来源：Microbial Competition and Nutrient Limitation Remodel the Volatilome of Kluyveromyces marxianus.（J Fungi (Basel)）| 编译：DNA Lab Space
导读
混合发酵中非酿酒酵母的应用日益受到关注，但微生物互作与营养胁迫如何影响风味物质合成仍是未解之谜。本研究以分离自龙舌兰发酵体系的马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）为对象，系统考察了微生物竞争（与酿酒酵母和戴尔有孢圆酵母共培养）与营养限制（低营养M2培养基）双重胁迫对其生长和挥发性有机物（VOCs）谱的影响。结果显示，胁迫条件虽抑制细胞生长，却显著提升了关键芳香化合物的合成，尤其是乙酸苯乙酯、辛酸乙酯和己酸乙酯的产量大幅增加。该发现为利用胁迫策略优化传统发酵饮品的感官品质提供了新视角。
研究背景
自然发酵过程中固有的微生物多样性对终产品的感官特性起着决定性作用。近年来，包含非酿酒酵母的混合发酵日益受到重视，因其能增强香气特征并提升发酵饮料的复杂度。马克斯克鲁维酵母凭借广泛的糖谱利用能力（如乳糖和菊粉）、耐热特性、裂解酶分泌能力及高生长速率，成为极具前景的生物技术候选菌株。不同来源的该酵母表现出显著的表型变异性——分离自龙舌兰发酵过程的菌株对乙醇和皂苷具有更高的耐受性，某些情况下乙醇产量甚至超过酿酒酵母，并能产生更多样化的挥发性化合物。
然而，酿酒酵母与非酿酒酵母的联合使用虽能增加芳香多样性，但酵母间的互作关系（共生、偏利共生、偏害共生或竞争）不受控制，导致发酵结果波动。在混合发酵过程中，酵母可能同时经历非生物胁迫、生物胁迫或两者组合。本研究旨在解析微生物竞争与营养限制这两种胁迫因素如何独立及协同影响马克斯克鲁维酵母的生长与挥发性代谢组。
研究方法
2.1 菌株与接种物制备
本研究所用菌株为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）ITD-00185、马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）ITD-01005和戴尔有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii），均分离自梅斯卡尔酒生产过程。接种物制备方法：从每种酵母菌株的单菌落中挑取菌体，悬浮于50 mL液体YPD培养基（含2%葡萄糖、2%酪蛋白胨、1%酵母提取物）中，在轨道摇床（Shel Lab SSI2型，美国俄勒冈州Cornelius）上于28°C、150 rpm条件下培养12小时。
【数据】培养基：YPD（2%葡萄糖、2%酪蛋白胨、1%酵母提取物）；体积：50 mL；温度：28°C；转速：150 rpm；时间：12h
2.2 单培养与共培养发酵
发酵在两种营养品质不同的培养基中进行：YPD和M2。YPD培养基成分（每升）：果糖90 g、葡萄糖10 g、酵母提取物10 g、酪蛋白胨20 g。M2培养基成分（每升）：果糖90 g、葡萄糖10 g、酵母提取物1 g、(NH₄)₂SO₄ 2 g、MgSO₄·7H₂O 0.4 g、KH₂PO₄ 5 g。M2培养基pH调至5。所有发酵均设三次重复，使用150 mL培养基，在轨道摇床（Shel Lab SSI2型）上于28°C、150 rpm条件下培养。单培养以1 × 10⁶ cells/mL的细胞密度起始；二元共培养以每种菌株5 × 10⁵ cells/mL起始；三元共培养以每种菌株3.3 × 10⁵ cells/mL起始。该初始密度确保发酵开始时每个细胞的营养可利用性保持均匀。每3小时监测一次发酵过程，持续24小时。三次重复采集样品，用于测定各酵母物种的生长、葡萄糖和果糖消耗及乙醇产量。每份样品在6720× g下离心3分钟，上清液经0.45 µm尼龙膜过滤。滤液于−20°C保存待分析。挥发性代谢组在培养24小时后从残余培养基中测定。
