来源：Exploring rare coumarins biosynthesis by Gloeophyllum trabeum: an integrated computational genomics, molecular docking and spectroscopic approach.（World J Microbiol Biotechnol）| 编译：DNA Lab Space
导读
抗生素耐药性的持续攀升迫使科学界加速寻找新型抗菌化合物。蜜褐韧革菌（Gloeophyllum trabeum）是一种常见的木材腐朽担子菌，但其特殊代谢产物的合成能力长期未获充分认识。本研究整合波谱分析、计算基因组学与分子对接技术，系统解析了该菌的异香豆素生物合成途径。研究发现该菌对枯草芽孢杆菌表现出显著拮抗活性，并从中鉴定出四种稀有香豆素类聚酮化合物，其中两种具有抗菌活性。分子对接进一步揭示oosponol对卡他莫拉菌UspA1蛋白具有卓越结合亲和力，为新型抗菌药物开发提供了候选分子。
研究背景
天然代谢产物在药物发现中扮演关键角色，放线菌和子囊菌已被广泛研究其抗菌生产能力。相比之下，担子菌因培养困难而长期被忽视，尽管它们具有显著的化学多样性和悠久的传统治疗应用历史。基因组挖掘与合成生物学的进步，为深入探索这些被忽视的真菌提供了支撑。
研究表明，真菌的生态位对其生物活性化合物的产生有重要贡献。腐生菌丝体与其他微生物竞争营养资源，而子实体则与土壤无脊椎动物互动，影响其化学生物防御。从进化角度看，褐腐真菌演化出能够接触木质素和全纤维素（其他生物通常无法利用）的分解系统。蜜褐韧革菌作为森林中关键的木材腐朽物种，专门分解纤维素衍生物，利用小型可扩散代谢物深入渗透木材，到达其他物种无法触及的区域。这种特化机制不仅增强了真菌在竞争激烈、营养匮乏环境中的生存能力，也暗示其代谢产物具有独特的化学多样性潜力。
研究方法
化学试剂
本研究使用的所有化学品和有机溶剂均由Fisher Scientific提供。蜜褐韧革菌菌株ATCC11539由美国克拉克大学David Hibbett博士慷慨提供，整个研究期间在PDYA培养基（24 g/L马铃薯葡萄糖肉汤、5 g/L酵母提取物和15 g/L琼脂）平板上维持培养。
【数据】菌株：G. trabeum ATCC11539；培养基：PDYA（24 g/L PDB、5 g/L YE、15 g/L琼脂）
平板生物测定
取新鲜培养的蜜褐韧革菌琼脂培养物6 mm plugs，分别置于麦芽蛋白胨葡萄糖琼脂（MPGA）、酵母提取物麦芽琼脂（YMGA）、马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）、麦芽提取物琼脂（MEA）、酵母麦芽葡萄糖蛋白胨琼脂（YMAT）和马铃薯葡萄糖酵母提取物琼脂（PDYA）三种重复平板的中央。平板先培养48小时以支持真菌生长，然后施加适当的覆盖层。选择三种模型微生物——枯草芽孢杆菌ATCC6633（革兰氏阳性菌）、大肠杆菌DH5α（革兰氏阴性菌）和酿酒酵母Y1000（真核真菌物种）——以覆盖细胞壁结构和组织方面广泛而均衡的生物学选择。覆盖层平板的制备中，枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和酿酒酵母的储备液按照Al-Salihi等人（2021）的方法制备（培养条件见补充数据）。
【数据】菌饼直径：6 mm；培养时间：48 h；测试菌株：B. subtilis ATCC6633、E. coli DH5α、S. cerevisiae Y1000；培养基：MPGA、YMGA、PDA、MEA、YMAT、PDYA
发酵培养与化学提取
