来源：Tri-valorization of methanol in a single bioreactor: co-production of enzyme, chemical, and single-cell protein using engineered Pichia pastoris (Komagataella phaffii).（Bioresour Bioprocess）| 编译：DNA Lab Space
导读
甲醇基生物制造的经济性常受限于单一产品的低附加值。本研究在甲基营养型酵母毕赤酵母中构建了一种整合型共生产策略，将甲醇同时转化为三种产品：甜味剂赤藓糖醇、工业生物催化剂β-甘露聚糖酶和单细胞蛋白生物质。该策略利用内质网-高尔基体分泌途径（产酶）与胞质途径（化学品合成）之间的天然空间与功能分隔，减少了途径间干扰。工程菌株在摇瓶和发酵罐培养中均实现了与单产菌株相当的产物滴度，超滤分离回收效率超过89%。
研究背景
全球对可持续生物制造工艺的需求推动了对替代碳源的关注。甲醇，尤其是通过可再生能源将大气或工业排放中捕集的CO₂转化而来的“绿色甲醇”，既可减少温室气体排放，又为循环碳经济提供了可持续原料。甲基营养型酵母毕赤酵母（Komagataella phaffii）非常适合甲醇基生物过程——上世纪70年代其单细胞蛋白生产潜力即被探索，但因油气成本上升而未能商业化。近年来，人造食品需求增长与CO₂减排压力重新激发了相关研究兴趣。然而，甲醇基生物转化此前几乎全部聚焦于单一产品目标，单产品过程的低价值成为经济瓶颈。
研究方法
共生产菌株的构建
本研究以两株前期工程化的毕赤酵母菌株为基础。第一株原始命名为GS-4sman，胞外分泌β-甘露聚糖酶，本文称GS-M。该菌株含有四个串联整合的β-甘露聚糖酶基因拷贝。第二株命名为GS-A，即前期报道的GS-2AY，经工程化改造用于赤藓糖醇生产。GS-A菌株通过将质粒pPICHhis-2AY转化至野生型毕赤酵母获得，该质粒各携带两份赤藓糖-4-磷酸磷酸酶（YidA）和赤藓糖还原酶（ALR）基因拷贝。为构建共生产菌株（GS-AM），将线性化质粒pPICHhis-2AY转化至GS-M——该质粒与构建亲本GS-A菌株所用的质粒完全相同。
【数据】菌株：GS-M（4拷贝甘露聚糖酶基因）、GS-A（2拷贝YidA+2拷贝ALR）、GS-AM（GS-M+pPICHhis-2AY）；质粒：pPICHhis-2AY
摇瓶培养生产赤藓糖醇与β-甘露聚糖酶
除非另有说明，所有菌株首先在YPD培养基（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖）中预培养48 h，然后转入装有25 mL BMMY培养基（8.7 g/L磷酸钾、13.4 g/L酵母氮碱、20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母提取物、0.4 mg/L生物素，pH 6.0）的250 mL挡板摇瓶中，于30°C培养。通过添加10 g/L甲醇启动赤藓糖醇和β-甘露聚糖酶的生产，此后每12 h补加10 g/L甲醇。进行三次独立生物学重复。
【数据】预培养：YPD培养基，48h；生产培养：250mL挡板摇瓶，25mL BMMY培养基，30°C；甲醇诱导：初始10g/L，每12h补加10g/L；生物重复：3次
发酵罐补料分批培养生产赤藓糖醇与β-甘露聚糖酶
