B4GALT5缺陷损害糖鞘脂生物合成

📅 2026-08-16 📰 J Lipid Res 2026 Aug 📂 研究进展 👁 23

来源：B4GALT5 deficiency impairs glycosphingolipid biosynthesis: a new congenital disorder of glycosylation?（J Lipid Res）| 编译：DNA Lab Space

📎 相关工具：代谢通路设计

导读

糖鞘脂是细胞膜的重要组分，其合成始于乳糖神经酰胺（LacCer），由B4GALT5和B4GALT6两种半乳糖基转移酶催化生成。这两种酶在人体中的具体分工一直未被明确界定。本研究报道了首例B4GALT5基因双等位功能缺失变异的人类病例——一名表现为小头畸形、轻度认知障碍和双侧白内障的儿童。研究发现，患者携带的两种B4GALT5变异体均丧失LacCer合酶活性，导致血浆和成纤维细胞中糖鞘脂水平较健康对照降低约80%。更出人意料的是，人B4GALT6在模型细胞中表达量和催化活性均低于B4GALT5，引发对其代偿能力的质疑。

研究背景

LacCer作为糖鞘脂生物合成的核心前体，由B4GALT5和B4GALT6两种β-1,4-半乳糖基转移酶催化合成。然而，这两种酶在人体生理中的特异性功能长期以来缺乏清晰的遗传学证据。B4GALT5基因的纯合或复合杂合致病性变异此前从未在人类病例中被报道过，其在发育和神经系统功能中的必要性因此仍是未解之谜。

本研究通过一例临床病例——一名携带B4GALT5复合杂合变异的患儿——结合细胞模型、酶学分析和计算机结构预测，系统评估了这些变异的致病性及其对糖鞘脂生物合成的功能影响。

研究方法

化学试剂与材料

以下材料为商业购买：DMEM和FBS购自EuroClone Life Science Division；青霉素/链霉素、胰蛋白酶；蛋白酶抑制剂购自Roche Italia；SYBR Green系统购自Takara；ReliaPrep™ Miniprep RNA提取系统和GoScript逆转录混合物购自Promega；合成寡核苷酸购自Eurofins Genomics。化学试剂甲醇、氯仿、甲酸、乙酸、乙酸铵、甲酸铵、二丁基羟基甲苯（BHT）均为分析级，购自Sigma-Aldrich。所有水溶液均使用Milli-Q级纯水制备。脂质标准品购自Avanti Polar（由Sigma-Aldrich供应）。

细胞培养

HEK293T细胞和对照成纤维细胞按文献（8）方法培养。HeLa细胞在含10% FBS的高糖（4,500 mg/L）DMEM中培养。患者皮肤成纤维细胞为诊断目的获取，经书面知情同意和当地内部审查委员会（Telethon基金会，Telethon未诊断疾病项目）批准后用于研究。本研究所有工作符合《赫尔辛基宣言》原则。

遗传分析-测序

全外显子组测序（WES）未在已知疾病基因中检出致病变异，但发现B4GALT5基因的两个错义变异，经Sanger测序验证，每个变异分别遗传自父母一方：p.(Arg173His)变异（NM_004776: c.518G>A）和p.Gly274Arg（NM_0044776: c.820G>A）。

质粒构建

人B4GALT5和B4GALT6的编码序列通过PCR获得，使用从Huh-7或Hep-3B细胞提取的总RNA为模板，在Phusion Taq聚合酶（Thermo Fisher Scientific）存在下，使用含HindIII/SfgI（正向引物）和PmeI/XbaI（反向引物，下划线标记）酶切位点的特异性引物对（补充表S1）进行扩增。扩增程序如下：98°C初始变性30秒，30个循环（95°C 8秒，64°C 20秒，72°C 45秒），最后72°C延伸10分钟。小鼠b4galt6 cDNA按上述方法获得，使用Neuro2a细胞提取的RNA和含相同酶切位点的合适引物对（补充表S1）。获得的片段克隆至pCDNA3载体，扩增并按文献（8）方法测序，获得质粒pCDNA3-B4GALT5、pCDNA3-B4GALT6和pcDNA3-mb4galt6。使用QuikChange II-E定点突变试剂盒和报道的引物对（补充表S1）对pcDNA3-B4GALT5质粒进行突变，引物设计用于引入患者中发现的c.518G>A和c.820G>A突变，分别产生p.R173H和p.G274R酶变异体。