【数据】YPD培养基：果糖90 g/L、葡萄糖10 g/L、酵母提取物10 g/L、酪蛋白胨20 g/L；M2培养基：果糖90 g/L、葡萄糖10 g/L、酵母提取物1 g/L、(NH₄)₂SO₄ 2 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.4 g/L、KH₂PO₄ 5 g/L；pH：5；体积：150 mL；温度：28°C；转速：150 rpm；初始密度：单培养1×10⁶ cells/mL、二元共培养5×10⁵ cells/mL/株、三元共培养3.3×10⁵ cells/mL/株；监测间隔：3h；总时长：24h；离心：6720×g，3min；滤膜：0.45 µm尼龙膜；保存温度：−20°C
2.3 分析技术
#### 2.3.1 酵母生长测定
通过活菌计数确定种群生长。单培养样品使用MGYP琼脂平板（葡萄糖10 g/L、酪蛋白胨5 g/L、麦芽提取物3 g/L、酵母提取物3 g/L、琼脂20 g/L）。共培养样品使用Wallerstein实验室营养琼脂（MilliporeSigma，美国马萨诸塞州Billerica），该培养基可根据形态学特征区分酵母菌种。
【数据】MGYP琼脂：葡萄糖10 g/L、酪蛋白胨5 g/L、麦芽提取物3 g/L、酵母提取物3 g/L、琼脂20 g/L；共培养计数培养基：Wallerstein营养琼脂
#### 2.3.2 糖消耗与乙醇产量测定
葡萄糖和果糖消耗以及乙醇产量采用高效液相色谱法测定，仪器为Agilent 1200系列HPLC系统（Agilent Technologies Inc.，美国加利福尼亚州Santa Clara）。色谱仪配备Aminex HPX-87H色谱柱（300 mm × 7.8 mm，Bio-rad Laboratories, Inc.，美国加利福尼亚州Hercules），以5 mM H₂SO₄为流动相，流速0.6 mL/min。柱温维持在60°C，采用示差折光检测器检测，检测器温度设为45°C。使用外标构建校准曲线进行定量。HPLC级葡萄糖和果糖购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州St. Louis），纯度≥99%。乙醇购自CTR Scientific（墨西哥瓜达拉哈拉），纯度≥99.5%。每份适当稀释的样品进样1微升，所有样品均三次重复分析。
【数据】色谱柱：Aminex HPX-87H（300 mm × 7.8 mm）；流动相：5 mM H₂SO₄；流速：0.6 mL/min；柱温：60°C；检测器温度：45°C；进样量：1 µL；标准品纯度：葡萄糖/果糖≥99%、乙醇≥99.5%；重复次数：3
#### 2.3.3 挥发性化合物的鉴定与半定量
发酵结束（培养24小时）时存在的挥发性化合物采用HS-SPME/GC-MS进行鉴定，操作步骤参照Acosta-García等人所述方法。简要流程如下：离心过滤后，取5 mL滤液转移至微萃取瓶中。随后加入1.5 g NaCl和50 µL 1-戊醇溶液（300 mg/L）作为内标。混合物在35°C水浴中孵育5分钟。将50/30 µm DVB/CAR/PDMS纤维头（Supelco，美国密苏里州St. Louis）暴露于顶空60分钟，温度35°C。萃取完成后，将纤维头置于Agilent 7890A气相色谱仪进样口，于250°C解吸10分钟。化合物使用FFAP色谱柱（30 m × 250 mm × 0.25 µm）分离。载气为超高纯氦气，流速1 mL/min。柱温箱初始温度40°C保持3分钟，然后以3°C/min升至52°C保持1分钟，最后以10°C/min升至200°C保持15分钟。质谱仪（Agilent 5975C）在230°C下运行，电离电压70 eV，采用Scan模式（每秒1.6次扫描）。