补料分批发酵在1-L发酵罐（Infors，瑞士）中进行，装液量0.8 L BMGY培养基（8.7 g/L磷酸钾、13.4 g/L酵母氮碱、20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母提取物、0.4 mg/L生物素、40 g/L甘油，pH 6.0），并添加3.2 mL PTM1痕量盐（6 g/L CuSO₄·5H₂O、0.09 g/L KI、3 g/L MnSO₄·H₂O、0.02 g/L H₃BO₃、0.2 g/L Na₂MoO₄·2H₂O、0.5 g/L CoCl₂、20 g/L ZnCl₂、65 g/L FeSO₄·7H₂O、0.2 g/L生物素、5.0 mL/L H₂SO₄）。温度维持在30°C，通过添加NH₃·H₂O（28%，v/v）控制pH为6.0，空气流速设为2 L/min。菌株在YPD培养基预培养后接种。发酵从甘油批次阶段开始，持续至甘油耗尽。随后通过添加3 g/L甲醇启动甲醇诱导。在甲醇补料阶段，使用自动甲醇控制系统（FC2002，华东理工大学，上海，中国）将残留甲醇浓度维持在3 g/L，该系统补入含1.2% PTM1痕量盐的甲醇。
【数据】发酵罐：1-L（Infors），装液0.8L BMGY；PTM1：3.2mL；温度：30°C；pH：6.0（NH₃·H₂O，28% v/v）；空气流速：2L/min；甲醇诱导：3g/L；残留甲醇：3g/L（自动控制系统FC2002）；补料甲醇含1.2% PTM1
分析方法
赤藓糖醇滴度通过HPLC分析测定，使用Aminex HPX-87 H色谱柱（Bio-Rad），以8 mM H₂SO₄为流动相。流速设为0.6 mL/min，柱温维持在55°C。赤藓糖醇浓度使用示差折光（RI）检测器检测。
β-甘露聚糖酶活性按Zhu等人方法测定。反应体系为190 µL含0.5%槐豆胶的0.05 M甘氨酸-NaOH缓冲液（pH 9.0），加入10 µL适当稀释的培养上清液。混合物在70°C孵育5 min。随后使用3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定还原糖浓度。一个β-甘露聚糖酶活性单位定义为：以槐豆胶为底物，每分钟释放1 µmol还原糖所需的酶量。
【数据】HPLC：Aminex HPX-87H柱，8mM H₂SO₄，0.6mL/min，55°C，RI检测；酶活测定：190µL 0.05M甘氨酸-NaOH（pH 9.0）+0.5%槐豆胶+10µL上清，70°C，5min，DNS法
超滤分离赤藓糖醇与β-甘露聚糖酶
发酵液首先在13,000×g离心1 min去除细胞碎片。上清液随后使用Amicon Ultra-0.5离心超滤管（Millipore）进行超滤，采用两种不同分子截留量（MWCO）膜（3 kDa和10 kDa）分离赤藓糖醇和β-甘露聚糖酶。透过液富含赤藓糖醇，截留液含β-甘露聚糖酶。各产物的分离效率通过测定透过液（赤藓糖醇）和截留液（β-甘露聚糖酶）组分中的产物滴度计算。
【数据】离心：13,000×g，1min；超滤膜MWCO：3kDa和10kDa；分离效率：透过液赤藓糖醇+截留液β-甘露聚糖酶分别测定
转录组分析
mRNA测序及原始数据分析由诺禾致源（北京，中国）完成。
实时荧光定量PCR（RT-qPCR）基因表达分析