为将B4GALT5克隆至pCNA4载体，基因序列通过RT-PCR从HeLa细胞提取的总RNA扩增（补充表S1）。所得扩增子克隆至pCNA4的EcoRI和EcoRV位点，与C端Myc标签框内融合。利用pCNA4中存在的HindIII和BstEII位点，人和小鼠B4GALT6 cDNA也克隆至该载体以获得C端c-Myc标签（分别为pCNA4-B4GALT6和pCNA4-mb4galt6）。为此，以pcDNA3-B4GALT6或pcDNA3-mb4galt6为模板（各10 ng质粒，50 μl反应体积）进行PCR扩增，使用与上述相同的正向引物和设计为跳过终止密码子并引入BstEII位点的反向引物（补充表S1）。扩增条件与pcDNA3克隆相同，但仅使用22个PCR循环。获得的片段经纯化、酶切并克隆至预先经HindIII和BstEII酶切并胶回收的pCNA4载体，方法同pcDNA3克隆。患者突变随后通过定点突变引入pCNA4-B4GALT5，方法同前述pCDNA3中的操作。

此外，WT和变异B4GALT5以及人B4GALT6使用原始克隆引物对中存在的SfgI和PmeI位点（补充表S1，双下划线标记）亚克隆至pFN21载体（Promega），方法同文献（9）报道。如此，cDNA与N端Halo标签框内融合。

嵌合体构建

人B4GALT6的嵌合构建体以pCNA4-B4GALT6为起始材料，利用CMV启动子中的MluI位点和位于B4GALT6编码序列第142位核苷酸的XhoI位点（涉及密码子48-50）。经两种酶酶切和琼脂糖凝胶纯化后，获得包含载体主体和B4GALT6 cDNA的片段，带有MluI和XhoI粘性末端。以pCDNA3-B4GALT5质粒为模板扩增代表人B4GALT5前48个密码子的142 bp序列，使用报道的引物对（补充表S1），各引物分别含MluI和XhoI位点（下划线标记）。反应在Phusion热启动高保真Taq聚合酶（Thermofisher）存在下按供应商方案进行。扩增程序如下：98°C初始变性30秒，22个循环（95°C 8秒，64°C 20秒，72°C 25秒），最后72°C延伸10分钟。扩增片段经MluI和XhoI酶切、离心柱纯化，与相应末端的胶纯化线性质粒连接。所得构建体经测序，翻译序列见补充图S1A。该嵌合体前46个氨基酸命名为chi46-T5/T6，对应B4GALT5蛋白序列（包含胞质尾和跨膜结构域），第47和48位氨基酸为B4GALT5和B4GALT6共有（QA，补充图S1A中下划线标记），B4GALT6特有序列从第49位氨基酸开始。

其他嵌合体通过在pCNA4-B4GALT6编码序列第288位通过定点突变引入BspEI位点（TCCGGA）构建，将第96位密码子CTC改为CTT，仍编码赖氨酸。为此，使用QuickChange II试剂盒（Agilent）和补充表S1所示寡核苷酸进行突变，方法同我们之前报道（8）。

质粒pCNA4-B4GALT6（c.288C>T）经MluI和BspEI酶切，长片段经琼脂糖凝胶电泳分离。以pCDNA3-B4GALT5质粒为模板扩增代表人B4GALT5前103个密码子的308 bp序列，使用含MluI和BspEI位点（下划线标记）的合适引物对（补充表S1）。扩增方法同上述chi46-T5/T6嵌合体。扩增片段经MluI和BspEI酶切、离心柱纯化，与经MluI和BspEI酶切后胶纯化的线性质粒连接。所得构建体经测序，翻译序列见补充图S1A。该嵌合体前101个氨基酸命名为chi104-T5/T6，对应B4GALT5蛋白序列（包含胞质尾、跨膜结构域和茎区），第102-104位氨基酸（LPE，下划线标记）对应B4GALT6第96-98位氨基酸，为B4GALT5和B4GALT6共有，B4GALT6特有序列从第105位氨基酸开始，对应原始B4GALT6编码序列第99位氨基酸。

