来源：Metabolic state-driven monitoring and control of abnormal pigment formation in sodium gluconate fermentation by Aspergillus niger.（Synth Syst Biotechnol）| 编译：DNA Lab Space
导读
丝状真菌工业发酵后期常出现色素异常积累，严重影响产品质量与下游处理效率。本研究以工业黑曲霉葡萄糖酸钠发酵为对象，构建了"代谢表征—智能光谱监测—营养定向干预"的集成框架。通过模拟工业葡萄糖消耗轨迹的缩小规模策略，证实代谢速率恶化驱动色素积累；进一步开发基于在线拉曼光谱的速率驱动软测量模型，实现色素形成的实时预测；最终通过优化无机盐组成稳定代谢活性，在模拟工业供氧条件下成功抑制异常色素形成。
研究背景
丝状真菌因其高生产率和可放大性，被广泛用于有机酸、酶等大宗生物化学品的工业发酵。然而，工业规模运行下，真菌发酵常表现出难以在实验室规模捕捉和控制的复杂后期行为。其中，发酵后期有色副产物的意外形成在许多真菌体系中普遍存在，通常与细胞活性下降和代谢不稳定相关。这种色素形成现象并非局限于特定菌株或产物，而是反映了延长培养过程中代谢状态转变管理的共性挑战。工业实践中，这些后期异常往往在影响发酵液外观或下游处理之后才被发现，凸显了缺乏有效预测指标的现状。因此，建立系统化的工程框架来重现、监测并最终缓解后期代谢异常，具有重要的科学和实际意义。
理解机制和开发模型的前提，是在受控实验室条件下可靠重现工业规模现象。然而，基于几何或操作相似性的传统缩小规模方法往往难以实现这一目标。
研究方法
2.1 菌株与培养条件
本研究所用工业黑曲霉FYSC121菌株由山东阜阳生物科技有限公司提供。用无菌竹刮刀将保藏孢子转移至新鲜保存斜面并均匀涂布，于37°C培养60小时。种子接种时，向成熟斜面加入50 mL无菌蒸馏水，轻轻刮取孢子制成悬液，将全部孢子悬液接种至种子生物反应器。温度维持38°C，通气速率3.0 vvm。初始搅拌转速500 rpm，生产阶段提高至800 rpm以满足氧需求。用10 M NaOH控制pH约为5.50。50 L缩小规模系统采用压差转移方式接种，种子培养液从30 L种子罐经蒸汽灭菌转移管道进入。发酵过程控制于38°C，恒定通气速率1.0 vvm。采用差异化搅拌策略：初始转速300 rpm，前6小时（延滞期）提高至500 rpm，6小时后至发酵结束升至800 rpm，以确保充分的氧传质与混合。
使用三种不同培养基配方分别用于菌株保存、种子制备和发酵：
固体培养基（每升）：葡萄糖60 g、尿素0.2 g、KH₂PO₄ 0.13 g、MgSO₄·7H₂O 0.02 g、玉米浆1.0 g、琼脂20 g。pH调至6.5–7.0后，加入5.0 g/L CaCO₃。
种子培养基（用于5 L和50 L生物反应器，每升）：MgSO₄·7H₂O 0.19 g、KH₂PO₄ 0.5 g、(NH₄)₂HPO₄ 0.19 g、玉米浆2.1 g、消泡剂0.2 mL。灭菌前pH调至6.5–7.0。
发酵培养基（每升）：葡萄糖300 g、MgSO₄·7H₂O 0.2 g、KH₂PO₄ 0.17 g、(NH₄)₂HPO₄ 0.25 g、尿素0.2 g、消泡剂0.2 mL，pH调至6.5–7.0。