使用Yeast RNAiso Kit（TaKaRa，日本）提取总RNA。使用SynScript®Ⅲ RT SuperMix for qPCR（擎科，中国）合成cDNA。RT-qPCR使用FastFire qPCR PreMix（天根，中国）在LightCycler® 96仪器（Roche，瑞士）上进行。编码肌动蛋白的ACT1基因作为内参。目标基因扩增使用以下引物：ALR基因引物ALR-F（5’-catcgagtctggctaccgtc-3’）和ALR-R（5’-gtccctcttcagggttgtcg-3’）；yidA基因引物yidA-F（5’-atcactggccgacgtgttag-3’）和yidA-R（5’-ttatccatcgccacaccgac-3’）；manA基因引物manA-F（5’-aacctccaaaccatccaccg-3’）和manA-R（5’-acccatcacgttgcttccat-3’）；ACT1基因引物actin-F（5’-ggagcaggaaactgaggagg-3’）和actin-R（5’-ttcgcctgtgtatggctctg-3’）。相对表达水平使用2^−ΔΔCt法计算。
【数据】内参基因：ACT1；计算方法：2^−ΔΔCt；引物序列：见原文ALR/yidA/manA/ACT1各上下游引物
研究结果
工程化毕赤酵母共产赤藓糖醇与β-甘露聚糖酶
我们此前报道了毕赤酵母中碱性β-甘露聚糖酶的高水平表达——该酶在纸浆和造纸工业中具有重要应用价值。近期，我们成功构建了基于毕赤酵母的赤藓糖醇化学品细胞工厂——赤藓糖醇是一种大宗甜味剂，也是通过化学转化合成多种C4衍生物（如丁二醇、丁三醇）的潜在平台化学品。
本研究中，携带四个串联β-甘露聚糖酶基因拷贝的GS-4sman菌株作为产酶参考菌株，命名为GS-M。赤藓糖醇生产对照菌株（GS-A）通过将pPICHhis-2AY转化至野生型菌株获得，该质粒各携带两份赤藓糖-4-磷酸磷酸酶（YidA）基因和赤藓糖还原酶（ALR）基因拷贝。对于共生产，将pPICHhis-2AY质粒导入GS-M，获得共生产菌株GS-AM。
三株菌（GS-M、GS-A和GS-AM）均在每12 h补加甲醇的摇瓶培养中进行了评估。结果显示，GS-AM与GS-M之间的β-甘露聚糖酶产量无显著差异（图1C）。然而，生长曲线显示GS-AM生长明显慢于GS-M，表明碳通量向赤藓糖醇合成的分流减少了可用于生物量形成的资源——这与我们之前的观察一致（图1A）。因此，GS-AM中单位OD600的β-甘露聚糖酶产量高于GS-M。
GS-AM的赤藓糖醇产量也与GS-A相似（图1B）。但由于GS-AM的生长速率略高于GS-A，单位OD600的赤藓糖醇产量略低，表明共生产菌株的赤藓糖醇生产能力相比单产赤藓糖醇菌株略有降低。
图1 工程化毕赤酵母共产赤藓糖醇与β-甘露聚糖酶。A 赤藓糖醇生产菌株GS-A、β-甘露聚糖酶生产菌株GS-M和共生产菌株GS-AM的生长曲线。B GS-A和GS-AM的赤藓糖醇产量。C GS-M和GS-AM的β-甘露聚糖酶产量。进行了三次独立生物学重复。
【数据】GS-AM vs GS-M：β-甘露聚糖酶产量无显著差异，生长更慢，单位OD600酶产量更高；GS-AM vs GS-A：赤藓糖醇产量相似，生长略快，单位OD600赤藓糖醇产量略低
温度和溶解氧对赤藓糖醇与β-甘露聚糖酶共生产的影响
温度和溶解氧（DO）通常被认为是影响发酵产酶性能的重要工艺参数，但它们对化学品生产——尤其是共生产——的影响研究较少。本研究考察了这两个参数对三株菌的影响。
对于β-甘露聚糖酶生产菌株GS-M，将温度降至26°C以及通过20%装液量降低DO，分别使β-甘露聚糖酶活性提高了92.6%和75.1%（图2D和F）。相反，对于GS-A中的赤藓糖醇生产，两者分别使赤藓糖醇滴度显著降低了19.5%和40.0%（图2D和F）。对于共生产菌株GS-AM，温度和DO对β-甘露聚糖酶和赤藓糖醇生产的影响分别与GS-M和GS-A中观察到的结果一致（图2D和F）。
