转运两类基因，其他分泌相关通路（如内质网胁迫响应）是否同样适用尚待验证。未来若能将这些有益突变叠加组合，或与密码子优化、分泌信号肽工程等策略联用，有望进一步释放该宿主的生产潜力。
参考来源
Ford H, Dalvie NC, Lorgeree TR, Barry RM, Sibel AN. Deletion of low-essentiality, secretion-associated genes enhances recombinant protein production in Komagataella phaffii. Microb Cell Fact. PMID: 42116141.
PMID: 42116141