【数据】菌株：黑曲霉FYSC121；保存斜面培养：37°C、60h；种子培养：38°C、3.0 vvm、500→800rpm、pH 5.50（10M NaOH）；50L发酵：38°C、1.0 vvm、300→500→800rpm；固体培养基：葡萄糖60g/L、尿素0.2g/L、KH₂PO₄ 0.13g/L、MgSO₄·7H₂O 0.02g/L、玉米浆1.0g/L、琼脂20g/L、CaCO₃ 5.0g/L、pH 6.5–7.0；种子培养基：MgSO₄·7H₂O 0.19g/L、KH₂PO₄ 0.5g/L、(NH₄)₂HPO₄ 0.19g/L、玉米浆2.1g/L、消泡剂0.2mL/L、pH 6.5–7.0；发酵培养基：葡萄糖300g/L、MgSO₄·7H₂O 0.2g/L、KH₂PO₄ 0.17g/L、(NH₄)₂HPO₄ 0.25g/L、尿素0.2g/L、消泡剂0.2mL/L、pH 6.5–7.0
2.2 分析方法
生物量积累通过测定细胞干重（DCW）评估。取10 mL发酵液经预称重定性滤纸过滤，用蒸馏水充分洗涤以去除残留培养基组分，于105°C干燥至恒重。
葡萄糖分析：发酵上清液用蒸馏水稀释至线性检测范围内，采用SBA-40E生物传感分析仪（中国山东省科学院生物研究所）定量。
葡萄糖酸钠浓度通过高效液相色谱（HPLC）测定，配备C18反相色谱柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）和紫外（UV）检测器。色谱分离使用流动相为5%甲醇和95%磷酸水溶液（1.2%），流速1.0 mL/min。检测波长210 nm，柱温26°C，进样量20 μL。所有样品进样前经0.22 μm滤膜过滤。
黄色色素形成通过分光光度法定量。无细胞上清液经8000 rpm离心10分钟获得。使用UV-Vis分光光度计（Shimadzu UV-2600）在405 nm处测定光密度（OD）或透光率。透光率越低或吸光度越高，表示色素浓度越高。根据合作工业设施的标准质量控制（QC）标准，OD₄₀₅ ≤ 0.30（对应发酵液透光率≥50%）为接受阈值。超过此限的批次需进行昂贵的活性炭二次脱色处理，而在此限内的批次可直接进入标准下游结晶。
尾气组成使用Extrel质谱仪在线监测。氧摄取速率（OUR）、二氧化碳释放速率（CER）和呼吸商（RQ）按公式(1)–(3)计算：
(1) OUR = Fin/V × [CO₂in − (Cinertin·CO₂out)/(1−(CO₂out+CCO₂out))] × 273/(273+tin) × Pin × 1/(1+h×10⁻⁵)
(2) CER = Fin/V × [Cinertin·CCO₂out/(1−(CO₂out+CCO₂out)) − CCO₂in] × 273/(273+tin) × Pin × 1/(1+h×10⁻⁵)
(3) RQ = CER/OUR
其中Fin为进口通气速率，V为工作体积，Cinertin、CO₂in、CCO₂in分别为进口氮气、氧气和二氧化碳分数，CO₂out和CCO₂out为出口氧气和二氧化碳分数，Pin、tin、h分别为进口压力、温度和湿度。
【数据】DCW测定：10mL发酵液、105°C干燥至恒重；葡萄糖：SBA-40E生物传感分析仪；HPLC：C18柱（4.6×250mm，5μm）、UV 210nm、流速1.0mL/min、柱温26°C、进样20μL、流动相5%甲醇+1.2%磷酸；色素：8000rpm离心10min、OD₄₀₅（Shimadzu UV-2600）；QC阈值：OD₄₀₅≤0.30（透光率≥50%）；尾气：Extrel质谱仪在线监测
2.3 数据驱动建模与软传感器开发