关于生物量积累，降低DO导致三株菌的生物量均显著下降，而将温度降至26°C相比30°C仅引起轻微下降（图2A和C）。这表明较低温度和降低DO都可能减缓甲醇代谢速率，从而降低细胞生长速率。然而，较低温度通常导致甲醇生物量产率提高，这可以补偿代谢速率的降低，并解释了观察到的生物量水平仅略有下降。这些条件下较慢的甲醇代谢也减少了可用于产物合成的碳通量，解释了赤藓糖醇滴度的下降。对于β-甘露聚糖酶，分泌而非合成往往是限速步骤，降低的生产负荷可能缓解折叠和分泌应激，使酶更高效地输出，从而产生更高的胞外活性。
图2 共生产菌株GS-AM在低温或低溶解氧条件下的性能。A–C 赤藓糖醇生产菌株GS-A、β-甘露聚糖酶生产菌株GS-M和共生产菌株GS-AM在不同培养条件下的生长曲线。D–F 不同培养条件下单产菌株GS-A/GS-M与共生产菌株GS-AM之间赤藓糖醇或β-甘露聚糖酶产量的比较。CK：250 mL挡板摇瓶，10%装液量，30°C；低温：250 mL挡板摇瓶，10%装液量，26°C；低DO：100 mL挡板摇瓶，20%装液量，30°C。进行了三次独立生物学重复。
【数据】GS-M低温：酶活+92.6%；GS-M低DO：酶活+75.1%；GS-A低温：赤藓糖醇−19.5%；GS-A低DO：赤藓糖醇−40.0%；低温生物量：仅轻微下降；低DO生物量：显著下降
发酵罐培养中的赤藓糖醇与β-甘露聚糖酶共生产
鉴于共生产菌株在摇瓶培养中展现出与相应单产菌株相当的酶和化学品生产能力，其放大性能在1-L发酵罐中以单产菌株为对照进行了进一步评估。在甘油批次阶段（数据未显示），三株菌表现出相似的性能，在进入甲醇阶段进行细胞生长和产物合成前OD600达到约40。
在甲醇阶段，所有菌株的生长模式与摇瓶培养中观察到的结果一致（图1A和3A）。GS-AM菌株积累的生物量少于GS-M但多于GS-A（图3A）。对于产物形成，GS-AM相比单产菌株表现出略低的滴度（图3B和C）。甲醇诱导144 h后，GS-AM的赤藓糖醇和β-甘露聚糖酶滴度分别达到GS-A和GS-M所得值的84.9%和91.4%。
三株菌的甲醇生物量产率和产物产率也进行了计算。与GS-A相比，GS-AM的生物量产率提高了47.4%，而甲醇赤藓糖醇产率几乎保持不变。与GS-M相比，GS-AM的生物量产率降低了29.9%，而β-甘露聚糖酶产率保持相同水平。这些结果表明，毕赤酵母中的共生产可有效放大至发酵罐条件，仅存在微小权衡，支持碳向赤藓糖醇和β-甘露聚糖酶的高效分配，且无明显途径干扰。
此外，三株菌生物量的粗蛋白含量存在差异，且与其生物量产率呈负相关（图3D，S1）。快速生长的GS-M将最多碳导向生物量，蛋白含量最低（0.521 g/g DCW），而生长缓慢的GS-A中碳大量转向赤藓糖醇，积累了最多的富氮生物量（0.587 g/g DCW）。共生产菌株GS-AM呈现中间值（0.567 g/g DCW），证实即使在共生产情景下，生物质仍是有价值的蛋白质共产品。
图3 GS-AM菌株在1-L发酵罐中共产赤藓糖醇和β-甘露聚糖酶。A 赤藓糖醇生产菌株GS-A、β-甘露聚糖酶生产菌株GS-M和共生产菌株GS-AM的生长曲线。B GS-A和GS-AM菌株的赤藓糖醇产量。C GS-M和GS-AM菌株的β-甘露聚糖酶产量。D GS-A、GS-M和GS-AM菌株的产物产率。生物量产率定义为每克甲醇消耗产生的干细胞重量克数；赤藓糖醇产率定义为每克甲醇消耗产生的赤藓糖醇克数；β-甘露聚糖酶产率定义为每克甲醇消耗产生的甘露聚糖酶活性单位数。所有实验均进行两次生物学重复。