将蜜褐韧革菌6 mm琼脂培养块接种到含1 L PDY肉汤的2 L锥形瓶中，30°C振荡培养14天。为提取代谢产物，向培养物中加入1 L乙酸乙酯，混合物在25°C下匀化30分钟。随后过滤匀浆物，分离有机层，用无水MgSO₄干燥，再在旋转蒸发仪中干燥得到粗提物（Al-Salihi et al. 2021）。
【数据】培养体积：1 L PDY肉汤/2 L瓶；温度：30°C；时间：14天；提取溶剂：1 L乙酸乙酯；匀化条件：25°C、30 min；干燥剂：无水MgSO₄
HPLC-MS分析用代谢物制备
在证明蜜褐韧革菌在PDYA上产生生物活性化合物后，采用更大规模培养（2 L）以支持化学纯化和表征。粗提物经快速柱色谱处理，使用不同比例的甲醇和去离子水，固定相为硅胶RP-C18（MeOH/H₂O）（柱条件见补充数据）。含有目标化合物的流分通过制备型HPLC进一步纯化，流分收集由LC-MS分析引导。数据采集使用Waters LCMS系统，包括Waters 2767自动进样器、Waters 2545泵系统、Phenomenex LUNA C18色谱柱（2.6 μm，100 Å，4.6 × 100 mm），配备Phenomenex Security Guard预柱（Luna C5 300 Å），流速1 mL/min。检测采用Waters 2424 ELSD和Waters SQD-2质谱检测器，同时以ES+和ES−模式运行（Kramer and Deming 2010）。
【数据】培养规模：2 L；色谱柱：Phenomenex LUNA C18（2.6 μm，100 Å，4.6 × 100 mm）；流速：1 mL/min；检测：ELSD + ES+/ES−质谱
目标化合物的NMR表征
纯化后的化合物干燥并溶解于CDCl₃中，使用Agilent VNMRS500波谱仪进行后续NMR分析，测定¹H-NMR、¹³C-NMR及以赫兹（Hz）表示的耦合常数（J）。二维NMR技术（COSY、HSQC、HMBC）常规用于结构归属（Sauri, 2026）。
【数据】溶剂：CDCl₃；仪器：Agilent VNMRS500；NMR技术：¹H、¹³C、COSY、HSQC、HMBC
纯化化合物的抗菌生物测定
化合物纯化后，进行生物测定以评估（化合物1、oospoglycol、oosponol和FD48）的抗菌活性。每种化合物以1 mg/mL浓度溶解于甲醇中。按照补充数据中描述的方案制备枯草芽孢杆菌的三块重复覆盖平板，每块平板中央打一个5 mm孔，向孔中加入100 µL适当稀释的纯化化合物。平板在28°C下孵育24小时，然后测量产生的抑菌圈。
【数据】化合物浓度：1 mg/mL；孔直径：5 mm；加样量：100 µL；孵育：28°C、24 h；测试菌：B. subtilis
分子相互作用建模——分子对接
为解决抗菌生物测定中技术和生物学重复数量有限的问题，并研究生物活性与蛋白质结合之间的关系，代表无活性（化合物1）、半活性（oospoglycol）和活性（oosponol）的化合物进一步针对更广泛的微生物物种（包括类鼻疽伯克霍尔德菌、大肠杆菌、卡他莫拉菌、脑膜炎奈瑟菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌）使用分子对接分析进行评估。鉴于异香豆素对参与DNA和膜合成的酶具有抑制活性的报道（Ashraf et al. 2014），选择了高选择性抗菌靶点用于对接分析，考虑其在细菌存活中的已知作用以及这些通路在人类中的缺失。天然抑制剂包括三氯生、头孢比普利、小檗碱和鲁马卡托，为评估测试的异香豆素化合物提供了验证基准（Sivaraman et al. 2004）。
