来源：Transporter Engineering for Enhancing Citric Acid Production in Aspergillus niger.（J Fungi (Basel)）| 编译：DNA Lab Space
导读
柠檬酸是全球产量最大的有机酸之一，黑曲霉（Aspergillus niger）是其工业生产的核心菌株。底物摄取与产物外排是限制柠檬酸合成效率的两大瓶颈。本研究采用转运蛋白工程策略，对黑曲霉内源高亲和力葡萄糖转运蛋白MstF与柠檬酸外排蛋白CexA进行过表达改造，通过"推-拉"协同策略同时强化葡萄糖摄入与柠檬酸外排。摇瓶筛选与30 L发酵罐放大实验表明，mstF与cexA共过表达菌株A5柠檬酸产量达185.91 g/L，生产强度3.21 g/h/L，发酵周期缩短，为工业柠檬酸生产提供了新方案。
研究背景
黑曲霉是全球柠檬酸工业生产的核心菌株，以玉米淀粉为原料，可在35–37°C条件下60–80 h内产柠檬酸180–200 g/L。全玉米粉营养丰富，几乎提供黑曲霉柠檬酸发酵所需的全部营养。工业生产中，提高产量、缩短发酵周期以降低成本、提升效率已成为首要目标。随着对柠檬酸合成机制的深入理解和组学技术的发展，利用代谢工程策略改造黑曲霉以获得高产柠檬酸工程菌株已成为核心策略。这些策略主要包括：（1）增强糖酵解途径代谢通量以增加前体丰度；（2）阻断副产物形成；（3）调控NAD(H)循环并解除ATP反馈抑制；（4）改造转运蛋白以增强底物摄入和柠檬酸外排。目前，转运蛋白工程是提高代谢产物产量、降低下游提取成本的重要策略。碳源摄取和胞内代谢物外排是工业微生物发酵的两大瓶颈。
研究方法
2.1 菌株、质粒与培养基
本研究所用工程黑曲霉菌株和质粒详细信息见表S1和S2。工业黑曲霉CGMCC 10142作为柠檬酸高产菌株，为亲本菌株。大肠杆菌DH5α用于质粒构建、扩增和保存。根癌农杆菌AGL1用于转化过程中将T-DNA（含目标基因）转移至黑曲霉。大肠杆菌和根癌农杆菌在LB培养基中培养。黑曲霉在指定培养基中或培养基上培养。PDA培养基用于获取分生孢子。完全培养基（CM）用于转化子筛选，视需要添加200 μg/mL潮霉素B和/或25 μg/mL博来霉素。液化玉米培养基用作柠檬酸发酵培养基，初始总糖浓度为180 g/L。种子培养基的矿物质元素组成如下：FeSO4·7H2O 30 mg/L，CaCl2·2H2O 10 mg/L，MnCl2·4H2O 7 mg/L，CuSO4·5H2O 0.3 mg/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，ZnSO4·7H2O 10 mg/L，KH2PO4 0.3 g/L。
【数据】菌株：黑曲霉CGMCC 10142、大肠杆菌DH5α、根癌农杆菌AGL1；潮霉素B浓度：200 μg/mL；博来霉素浓度：25 μg/mL；初始总糖浓度：180 g/L
2.2 质粒制备
gas启动子（Pgas）、mstF基因及终止子（mstF，TmstF）、glaA启动子（PglaA）、cexA基因及终止子（cexA，TcexA）、ku70上下游同源臂（ku70 up、ku70 down）以及agdA上下游同源臂（agdAup、agdAdown）均从黑曲霉CGMCC 10142基因组中克隆获得。博来霉素（ble）和潮霉素B（hyg）筛选标记分别从质粒p44和p60克隆。mstF和cexA表达盒通过重叠PCR构建。质粒p44用EcoRI和HindIII酶切。p44酶切片段与表达盒使用Clon Express MultiS One Step Cloning Kit（Vazyme，南京）连接，生成p94和p95（图S1）。用于质粒构建的所有引物列于表S3。
【数据】限制性内切酶：EcoRI、HindIII；克隆试剂盒：Clon Express MultiS One Step Cloning Kit（Vazyme）
2.3 工程黑曲霉的构建与初步筛选