【数据】甲醇诱导144h：GS-AM赤藓糖醇滴度=GS-A的84.9%，β-甘露聚糖酶滴度=GS-M的91.4%；GS-AM vs GS-A：生物量产率+47.4%，赤藓糖醇产率几乎不变；GS-AM vs GS-M：生物量产率−29.9%，β-甘露聚糖酶产率不变；粗蛋白含量：GS-M 0.521g/g DCW，GS-A 0.587g/g DCW，GS-AM 0.567g/g DCW
共生产菌株与单产菌株的生理学考察
图4 共生产菌株与单产菌株的转录组分析。A 以野生型GS115菌株为对照，单产菌株GS-A、GS-M和共生产菌株GS-AM中差异表达基因的统计图。B 三个比较组中差异表达基因总数的维恩图。C GS-A、GS-M和GS-AM菌株中赤藓糖醇合成基因ALR、yidA和β-甘露聚糖酶合成基因manA的相对表达水平。基因相对表达水平显示为归一化至相应单产菌株后的值。
【数据】转录组对照：野生型GS115；基因：ALR、yidA、manA；归一化基准：相应单产菌株
超滤分离赤藓糖醇与β-甘露聚糖酶
图5 超滤从发酵液中分离赤藓糖醇和β-甘露聚糖酶。A 超滤分离赤藓糖醇和β-甘露聚糖酶的示意图。透过液富含赤藓糖醇，截留液富含β-甘露聚糖酶。B 使用不同MWCO超滤膜的赤藓糖醇和β-甘露聚糖酶分离效率。分离效率定义为透过液/截留液中赤藓糖醇含量或甘露聚糖酶活性相对于发酵液中的比值。
【数据】分离效率：超过89%（摘要数据）；MWCO膜：3kDa和10kDa；透过液：赤藓糖醇；截留液：β-甘露聚糖酶
讨论与解读
本研究在毕赤酵母中建立了三重生值化策略的概念验证，从甲醇同时生产单细胞蛋白生物质、β-甘露聚糖酶和赤藓糖醇。虽然微生物发酵中酶和化学品的共生产此前已有报道，但所有先前策略均使用糖基或油基碳底物，该概念从未延伸至以甲醇为唯一碳源和能源。迄今为止，该宿主中的甲醇基生物转化几乎完全聚焦于单一产品目标——要么重组酶表达，要么小分子生物合成。通过在一个甲醇补料发酵中整合三条不同的价值流，本研究为克服当前限制甲醇基生物制造的经济瓶颈提供了概念框架和实用路线。
该共生产策略基于一个核心假设：分泌途径（产酶）与胞质途径（产化学品）之间的空间干扰有限，可实现最小干扰下的同时生产。以β-甘露聚糖酶和赤藓糖醇为模型产物，结果在很大程度上支持了这一假设。摇瓶培养中，共生产菌株（GS-AM）实现了与专用单产菌株相当的产物滴度。转录组分析进一步证实了这一结论。
编译者解读
该研究巧妙利用真核细胞内膜系统的区室化特性——将酶分泌（ER-高尔基体途径）与化学品合成（胞质途径）在空间上天然隔离，避免了传统共生产策略中常见的代谢通路冲突。从合成生物学应用角度看，这种“空间分隔”设计理念具有普适性，可推广至其他酶-化学品组合。发酵罐数据中GS-AM生物量产率较GS-A提升47.4%而赤藓糖醇产率不变，说明碳分配效率优异。但需注意，共生产菌株在144 h时两种产物滴度均略低于单产菌株（84.9%和91.4%），存在轻微权衡；超滤分离效率虽超89%，但3 kDa与10 kDa膜的具体差异原文未详述。总体而言，该策略为绿色甲醇的高值化利用开辟了一条多产品并联的新路径。
参考来源
Fang J, Wang S, Liu G, Zhang Y, Li Y. Tri-valorization of methanol in a single bioreactor: co-production of enzyme, chemical, and single-cell protein using engineered Pichia pastoris (Komagataella phaffii). Bioresour Bioprocess. PMID: 42440030. DOI: 10.1186/s40643-026-01099-0.
PMID: 42440030