挥发性化合物的鉴定按照Acosta-García等人所述方法进行。使用AMDIS软件（v. 2.73, build 149.31）对质谱图进行解卷积，结果与NIST 2011谱库比对，匹配值≥80%。同时，基于C7–C30烷烃梯标计算保留指数，并与NIST数据库（https://webbook.nist.gov/chemistry/name-ser/，访问日期：2026年3月30日）报道值进行比较。
挥发性化合物的半定量基于内标质量，采用以下方程计算：
Cx = Ci × Ax/Ai
其中Cx为未知分析物的浓度（mg/L），Ci为内标浓度（mg/L），Ax为未知分析物的峰面积，Ai为内标的峰面积。该方程获得的浓度是基于内标响应的半定量估计值，不应解释为绝对浓度。随后，各化合物的丰度表示为相对于1 µg/L 1-戊醇（内标）的等效质量。尽管该方法具有半定量性质，但它为比较代谢物水平和识别实验条件间的统计学显著差异提供了可靠基础。
【数据】样品量：5 mL滤液；NaCl：1.5 g；内标：50 µL 1-戊醇（300 mg/L）；孵育：35°C，5min；萃取纤维：50/30 µm DVB/CAR/PDMS；顶空萃取：35°C，60min；解吸：250°C，10min；色谱柱：FFAP（30 m × 250 mm × 0.25 µm）；载气：超高纯氦气，1 mL/min；升温程序：40°C（3min）→3°C/min至52°C（1min）→10°C/min至200°C（15min）；质谱：230°C，70 eV，Scan模式；谱库匹配阈值：≥80%
2.4 相对嗅觉活性值（rOAV）计算
为评估微生物竞争和营养限制对香气产生的影响，每种挥发性化合物的气味阈值和香气描述符数据来自在线数据库（https://thegoodscentscompany.com；https://www.femaflavor.org；https://www.flavornet.org）及前期研究。计算两个水平的气味活性值：rOAV用于基于检测阈值确定各化合物的个体效力，ROAV用于建立芳香重要性的层级排序。rOAV为直接比值，而ROAV为归一化值——混合物中影响最大的化合物被标定为100。rOAV和ROAV值依据Jiang等人方法，使用以下方程计算：
rOAVi = Ci/OTi
ROAVi = rOAVi/rOAVmax × 100
其中rOAVi为化合物i的相对嗅觉活性（无量纲），Ci为化合物i的相对浓度（mg/L），OTi为化合物i对应检测阈值的浓度（mg/L），ROAVi为化合物i相对于样品中最高浓度化合物的归一化相对嗅觉活性（无量纲），rOAVmax为样品中记录的最大rOAV值，代表芳香影响最大的化合物（无量纲）。
【数据】rOAV计算公式：rOAVi = Ci/OTi；ROAV计算公式：ROAVi = rOAVi/rOAVmax × 100
2.5 统计分析
采用多元统计分析确定发酵中的关键挥发性化合物。主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）、以2为底的对数倍数变化（Log2(FC)）和变量投影重要性（VIP）使用MetaboAnalyst 6.0（https://www.metaboanalyst.ca/）进行。数据通过求和归一化，并通过中心化均值和除以各变量标准差进行缩放。为判别关键化合物，将单培养与其对应的共培养进行匹配，鉴定VIP ≥ 1、Log2(FC) ≥ 1且p值≤ 0.05的化合物。
【数据】筛选阈值：VIP ≥ 1；Log2(FC) ≥ 1；p ≤ 0.05
研究结果
本研究聚焦于两种胁迫（营养限制和微生物竞争）的组合如何影响马克斯克鲁维酵母的生长和挥发性化合物产生。营养限制通过两种培养基进行研究：（1）M2培养基，设计用于模拟稀释龙舌兰汁的特征，被视为营养受限条件；（2）改良YPD培养基，被视为营养丰富条件。与营养丰富的YPD培养基相比，M2代表更严格的营养环境。酵母提取物降低10倍以及完全省去酪蛋白胨，严重限制了复杂有机氮、游离氨基酸、维生素和微量元素的可用性，从而建立了受控的营养限制模型。微生物竞争通过二元和三元组合共培养（与酿酒酵母和戴尔有孢圆酵母）诱导。每种酵母菌株的单培养作为对照。