比较分析涵盖多种与微生物生存和耐药性相关的酶（如烯脂酰-酰基载体蛋白还原酶（MurG）、D-景天庚酮糖-7-磷酸异构酶（GmhA）、丝状温度敏感突变体Z（FtsZ）、烯脂酰-酰基载体蛋白还原酶I（FabI）、泛在表面蛋白A1（UspA1）、甲氧西林耐药必需因子（FemX）、硫动员蛋白（SufS）），来源于革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌（靶蛋白详细信息见表S1）。细菌蛋白靶点的三维（3D）晶体结构从研究合作结构生物学实验室（RCSB）获取（可通过 https://www.rcsb.org/ 访问）。随后，使用分子操作环境（MOE）2020软件套件（ULC 2020）准备每个受体结构。初始准备涉及精炼过程，添加氢原子并优化残基质子化状态。此外，使用AMBER99力场对每个大分子进行能量最小化，直至达到稳定构象。每个特定受体的结合口袋通过其共结晶天然配体的坐标定义，或参考文献报道（Uddin et al. 2025）。在没有共结晶配体的情况下，特别是大肠杆菌FtsZ和金黄色葡萄球菌FemX，需要使用DogSiteScorer（可通过Proteinsplus平台访问：https://proteins.plus/help/poseview）进行结合口袋的计算预测，该工具识别蛋白质表面的潜在空腔并评估其配体结合适宜性。最可能活性位点的选择基于DrugScore，该评分评估口袋大小、疏水性和相互作用潜力等特性。因此，对这两个受体中的每一个，选择具有最高DrugScore的口袋作为对接模拟的靶点，因为该值表明作为可成药位点的概率很高。
所选化合物（化合物1、oospoglycol和oosponol）最初使用ChemDraw 19.1软件构建为2D结构，随后导入MOE数据库并优化为3D结构。该过程涉及极性和非极性氢原子的添加，随后进行构象搜索和使用MMFF94x力场的能量最小化，以获得每个配体最稳定的低能构象。每组靶点均包含一组已知抑制剂或相关化合物作为阳性对照。这些对照配体{5-(4-氨基-2-甲基苯氧基)-2-己基-4-羟基-1-甲基吡啶鎓（ID = 73437603）、1-羟基-2,3,1-苯并二氮杂硼烷-2(1H)-硫代酰胺、三氯生、鲁马卡托、(2~{R})-3-甲基-2-[(~{E})-[2-甲基-3-氧化-5-(膦酰氧甲基)吡啶-4-基]亚甲基氨基]-3-巯基丁酸}与三种选定的代谢物采用相同的制备方案。
【数据】对接软件：MOE 2020；力场：AMBER99（受体）、MMFF94x（配体）；靶蛋白：MurG、GmhA、FtsZ、FabI、UspA1、FemX、SufS；阳性对照：三氯生、头孢比普利、小檗碱、鲁马卡托等
分子动力学
为评估所选蛋白靶点与化合物的配体-受体结合稳定性，进行了分子动力学模拟。
【数据】模拟时长：100 ns（据图4图注）；分析指标：RMSD（Å）
研究结果
蜜褐韧革菌拮抗活性评估
对蜜褐韧革菌针对病原微生物面板的抗菌活性初步调查确认了其产生生物活性物质的能力。微生物敏感性因物种而异，也因真菌生长培养基不同而不同。总体而言，枯草芽孢杆菌是对蜜褐韧革菌菌丝生长最敏感的微生物，而酿酒酵母和大肠杆菌敏感性较低。当蜜褐韧革菌在PDYA平板上生长时，对枯草芽孢杆菌达到最大抑菌圈（图1），因此该培养基被用于制备规模培养。唯一检测到大肠杆菌被抑制的培养基是YMAT培养基。
【数据】最适培养基：PDYA（对B. subtilis抑菌圈最大）；E. coli仅在YMAT培养基被抑制；重复数：3个生物学重复
化合物纯化、表征与初步生物活性测试
使用不同比例的甲醇和去离子水进行快速色谱，从蜜褐韧革菌的乙酸乙酯粗提物中纯化活性代谢物。进一步的HPLC和NMR分析鉴定出四种香豆素类化合物：化合物1（暂定为羟基化萘醌衍生物）、化合物2（oospoglycol）（Sonnenbichler et al., 1997）、化合物3（oosponol）（Kovacs et al., 1997）和化合物4（Naphthazarin-6,7-dihydrodiol（FD48））（Sonnenbichler et al., 1989），其中化合物1显示出新颖的化学结构（图2）。UV/vis [DAD]、[±] ESI-MS、IR和NMR谱的详细信息参见补充数据表S2和图S1–S22。