#### 2.3.1 数据收集与预处理
数据集包含来自8个不同发酵批次（包括历史工业数据和实验室规模实验）的82个样本点。原始输入变量包括发酵时间（t）、葡萄糖浓度（S）、葡萄糖酸钠浓度（P）和生物量（X）。目标变量为色素强度（OD₄₀₅）。数据采用Min-Max归一化至[0, 1]范围，以确保模型训练期间的数值稳定性。为捕获代谢动态，原始特征空间增加了衍生生理描述符：比生长速率（μ）、比葡萄糖消耗速率（qS）、比生产速率（qP）、产率系数（YP/S）和葡萄糖利用效率（P/S）。采用Pearson相关系数评估特征与目标变量之间的关系。
#### 2.3.2 模型训练与评估
使用Python scikit-learn库对近20种机器学习回归算法进行基准测试，包括线性回归、支持向量回归（SVR）、随机森林、XGBoost和Extra Trees。数据集随机分为训练集（80%）和测试集（20%）。超参数调优（网格搜索）过程中应用5折交叉验证以防止过拟合。模型性能使用决定系数（R²）和均方误差（MSE）评估。绘制学习曲线以评估偏差-方差权衡。
#### 2.3.3 特征重要性分析
为阐明色素形成的生物学驱动因素并解码模型的决策过程，采用SHAP（SHapley Additive exPlanations）——一种博弈论方法，量化每个特征对模型输出的边际贡献。使用shap Python库中的TreeExplainer算法计算最佳集成模型的SHAP值。
【数据】数据集：8个批次、82个样本点；输入变量：t、S、P、X；目标变量：OD₄₀₅；归一化：Min-Max至[0,1]；衍生特征：μ、qS、qP、YP/S、P/S；训练/测试：80%/20%；交叉验证：5折；评估指标：R²、MSE
2.4 拉曼光谱与化学计量学建模
使用配备785 nm激发激光的RAMINA过程分析仪（Thermo Fisher Scientific）在线采集拉曼光谱。为有效捕获葡萄糖和葡萄糖酸钠水平的快速代谢动态与生理变化，以15分钟间隔的高频率采集光谱数据。原始光谱数据采用标准正态变量（SNV）变换进行预处理。该步骤对消除非化学物理变化（如散射效应和光程差异）并增强化学相关光谱特征至关重要。随后进行主成分分析（PCA）以降低数据维度并可视化主要方差趋势。使用Hotelling's T²统计量和Q残差评估PCA模型的有效性和适用性。此外，计算杠杆值和标准化Y残差以诊断回归模型，识别和分析高杠杆点和潜在异常样本。建立将光谱数据与发酵过程变量（特别是葡萄糖酸钠浓度）关联的定量校准模型。
【数据】拉曼光谱：RAMINA过程分析仪（Thermo Fisher Scientific）、785nm激发激光、15min采集间隔；预处理：SNV变换；降维：PCA；模型诊断：Hotelling's T²、Q残差、杠杆值、标准化Y残差
研究结果
3.1 50 L缩小规模生物反应器中工业规模黄色色素形成表型的重现
图1a展示了200 m³生物反应器中工业规模葡萄糖酸钠发酵的典型曲线。在标准操作条件下，发酵约20小时内完成，最大葡萄糖消耗速率达20 g/L/h。在发酵大部分时间内，葡萄糖转化为葡萄糖酸钠的转化率保持高而稳定（0.90–0.94 mol/mol），表明初级代谢高效且调控良好。然而，尽管动力学性能良好，工业 production 后期仍频繁出现发酵液异常黄色色素形成（图S1）。对多个工业批次的统计分析显示，这种色素形成仅与发酵末期相关，而非活跃生长期或产酸期。黄色色素的积累显著损害了产品视觉质量，给下游纯化带来沉重负担，从而增加了生产成本并降低了工艺稳健性。