3.1 微生物竞争和营养限制对马克斯克鲁维酵母生长的影响
图1A显示了马克斯克鲁维酵母在YPD和M2培养基中单培养和共培养条件下的生长情况。在YPD培养基中，所有培养物的生物量均高于M2培养基（图1A）。M2培养基仅在最初6小时培养期间支持了与YPD相当的生长。9小时后，马克斯克鲁维酵母单培养的生物量高于共培养，后者生长明显减少。图1B可观察到，酿酒酵母的存在降低了最大生长量（Xmax）；这在M2培养基中尤为显著，凡有酿酒酵母参与的培养物获得的细胞密度更低（Km/Sc = 1.414 ± 0.012 Log CFU/mL，Km/Sc/Td = 1.701 ± 0.031 Log CFU/mL），低于马克斯克鲁维酵母单培养（1.837 ± 0.015 Log CFU/mL）。该效应可能与营养受限条件下酵母间的竞争有关。
相反，在YPD培养基中，酿酒酵母的存在并未显著降低马克斯克鲁维酵母的存活率（图1B）。在营养丰富的YPD培养基中，马克斯克鲁维酵母在混合培养中的比生长速率高于单培养（图1C），提示在资源不受限时可能存在代谢协同或序贯营养利用。反之，在M2培养基中，马克斯克鲁维酵母的生物量和比生长速率急剧下降（尤其是在酿酒酵母存在时），表明有机营养限制加剧了竞争排斥。
酿酒酵母对马克斯克鲁维酵母的抑制作用此前已在枸橼、合成培养基和龙舌兰汁中观察到。然而，其他研究表明马克斯克鲁维酵母可以与酿酒酵母共存甚至受益于共培养。例如，含有固定化马克斯克鲁维酵母和酿酒酵母细胞的混合培养比单培养产生更高的乙醇。此外，有报道称马克斯克鲁维酵母分泌裂解酶可降低酿酒酵母的存活率。
与和酿酒酵母的互作相反，马克斯克鲁维酵母在与戴尔有孢圆酵母共培养时，在两种培养基中均表现出更好的生长（图1B）。尽管非酿酒酵母物种间的竞争通常被认为不太激烈，但混合培养与发酵饮料感官品质的改善相关。
在M2培养基的三元联合体中，马克斯克鲁维酵母比与酿酒酵母的二元培养保持了更高的存活率。虽然无法在没有直接代谢通量分析的情况下明确确认机制，但这种部分拯救效应可能归因于生态位重叠，或马克斯克鲁维酵母利用了戴尔有孢圆酵母死亡后释放的代谢物。微生物物种间的代谢交换是一种常见现象，涉及氨基酸、核苷酸和其他代谢物的交换，从而支持联合体内某些物种的生存。
系统发育距离被认为会影响物种间互作。亲缘关系近的物种往往表现出相似的营养消耗模式，这可能加剧竞争。酿酒酵母和戴尔有孢圆酵母彼此之间的系统发育关系比它们与马克斯克鲁维酵母的关系更近。这种关系可能解释了酿酒酵母与戴尔有孢圆酵母之间更强的抑制性互作，以及酿酒酵母与马克斯克鲁维酵母之间较低的竞争。然而，Pourcelot等人强调其他机制也对这些互作有所贡献，并得出结论：物种决定互作类型，而菌株调节互作强度。
图1D–F展示了葡萄糖和果糖消耗及乙醇产量。值得注意的是，M2培养基中的所有发酵均未实现完全糖消耗。在此条件下，三元共培养表现出最高的残余果糖浓度（55.37 ± 1.80 g/L；图1D），而马克斯克鲁维酵母单培养表现出最高的残余葡萄糖浓度（4.17 ± 0.48 g/L；图1E）。这些差异反映在乙醇产量上（图1F）。马克斯克鲁维酵母与酿酒酵母的共培养获得了最高乙醇产量（15.32 ± 1.00 g/L）。相比之下，三元共培养在M2培养基中产生的乙醇最低（8.45 ± 0.30 g/L）。相反，YPD培养基中的所有发酵均实现了完全糖消耗。葡萄糖约在15小时耗尽，而果糖约在18小时仍可检测到。因此，这些条件下的乙醇产量更高。与M2培养基中观察到的结果不同，YPD中的三元共培养产生了最高乙醇浓度（48.60 ± 2.32 g/L）。类似地，Nolasco-Cancino等人报道马克斯克鲁维酵母单培养在72小时后消耗了龙舌兰汁中高达90%的糖，且酿酒酵母的存在提高了乙醇生产效率。