以pCDNA3-mb4galt6质粒为模板扩增代表小鼠b4galt6前96个密码子的290 bp序列，使用含MluI和BspEI位点（下划线标记）的引物对（补充表S1）。扩增和克隆方法同chi104-T5/T6。所得构建体经测序，翻译序列见补充图S1A。该嵌合体前85个氨基酸命名为chi97-mt6/T6，对应小鼠b4galt6蛋白序列（包含胞质尾、跨膜结构域和茎区），第86-97位氨基酸（SDYLVQTTTYLP，下划线标记）为共有序列。

▲ Expression of chimeric constructs of B4GALT6. Human B4GALT6 cDNA, cloned in a pCNA4 vector encoding a C-terminal c-Myc tag, was manipulated to substitute parts of the stem region with those of B4GALT5 or mouse b4galt6. Chi46-T5/T6: the first 46 amino acids of the chimera correspond to B4GALT5 protei

【数据】细胞系：HEK293T、HeLa、Huh-7、Hep-3B、Neuro2a；培养基：DMEM（高糖4,500 mg/L）+10% FBS；PCR条件：98°C 30s变性，30或22个循环（95°C 8s，64°C 20s，72°C 45s或25s），72°C 10min延伸；质粒：pCDNA3、pCNA4、pFN21；突变方法：QuikChange II-E定点突变试剂盒；酶切位点：HindIII/SfgI、PmeI/XbaI、EcoRI/EcoRV、MluI/XhoI、MluI/BspEI

研究结果

病例报告

一名6岁3个月大的白人女童因双侧白内障、左眼晶状体半脱位、注意缺陷/多动障碍和小头畸形就诊。先证者为非近亲健康父母的第三个孩子，足月出生，孕期无异常，围产期史正常，出生体重3,100 g（−0.8 SD）。12月龄开口说第一个词，但24月龄才实现独立行走。她有语言发育迟缓、学习困难和注意缺陷/多动障碍。4岁时眼科检查发现双侧晶状体混浊和左眼晶状体半脱位。她接受了双侧晶状体摘除和人工晶状体植入。最近一次评估在7岁10个月，体重30 kg（+0.1 SD），身高123.5 cm（+0.7 SD），枕额围48.5 cm（−1.3 SD）。医生注意到她有长人中颌凸畸形。超声心动图检查未发现任何心脏缺陷。半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶（GALT）活性和血液中总半乳糖浓度均在正常范围内。基于阵列的比较基因组杂交显示5q21.2和7p21.2微缺失，分别为83 Kb和10.6 Kb；两者均见于对照个体，被解读为良性拷贝数变异。全外显子组测序发现B4GALT5复合杂合变异：c.518G>A-p.R173H和c.820G>A-p.G274R，根据美国医学遗传学与基因组学学会标准（PM2，PP3）均被分类为可能致病。p.(R173H)变异不存在于gnomAD中，Combined Annotation Dependent Depletion（CADD）评分为32，未在ClinVar中注释。p.(G274R)变异在gnomAD中等位基因频率为3.977 × 10⁻⁶（251,428个等位基因中1个，仅观察到杂合状态），CADD评分为26.4，未在ClinVar中注释。该病例已纳入DECIPHER，患者ID：412221。

我们着手在B4GALT5/6双敲除细胞模型中研究所鉴定的B4GALT5变异体的表达和酶活性。

患者血浆和培养成纤维细胞的分析

为进一步评估所鉴定B4GALT5变异体的潜在效应，我们对患者血浆样本和原代培养成纤维细胞进行了糖鞘脂分析。患者父母和5名年龄匹配的健康个体血浆作为对照。循环LacCer和Gb3水平出现显著差异，患者血浆中LacCer和Gb3水平较所有对照降低5倍以上。尽管未达到统计学显著性，患者血浆中循环GM3浓度也降低，而己糖神经酰胺（HexCer）浓度较对照升高（图1A）。