显微镜检查通过比较有色素和无色素形成的批次，进一步揭示了黑曲霉的生理状态（图1b）。无色素批次中，菌丝体呈现致密、健壮、丝状结构，染色亲和力强，反映高生理完整性。相比之下，有色素批次的生物量以分散的菌丝碎片为特征，染色性能差。形态恶化表明色素形成与细胞衰老之间存在强相关性，可能由发酵后期不良生理条件诱导。此外，对尾气质谱数据的更详细分析为这种后期恶化提供了更深入的机制见解。发酵后期以OUR急剧下降为特征，而CER仍不成比例地升高，导致RQ异常偏移（图1a）。这一独特的生理特征表明氧化代谢严重解偶联。在这些氧限制条件下，尽管比底物摄取速率（qS）可能保持活跃，但碳源的有效氧化受到损害。代谢解偶联大幅降低了能量（ATP）生成效率，使细胞无法满足其不断增加的维持能量需求。总之，结果表明能量短缺可能触发细胞过早衰老和随后应激诱导的次级代谢途径激活，最终导致黄色色素形成。
为验证这一假设并促进系统性机制研究，我们采用合理的缩小规模策略在实验室规模50 L生物反应器中重现工业规模黄变现象（图1c）。缩小规模标准基于先前对黑曲霉的生理研究，该研究确定在线OUR是葡萄糖消耗和葡萄糖酸钠生产速率的可靠指标。因此，缩小规模方案设计为匹配产酸期的葡萄糖消耗速率与工业发酵稳定期观察到的平均OUR水平。当50 L生物反应器的搅拌转速和通气速率分别设定为450 rpm和1.0 vvm时，实验室规模发酵实现最大葡萄糖消耗速率20 g/L/h，与200 m³工业反应器的动力学密切吻合（图1c）。关键的是，在这些条件下，黄色色素形成在后期成功重现，证实缩小规模模型不仅捕获了动力学特征，还捕获了不良工业表型。
为进一步阐明氧供应的作用，50 L生物反应器的通气速率提高至1.2 vvm（图1d），同时保持搅拌不变，模拟工业规模空压机功率的增加。该调整将发酵时间从28小时缩短至24小时，并有效缓解了黄色色素形成。这些结果表明，增强氧供应维持了初级代谢活性，促进了细胞维持，并延迟了衰老相关色素形成的发生。此外，这些发现验证了基于OUR的缩小规模方法的可靠性，并强调了氧可用性在调节黑曲霉后期生理状态中的关键作用。经验证的模型可作为后续代谢调控和工艺优化研究的稳健实验平台。
尽管增加通气有效抑制了缩小规模系统中的黄色色素形成，但该策略本身并不能为工业操作提供通用或主动的解决方案。氧供应代表一种外部控制变量，主要是在代谢恶化已经出现后进行补偿，而非在早期阶段识别生理不稳定性的发生。此外，过度通气常受能耗、设备容量和剪切敏感性的限制，限制了其作为大规模发酵常规控制策略的适用性。更重要的是，通气实验揭示黄色色素形成与后期代谢转变紧密耦合，而非单一操作参数。这一观察强调了开发能够定量表征培养物生理状态预测工具的必要性，以便在不可逆色素积累发生前进行早期诊断并提供可操作的工艺干预指导，而非依赖被动的操作调整。因此，在成功重现工业色素形成行为并通过氧增强缓解后，我们接下来专注于建立数据驱动的软感知框架用于实时色素预测。
【数据】200m³工业发酵：约20h完成、最大葡萄糖消耗速率20g/L/h、转化率0.90–0.94mol/mol；50L缩小规模：450rpm、1.0vvm、最大葡萄糖消耗速率20g/L/h；1.2vvm条件：发酵时间28h→24h、有效缓解色素形成；色素仅在发酵末期出现
3.2 色素预测数据驱动软传感器的开发