总体而言，图1所示结果表明马克斯克鲁维酵母可以耐受单一胁迫条件（竞争或营养限制）。然而，两种胁迫类型的组合导致培养9小时后细胞存活率下降约20%。该效应可能归因于M2培养基的营养含量有限，而非仅氮素可用性——因为锌和镁等微量元素对高效发酵至关重要。然而，使用合成培养基存在显著局限性，因为它们不能完全复制工业发酵环境的复杂性。天然底物（如龙舌兰汁、葡萄汁或其他发酵基质）含有多种碳源和氮源、微量元素、抑制性化合物和本地微生物群落，这些都可能影响种群动态和挥发性化合物的产生。
【数据】M2培养基中最大生长量：Km单培养=1.837 ± 0.015 Log CFU/mL，Km/Sc=1.414 ± 0.012 Log CFU/mL，Km/Sc/Td=1.701 ± 0.031 Log CFU/mL；M2残余果糖：三元共培养=55.37 ± 1.80 g/L；M2残余葡萄糖：Km单培养=4.17 ± 0.48 g/L；M2乙醇产量：Km/Sc=15.32 ± 1.00 g/L，三元共培养=8.45 ± 0.30 g/L；YPD乙醇产量：三元共培养=48.60 ± 2.32 g/L；存活率下降：约20%（培养9h后）
3.2 马克斯克鲁维酵母产生的挥发性代谢组
共鉴定出90种挥发性有机化合物（VOCs）（表S1），包括1种缩醛、7种酸、15种醇、7种酮和醛、28种酯、9种吡嗪、13种萜烯和10种其他VOCs（呋喃、酚类、甲硫醚、内酯、羟基酯和吡咯）。壬酸、1-丙醇、丁酸乙酯、香芹酚和百里香酚的色谱峰在某些样品中存在重叠（表S2），因此被排除在统计分析之外。挥发性化合物在培养24小时时进行分析。虽然这种单时间点方法无法捕捉整个发酵过程中代谢物产生和消耗的动力学变化，但之所以选择该时间点，是因为酒精发酵结束时的挥发性代谢组最具相关性。
在M2培养基中进行的发酵表现出比YPD培养基更少的VOCs数量和更低的总浓度（图2A）。
【数据】VOCs总数：90种（1种缩醛、7种酸、15种醇、7种酮/醛、28种酯、9种吡嗪、13种萜烯、10种其他）；排除化合物：壬酸、1-丙醇、丁酸乙酯、香芹酚、百里香酚（峰重叠）；分析时间点：24h
讨论与解读
本研究表明，马克斯克鲁维酵母在单一胁迫条件下（微生物竞争或营养限制）能够维持生长，但两种胁迫叠加时细胞存活率下降约20%。营养丰富的YPD培养基支持更高的生物量和更稳定的挥发性化合物谱，有利于批次间一致性——这对葡萄酒或梅斯卡尔酒生产至关重要。而营养限制与竞争的组合虽抑制生长，却显著增加了芳香多样性，特别是乙酸苯乙酯、辛酸乙酯和己酸乙酯的合成。这一发现揭示了环境胁迫与挥发性谱复杂度发展之间的关联，为利用胁迫诱导的挥发性代谢组变化优化传统发酵的感官特征提供了新思路。
编译者解读
从合成生物学应用角度看，该研究的价值在于系统解耦了"营养限制"与"微生物竞争"两类胁迫因子对风味代谢的独立与叠加效应。其方法学亮点在于采用模拟龙舌兰汁的M2培养基与丰富YPD培养基的对比设计，为工业发酵条件优化提供了可操作的实验范式。值得注意的是，胁迫诱导的特定酯类（乙酸苯乙酯、辛酸乙酯、己酸乙酯）显著上调，提示可通过精准调控培养条件定向富集目标风味化合物。然而，单时间点采样（24h）无法捕捉挥发性代谢物的动态变化轨迹，半定量方法也限制了绝对浓度的可比性。未来可结合代谢通量分析和实时监测，进一步解析胁迫信号如何重塑酯类合成通路。
参考来源
Acosta-García ED, Páez-Lerma JB, Moreno-Jiménez MR, Cortés-Barberena E, Rojas-Contreras JA. Microbial Competition and Nutrient Limitation Remodel the Volatilome of Kluyveromyces marxianus. J Fungi (Basel). PMID: 42506232.
PMID: 42506232