在来自6名健康对照的原代培养成纤维细胞中，B4GALT5和B4GALT6转录本水平在样本间存在差异。然而，在大多数成纤维细胞样本（包括患者成纤维细胞）中，B4GALT6转录本水平比B4GALT5高3至8倍，由RT-qPCR确定（补充图S3）。为确定这种B4GALT5/6转录本比率是否影响GSL表达，我们选择了3个对照成纤维细胞系用于后续实验，其中B4GALT6转录本水平分别与B4GALT5相似、低于或高于B4GALT5（图1B）。与这3个对照相比，患者样本的LacCer、GM3和Gb3水平显著降低，同时出现HexCer积累（图1C）。尽管对照成纤维细胞间GSL谱存在变异性，这些差异仍达到统计学显著性。

▲ Analysis of patient plasma and fibroblasts in culture. A: Patient plasma was extracted and analyzed by LC-MS/MS together with plasma from her mother, father, and five age-matched healthy controls. In this panel, glycosphingolipids are reported as the sum of individual species with fatty acyl chains

同一批成纤维细胞还在13C6-半乳糖存在下孵育不同时间，测定了含13C6-半乳糖和/或13C6-葡萄糖残基的GSL谱（图1D）。13C6标记的半乳糖高效代谢转化为13C6标记的葡萄糖此前已有报道（18）。糖鞘脂（LacCer和GM3）分析显示，不到30%的总标记物种仅含13C6-半乳糖残基，质荷比增加+6.02。相比之下，超过70%的标记物种同时掺入13C6-半乳糖和13C6-葡萄糖残基，质荷比总位移为+12.02。虽然GSL合成速率在各对照成纤维细胞系间存在差异，但患者成纤维细胞中GSL合成延迟，无法合成预期量的GSL。

患者成纤维细胞的鞘脂新生合成谱通过[3H]-鞘氨醇短脉冲标记（1和2小时）进一步验证。患者成纤维细胞中LacCer下游生物合成途径的GSL水平较对照细胞降低，同时观察到HexCer积累（补充图S4）。

【数据】患者年龄：6岁3个月；出生体重：3,100 g（−0.8 SD）；体重：30 kg（+0.1 SD）；身高：123.5 cm（+0.7 SD）；枕额围：48.5 cm（−1.3 SD）；LacCer和Gb3降低：>5倍；B4GALT6/B4GALT5转录本比：3-8倍；13C6-半乳糖标记：<30%仅含半乳糖，>70%同时含半乳糖和葡萄糖；微缺失大小：83 Kb和10.6 Kb；CADD评分：32和26.4；gnomAD等位基因频率：3.977 × 10⁻⁶

KO HEK293T细胞模型的表征

▲ Characterization of KO HEK293T cell model. A: HEK293T cells lacking B4GALT5 (HEK-KO-T5), B4GALT6 (HEK-KO-T6), or both (HEK-dKO-T5-6) were subjected to RNA and GSL (LacCer + GM3) quantification by RT-qPCR and LC-MS/MS, respectively. LacCer + GM3 values represent the sum of all acyl species from C16:0

【数据】细胞模型：HEK293T单敲除和双敲除；检测方法：RT-qPCR和LC-MS/MS；LacCer+GM3代表C16:0至C24:0和C24:1所有酰基物种总和；酶活性检测：C15:0 LacCer d7合成，C15:0 GlcCer d7为受体底物，UDP-Gal为供体；统计方法：单因素方差分析+Dunnett事后检验（A组）和Tukey事后检验（B组）

计算机结构分析

▲ 计算机模拟结构分析。A：左侧为含Mn²⁺离子和UDP-Gal的3D模型。R173H模型中，His173高亮（蓝色）。G274R模型中，Arg274高亮（蓝色）。右侧为ΔStability值，单位为kcal/mol。对于R173H变体，同时报告了His的δ-和ε-质子化值。B：在整个MD模拟过程中计算蛋白质骨架的RMSD值，并报告平均值（μ）和标准差（σ）。图上每个蛋白质显示每条复制品的曲线。C：计算UDP-Gal的RMSD值。

【数据】分析方法：3D模型含Mn²⁺和UDP-Gal；ΔStability值单位：kcal/mol；R173H变异同时报告His的δ-和ε-质子化状态值；RMSD计算：蛋白骨架和UDP-Gal，报告均值（μ）和标准差（σ）；MD模拟：每个蛋白每条副本一条线