#### 3.2.1 基于生理相关性的软传感器变量选择
输入变量的严格选择是开发稳健且可解释的软感知模型的先决条件。黑曲霉中黄色色素积累与培养物的后期生理状态内在相关，具体受代谢活性、碳通量动态和生物量维持的调控。此外，发酵时间、生物量、葡萄糖和葡萄糖酸钠浓度被指定为核心预测因子。发酵时间作为生理衰老的时间代理，这一因素在我们的缩小规模验证中与色素发生明确相关。生物量浓度作为细胞生长和活力的度量，而葡萄糖浓度量化了相对于代谢需求的底物可用性。此外，葡萄糖酸钠浓度捕获了累积产物输出。
【数据】核心预测因子：发酵时间(t)、生物量(X)、葡萄糖(S)、葡萄糖酸钠(P)；目标变量：OD₄₀₅；数据集：82个样本点、8个批次
图2展示了葡萄糖酸钠发酵过程的生理表征与多尺度分析。（此处对应原文图2内容）
图3展示了软传感器开发的特征相关性分析与机器学习模型综合评价。
图4展示了用于软传感器建模的原始与预处理光谱数据比较。
3.3 无机盐组成对细胞生长、代谢及色素形成的调控
图5展示了氮源、磷酸盐水平和硫酸镁浓度对细胞生长、葡萄糖代谢、产物合成和发酵液色素形成的影响。
3.4 关键发酵参数潜变量数优化与预测性能验证
图6展示了关键发酵参数潜变量数优化与预测性能验证结果。
3.5 不同初始(NH₄)₂HPO₄浓度下发酵参数的时间过程动力学曲线
图7展示了不同初始(NH₄)₂HPO₄浓度下发酵参数的时间过程动力学曲线。
3.6 50 L生物反应器中对照组与优化策略的发酵性能比较
图8展示了50 L生物反应器中对照组（CK）与优化策略的发酵性能比较。
【数据】50L验证：优化组与CK组最终葡萄糖酸钠产量无显著差异（p > 0.05）；色素形成被有效抑制
讨论与解读
本研究建立了从生理状态视角理解和控制黑曲霉葡萄糖酸钠发酵中异常色素形成的工业相关框架。基于葡萄糖消耗行为的代谢导向缩小规模策略成功重现了200 m³工业生物反应器中观察到的后期黄色色素形成，证明色素形成源于代谢速率恶化而非工艺特异性异常。随后开发了速率驱动的软感知模型，将色素形成与代谢动力学关联。为克服离线测量的局限性，集成在线拉曼光谱实现生物量、葡萄糖和葡萄糖酸钠的实时定量，从而提供可靠的动力学输入，显著增强色素预测的稳健性。在代谢感知监测框架指导下，合理优化无机盐组成以稳定细胞代谢并抑制色素形成，且不损害发酵性能。集成策略的有效性在模拟工业氧供应条件的试点规模下得到验证，异常色素形成被成功抑制。未来研究将聚焦于直接在200 m³规模工业生物反应器中部署该集成策略，以获取全面的工业运行数据。
编译者解读：该研究的核心价值在于将"代谢状态"从抽象概念转化为可量化、可监测、可干预的工程参数。基于OUR的缩小规模策略精准复现了工业表型，使机制研究不再依赖大规模试错；速率驱动软传感器结合在线拉曼光谱，则把离线检测的滞后转化为实时预警。值得注意的是，无机盐优化策略在抑制色素的同时不影响主产物合成，这为工业发酵的质量控制提供了"代谢稳定化"而非"末端治理"的新思路。然而，SHAP特征重要性与实际代谢调控之间的因果验证仍有待深化，从50 L到200 m³的放大过程中，氧传递差异可能引入新的变量——这也是该框架走向工业应用时必须跨越的鸿沟。
参考来源
Sun J, Jiang Y, Jiang X, Chen Z, Ke X. Metabolic state-driven monitoring and control of abnormal pigment formation in sodium gluconate fermentation by Aspergillus niger. Synth Syst Biotechnol. PMID: 42433271
PMID: 42433271