重组菌株通过农杆菌介导转化法（ATMT）构建。简言之，p94或p95中的目标基因表达盒通过ATMT整合到黑曲霉基因组中。重组菌株可在含博来霉素和/或潮霉素B的CM培养基上轻松分离。随后，通过PCR扩增过表达盒验证转化子。与mstF过表达相关的转化子在低葡萄糖（0.05%）和0.2%碳酸钙（CaCO3）的CM培养基中进一步筛选（表S4和S5）。具体操作如下：将转化子在CM+潮霉素培养基上生长的新鲜菌丝转移至CM（0.05%葡萄糖）+0.2% CaCO3平板，37°C孵育72 h。通过比较透明水解圈直径与菌落直径的比值评估菌株的柠檬酸产量。酸蚀圈越大，表明产酸潜力越大。随后，制备合适转化子的孢子悬浮液进行摇瓶发酵。
将筛选出的转化子在CM培养基上传代15代后，提取基因组DNA验证其遗传稳定性。此外，重新检测摇瓶发酵中的柠檬酸产量。
【数据】葡萄糖浓度：0.05%；CaCO3浓度：0.2%；温度：37°C；时间：72h；传代次数：15代
2.4 摇瓶与发酵罐培养
摇瓶培养流程：将1 × 10⁵个孢子/mL接种于500 mL锥形瓶中的50 mL培养基内。摇瓶培养条件为37°C、300 rpm、72 h。选择摇瓶中柠檬酸滴度最高的重组菌株进行30 L发酵罐放大。
发酵罐培养流程：将1 × 10⁵个孢子/mL接种到含3 L种子培养基的5 L种子罐中。种子罐培养条件为35°C、转速300 rpm、通气量330 L/h、培养24 h。随后将培养物以10%接种量转移至含20 L发酵培养基的30 L发酵罐中。发酵过程维持35°C、转速350 rpm、通气量400 L/h，持续64 h。相关指标从接种后0 h开始测定。整个发酵过程在全自动控制条件下运行，所有参数实时监测。
另外，将1 × 10⁵个黑曲霉孢子接种到含50 mL CM培养基的250 mL锥形瓶中，于35°C、200 rpm条件下培养。在指定时间点采集样品，测定高亲和力葡萄糖转运蛋白的相对转录水平。
【数据】摇瓶：1×10⁵孢子/mL，50 mL/500 mL锥形瓶，37°C，300 rpm，72h；种子罐：3 L培养基，35°C，300 rpm，330 L/h，24h；30 L发酵罐：20 L培养基，10%接种量，35°C，350 rpm，400 L/h，64h
2.5 有机酸、糖和生物量的测定
发酵液在4°C、12,000 rpm条件下离心10 min。上清液经0.22 μm无菌滤膜过滤。柠檬酸含量采用高效液相色谱法（HPLC）测定，使用Aminex HPX-87H色谱柱（Bio-Rad，天津），紫外检测，流动相为5 mM H2SO4，流速0.6 mL/min。HPLC进样量设为10 μL，柱温设为60°C。配制不同浓度的无水柠檬酸标准溶液，在相同条件下测定并绘制标准曲线。根据峰面积通过线性回归分析计算发酵样品中柠檬酸浓度。总糖和还原糖含量采用3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定。简要步骤如下：取1 mL稀释上清液和1 mL DNS试剂，沸水浴5 min，冷却至室温。随后测定540 nm（A540）处的吸光度以确定还原糖含量。上清液中总糖需加入等体积6 mol/L HCl，沸水浴加热30 min，调节pH至中性，随后通过DNS法测定。标准品测定采用相同程序。发酵罐培养期间测定干重细胞量（DCW）时，取50 mL发酵液过滤至预称重滤纸上，60°C干燥至恒重。
发酵结果的计算公式如下：柠檬酸滴度=发酵液中柠檬酸浓度（g/L）。表观糖酸转化率=柠檬酸浓度/总糖浓度（g/g）。柠檬酸生产强度=柠檬酸浓度/发酵时间（g/L/h）。
【数据】离心：4°C，12,000 rpm，10 min；HPLC：Aminex HPX-87H柱，5 mM H2SO4，0.6 mL/min，进样10 μL，柱温60°C；DNS法：沸水浴5 min，A540；总糖水解：6 mol/L HCl，沸水浴30 min；DCW：50 mL发酵液，60°C干燥至恒重
2.6 相对转录水平测定
培养至指定时间后，收集黑曲霉新鲜菌丝体，用滤纸洗涤并真空抽滤。湿菌体饼在液氮中速冻，用研钵和研杵研磨成粉末。使用真菌RNA提取试剂盒（Coolaber，北京）按照制造商说明书提取总RNA。总RNA用HiScript III RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）（Vazyme，南京）逆转录为cDNA。使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme，南京）进行逆转录定量PCR（RT-qPCR）以定量目标基因的转录水平。相对转录水平通过2−ΔΔCt方法计算。本研究所用RT-qPCR引物列于表S3。黑曲霉内参基因actA作为参考基因。