B4GALT5变异体的表征

▲ Characterization of B4GALT5 variants. A: HEK-dKO-T5-6 cells were transfected with WT B4GALT5 or patient variants (R173H and G274R) cloned in a pCDNA3 vector, and the homogenates of transfected cells were used as the enzyme source in LacCer synthase assay, as described in Figure 2 . Note the two diff

【数据】转染细胞：HEK-dKO-T5-6；载体：pCDNA3；酶活检测：WT 0.5 μg均浆蛋白，变异体60 μg，孵育30分钟；GSL分析：4次独立转染的重复分析，均值±SD；Western blot：10% SDS-PAGE，抗c-Myc抗体，化学发光检测，抗β-actin抗体为内参；免疫荧光：HeLa细胞，3xFLAG标签，抗FLAG（绿色）和抗golgin97（红色）抗体；统计：单因素方差分析+Tukey事后检验

B4GALT6的表征

▲ Characterization of B4GALT6. A: HEK-dKO-T5-6 were transfected with mouse or human B4GALT6 cloned in a pCDNA3 vector (pcDNA3-mb4galt6 or pcDNA3-B4GALT6, respectively), or in a pFN21 vector encoding an N-terminal Halo tag (pFN21-B4GALT6). The homogenates of transfected cells were used as the enzyme so

【数据】转染细胞：HEK-dKO-T5-6；载体：pCDNA3（人/小鼠B4GALT6）和pFN21（N端Halo标签）；酶活检测：1.0 μg均浆蛋白，孵育60分钟；Western blot：RIPA裂解；免疫荧光：HeLa细胞，c-Myc标签，抗Myc（绿色）和抗GM130（红色）抗体；统计：配对t检验，比较同一样本内B4GALT5和B4GALT6 mRNA水平

讨论与解读

本研究发现，在一名表现为轻度智力障碍、小头畸形和双侧白内障的儿童中发现的B4GALT5 R173H和G274R变异体均无功能活性。同时发现人B4GALT6作为LacCer合酶的效率低于B4GALT5。此外，人B4GALT6尽管mRNA水平较高，但蛋白表达似乎较弱——至少在细胞模型中如此。

在缺乏B4GALT5、B4GALT6或两种酶均缺失的HEK293T克隆中表达WT和变异B4GALT5构建体，通过体外直接酶活测定和LC-MS/MS的GSL谱分析证实，两种B4GALT5变异体在转染后均缺乏LacCer合酶活性。WT B4GALT5即使使用极少量的均浆蛋白也表现出强劲活性，而无论均浆蛋白浓度或GlcCer-d7底物浓度如何，使用任一B4GALT5变异体的测定中均检测不到LacCer-d7产生。基于GSL谱分析，WT B4GALT5的过表达将GSL合成（LacCer、GM3和Gb3）提高至亲本HEK293T细胞内源水平的3倍。相比之下，两种B4GALT5变异体均无活性，GSL水平与非转染HEK-dKO-T5-6细胞相似。在同一转染实验中，WT B4GALT5和两种变异体的mRNA水平相当。此外，c-Myc标记的WT和变异B4GALT5蛋白水平相似。

编译者解读

本研究以临床罕见病例为起点，通过双敲除细胞模型、体外酶活测定和计算机结构预测的联合策略，首次在人体遗传学层面证实B4GALT5对正常糖鞘脂合成不可或缺。方法学上，LC-MS/MS脂质组学与同位素示踪的结合为评估糖鞘脂代谢通量提供了高分辨率工具。值得注意的是，人B4GALT6在细胞模型中表现出的低表达和低活性对"B4GALT6可代偿B4GALT5"的传统假设提出挑战——这提示在合成生物学应用中，若要工程化改造糖鞘脂合成通路，不能简单依赖同源酶的异源表达，而需考虑各亚型的翻译调控和底物偏好等深层机制。本研究的局限在于单病例的普遍性有限，且体外模型与体内真实酶活之间仍存在差距。

参考来源

Montavoci L, Dei Cas M, Caretti A, Ben Mariem O, Eberini I. B4GALT5 deficiency impairs glycosphingolipid biosynthesis: a new congenital disorder of glycosylation? J Lipid Res. PMCID: PMC13476684.

PMCID: PMC13476684

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