【数据】RNA提取试剂盒：Fungal RNA Extraction Kit（Coolaber）；逆转录：HiScript III RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）；qPCR：ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix；定量方法：2−ΔΔCt；内参基因：actA
2.7 统计分析
本研究的实验和测定均进行三次重复。所有数据以平均值或平均值±标准差表示。使用Origin 2024软件包进行统计分析。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行统计检验，并使用Tukey事后检验，置信区间为95%。星号表示显著性差异：表示p < 0.05；表示p < 0.01；表示p < 0.001。
【数据】重复次数：n=3；软件：Origin 2024；统计方法：one-way ANOVA + Tukey事后检验，95%置信区间
研究结果
3.1 高亲和力葡萄糖转运蛋白的筛选
葡萄糖摄取和转化影响胞内柠檬酸合成速率，增加葡萄糖转运显著提高了黑曲霉的柠檬酸产量。迄今为止，黑曲霉中已鉴定出多个关键转运蛋白，包括低亲和力葡萄糖转运蛋白MstC，以及高亲和力葡萄糖转运蛋白MstA、MstE、MstF、MstG和MstH。高亲和力与高容量表现出明显的互斥性。增加单个高亲和力转运蛋白的数量可以达到与低亲和力系统相当的摄取速率。为鉴定CGMCC 10142中哪些高亲和力葡萄糖转运蛋白在低葡萄糖条件下被高度诱导，我们分析了CGMCC 10142在低葡萄糖CM培养基上生长时五种高亲和力葡萄糖转运蛋白（MstA、MstE、MstF、MstG、MstH）的葡萄糖消耗和相对转录水平（图1A、B）。mstA、mstF和mstH基因在葡萄糖耗尽时表达（图1A、B），其中mstF表现出显著差异。先前研究结果表明，mstF在葡萄糖耗尽时被高度诱导。最终，选择高亲和力葡萄糖转运蛋白MstF作为提高葡萄糖摄取的目标。
【数据】菌株：CGMCC 10142；培养基：低葡萄糖CM培养基；差异表达基因：mstA、mstF、mstH；显著差异基因：mstF
3.2 工程菌株的构建
两个载体通过ATMT导入黑曲霉，并筛选转化子。转化子在含博来霉素和/或潮霉素B的CM培养基上培养三代。最终筛选获得13个mstF过表达转化子、5个cexA过表达转化子和14个mstF/cexA共过表达转化子。如图S2–S4所示，mstF和/或cexA表达盒随机整合到转化子基因组中，经PCR进一步确认。对于mstF过表达相关转化子，通过计算透明圈直径与菌落直径的比值筛选优良转化子（表S4和S5）。最终通过平板筛选获得5个cexA过表达转化子（图1C）、6个mstF过表达转化子（图1D）和14个mstF/cexA共过表达转化子（图1E）。这些重组菌株（图1C–E）随后在液化玉米培养基中进行柠檬酸摇瓶发酵，进一步鉴定其柠檬酸生产能力。cexA过表达重组菌株p94-13的柠檬酸滴度仅与CGMCC 10142相当，而其他所有重组菌株的滴度均低于CGMCC 10142（图1C）。mstF过表达重组菌株H7的柠檬酸滴度较CGMCC 10142提高4.7%，达到124.75 g/L（图1D）。mstF/cexA共过表达重组菌株A5的柠檬酸滴度较CGMCC 10142提高7.6%，达到131.57 g/L（图1E）。因此，选择菌株p94-13（cexA过表达）、H7（mstF过表达）和A5（mstF/cexA共过表达）进行30 L发酵罐放大。此外，菌株p94-13、H7和A5传代15代，通过验证mstF表达盒和cexA表达盒确认了菌株的遗传稳定性，如图S7所示。
【数据】转化子数量：mstF过表达13个、cexA过表达5个、共过表达14个；H7柠檬酸滴度：124.75 g/L（较对照提高4.7%）；A5柠檬酸滴度：131.57 g/L（较对照提高7.6%）；传代：15代
3.3 mstF诱导过表达提高葡萄糖消耗和柠檬酸产量
高效的葡萄糖转运系统是增加柠檬酸合成通量的基础。然而，柠檬酸发酵中的高初始糖浓度抑制了高亲和力转运系统。增加高亲和力葡萄糖转运蛋白的数量可提高葡萄糖转运效率。因此，在低pH诱导型启动子Pgas下过表达mstF，在"推"效应下增强了柠檬酸合成通量（图2A）。在工业黑曲霉柠檬酸发酵中，转录组分析显示Pgas启动子在低pH（2.0）下高效发挥功能，且Pgas强度仅与pH相关。
比较H7与CGMCC 10142的发酵过程，溶解氧（DO）变化趋势几乎相同（图S8A）。两种菌株的溶解氧均在10 h内迅速下降至最低值，并在整个发酵过程中维持在低水平。pH持续下降，最终达到1.5（图S8B）。柠檬酸产量测定显示，H7的最终柠檬酸滴度较CGMCC 10142提高6.41%，达到179.35 g/L（图2B）。经计算，H7的表观糖酸转化率为0.99 g/g，生产强度为2.80 g/h/L。糖消耗监测显示，与CGMCC 10142相比，H7提高了糖利用速率和效率（图2C、D）。H7的总糖利用率较CGMCC 10142提高24.72%，残留总糖仅为5.31 g/L，表明MstF可以在提高转化效率的同时改善发酵性能。发酵过程中可以观察到，H7形成了与CGMCC 10142相当的菌丝球和生物量（图2E、F），说明MstF对黑曲霉的生长和形态没有影响。转录分析显示（图2G），H7中mstF、pdh、pc、cs、cexA和aox基因的相对表达水平分别是CGMCC 10142的21.85、1.65、1.09、3.54、1.39和1.17倍。cs的转录水平显著升高，但cexA没有显著变化，因此推测胞内柠檬酸外排限制了H7的柠檬酸产量潜力。总之，mstF过表达成功提高了柠檬酸滴度和表观糖酸转化率。
【数据】H7柠檬酸滴度：179.35 g/L（较对照提高6.41%）；表观糖酸转化率：0.99 g/g；生产强度：2.80 g/h/L；残留总糖：5.31 g/L（总糖利用率提高24.72%）；pH终值：1.5；基因相对表达倍数：mstF 21.85倍、pdh 1.65倍、pc 1.09倍、cs 3.54倍、cexA 1.39倍、aox 1.17倍
3.4 cexA过表达损害菌丝球形态并降低柠檬酸产量
柠檬酸从胞内到胞外的外排也是工业生产中的瓶颈。将胞内柠檬酸迅速分泌到胞外可消除柠檬酸积累引起的反馈抑制。因此，使用诱导型启动子PglaA过表达cexA，在"拉"效应下改善柠檬酸分泌（图3A）。
CGMCC 10142和cexA过表达菌株p94-13在整个发酵过程中的溶解氧曲线几乎相同（图S8C）。两种菌株均在10 h内达到最低DO。然而，p94-13发酵中期的溶解氧水平开始逐渐上升。pH持续下降至终值1.5（图S8D）。遗憾的是，p94-13在柠檬酸滴度上没有表现出预期的改善。柠檬酸产量测定显示，p94-13的最终柠檬酸滴度较CGMCC 10142低9.2%，为152.99 g/L（图3B）。p94-13的表观糖酸转化率为0.85 g/g，生产强度为2.39 g/h/L。残糖水平显示p94-13的糖消耗速率低于CGMCC 10142（图3C、D）。发酵结束后，p94-13的残留总糖达到27.56 g/L，较CGMCC 10142增加87.48%。在每个检测时间点均可观察到，p94-13形成更松散的菌丝球，菌丝伸长且顶端分枝更多，并产生比CGMCC 10142更多的生物量（图3E、F）。发酵结束后，生物量测定显示p94-13的最终DCW较CGMCC 10142高53.69%，达到34.07 g/L（图3E），说明CexA对黑曲霉的生长和形态有影响。表型分析显示，cexA过表达导致黑曲霉菌落生长缺陷（图S6）。因此，这些发现提供了明确证据，表明cexA表达水平可能影响黑曲霉的正常代谢。
随后，关键基因的转录分析进一步确认了CexA对胞内代谢的影响。转录分析显示（图4），p94-13中mstF、pdh、pc、cs、cexA和aox基因的相对表达水平分别是CGMCC 10142的0.54、0.74、0.69、0.44、5.91和0.30倍。cexA的转录水平显著升高，但mstF、pdh、pc、cs和aox的转录水平均显著降低。这些结果表明，cexA的过表达扰乱了中心碳代谢相关基因的正常转录调控，进而影响了柠檬酸的合成效率。
【数据】p94-13柠檬酸滴度：152.99 g/L（较对照低9.2%）；表观糖酸转化率：0.85 g/g；生产强度：2.39 g/h/L；残留总糖：27.56 g/L（较对照增加87.48%）；DCW：34.07 g/L（较对照高53.69%）；pH终值：1.5；基因相对表达倍数：mstF 0.54倍、pdh 0.74倍、pc 0.69倍、cs 0.44倍、cexA 5.91倍、aox 0.30倍
3.5 mstF和cexA共过表达提高柠檬酸产量和发酵效率
单独的"推"（mstF过表达）或"拉"（cexA过表达）策略均未能实现柠檬酸产量的最佳提升。基于上述结果，我们推测同时增强葡萄糖摄入和柠檬酸外排可能平衡胞内柠檬酸的积累与分泌，从而进一步提高柠檬酸产量。因此，构建了mstF和cexA共过表达菌株A5（图5A）。
在30 L发酵罐中，A5的柠檬酸产量测定显示，其最终柠檬酸滴度达到185.91 g/L，较CGMCC 10142提高10.29%（图5B）。经计算，A5的表观糖酸转化率为0.99 g/g，生产强度为3.21 g/h/L。糖消耗监测显示，A5的糖利用速率和效率均优于CGMCC 10142（图5C、D）。发酵结束后，A5的残留总糖为6.12 g/L，较CGMCC 10142降低显著。形态学观察显示，A5形成了致密的菌丝球，与CGMCC 10142的形态相似（图5E、F），表明mstF和cexA共过表达未对菌丝球形态造成明显损害。转录分析显示（图5G），A5中mstF、pdh、pc、cs、cexA和aox基因的相对表达水平分别是CGMCC 10142的19.87、1.42、1.18、2.76、3.42和1.05倍。与单独过表达cexA的p94-13相比，A5中cs和pdh的转录水平显著恢复，表明mstF的共过表达部分补偿了cexA过表达对中心碳代谢基因转录的负面影响。与单独过表达mstF的H7相比，A5中cexA的转录水平显著提高，促进了柠檬酸的外排。这些结果表明，mstF和cexA的协同过表达实现了"推-拉"策略的有效平衡，从而提高了柠檬酸产量和发酵效率。
【数据】A5柠檬酸滴度：185.91 g/L（较对照提高10.29%）；表观糖酸转化率：0.99 g/g；生产强度：3.21 g/h/L；残留总糖：6.12 g/L；基因相对表达倍数：mstF 19.87倍、pdh 1.42倍、pc 1.18倍、cs 2.76倍、cexA 3.42倍、aox 1.05倍
讨论与解读
讨论
葡萄糖的胞内摄入是黑曲霉柠檬酸合成的潜在瓶颈。大量碳通量通过糖酵解途径是高效柠檬酸合成的基本前提，因为它提供了充足的前体。要实现高效的糖酵解，需要高效的葡萄糖转运系统。本研究所构建的重组菌株在柠檬酸发酵的发酵强度和糖酸转化方面均表现出改善。这些结果强调了高亲和力葡萄糖转运蛋白加速了葡萄糖的摄入。CS的上调促进了柠檬酸的积累。然而，cexA转录水平的微量增加进一步限制了高效的柠檬酸生产。尽管mstF高表达，但未观察到菌丝球形态的变化，表明MstF对菌丝球形态形成没有影响，这与CexA形成对比。
cexA过表达影响菌丝形态发生和关键基因的转录。增强的葡萄糖摄入增加了柠檬酸合成通量和柠檬酸积累。然而，柠檬酸的外排进一步限制了发酵潜力。本研究中，PglaA诱导的cexA菌株p94-13形成了菌丝伸长、顶端分枝增多的菌丝球，并表现出中心代谢关键基因的转录变化。胞质柠檬酸的降解是柠檬酸损失的主要来源之一。
编译者解读
本研究通过"推-拉"策略对黑曲霉柠檬酸生产进行转运蛋白工程改造，思路清晰且具有工业应用导向。mstF单过表达有效提升糖摄取和柠檬酸产量，而cexA单过表达虽增强外排但损害菌丝形态——这一发现提示柠檬酸外排蛋白的表达水平需要精细调控。最终共过表达菌株A5在30 L发酵罐中实现185.91 g/L产量和3.21 g/h/L生产强度，验证了协同策略的可行性。值得注意的是，本研究使用工业菌株CGMCC 10142作为底盘，其生产性能远高于实验室菌株，结果对工业放大更具参考价值。不足之处在于cexA过表达对菌丝形态的负面影响机制尚未完全解析，后续可通过启动子强度优化或定位改造进一步精细调控。
参考来源
Li J, Li M, Song Y, Xu Z, Chen Y. Transporter Engineering for Enhancing Citric Acid Production in Aspergillus niger. J Fungi (Basel). PMID: 42506234.
PMID: 42506234