这些化合物在1 mg/mL浓度下的覆盖层生物测定显示，oospoglycol和oosponol对枯草芽孢杆菌表现出活性（表2）。
表2 蜜褐韧革菌四种纯化化合物的覆盖层生物测定结果*
| 微生物：枯草芽孢杆菌 | |
|---------------------|------|
| 化合物（1 mg/mL） | 抑菌圈（mm） |
| 新化合物（化合物1） | 无抑菌圈 |
| Oospoglycol（化合物2） | 12（微弱抑菌圈） |
| Oosponol（化合物3） | 16 |
| FD-48（化合物4） | 无抑菌圈 |
*由于化合物限量，这些结果仅代表一次重复。
【数据】化合物1：无抑菌圈；oospoglycol：12 mm（微弱）；oosponol：16 mm；FD48：无抑菌圈；测试浓度：1 mg/mL；重复：1次
分子相互作用建模
三种选定化合物针对六种病原微生物进行测试，每种细菌两个靶蛋白，但脑膜炎奈瑟菌和枯草芽孢杆菌除外——这两种菌各只有一个靶蛋白可优化用于对接研究（由于蛋白质尺寸大且缺乏活性位点）。总体而言，对接分数表明三种化合物表现出选择性靶标偏好，其中oospoglycol和oosponol对卡他莫拉菌的一个靶蛋白（UspA1）表现出特别强的亲和力（图3）。
从类鼻疽伯克霍尔德菌开始，参考配体对两个受体MurG（-7.0915 kcal/mol）和GmhA（-6.3196 kcal/mol）均表现出强结合亲和力，优于所有测试化合物。对于第二种受检细菌（大肠杆菌），情况略有不同——参考配体与FabI受体的相互作用与三种测试化合物相比具有竞争力；但对于第二个靶蛋白（FtsZ），oospoglycol得分最高（-5.7261 kcal/mol），其次是oosponol（-5.5290 kcal/mol）。对于第三种细菌（卡他莫拉菌）的蛋白靶点（FabI和UspA1），结合亲和力相对不同——两种化合物对FabI受体均表现出中等结合（-5.4至-5.6 kcal/mol），而oosponol和oospoglycol对UspA1受体表现出出色的相互作用（-13.552和−11.713 kcal/mol）。第四种受检细菌是脑膜炎奈瑟菌，所有测试化合物均显示出较弱的亲和力（-5.3181至-5.5706 kcal/mol），低于其天然配体（-5.9342 kcal/mol）。在第五种细菌（金黄色葡萄球菌）中，化合物显示出可变的亲和力，对两个选定的靶蛋白（FabI和FemX）均无竞争性抑制潜力——对于FabI，oospoglycol（-5.4800 kcal/mol）和化合物1（-5.6214 kcal/mol）的亲和力略优于oosponol（-5.3962 kcal/mol），但仍低于天然配体的分数（-5.8284 kcal/mol）；而对于FemX，排序为oosponol（-5.7775 kcal/mol），其次是oospoglycol（-5.7059 kcal/mol）和化合物1（-5.6206 kcal/mol），同样低于其参考配体（-7.0188 kcal/mol）。最后一种选定细菌是枯草芽孢杆菌，所有三种测试化合物均表现出较弱的相互作用，分数范围为−5.4501至-5.6409 kcal/mol，而参考配体的结合亲和力为-8.5319 kcal/mol（配体和蛋白质受体相互作用见补充数据图S23–S32）。
这些结果通过分子动力学（MD）分析进一步验证，显示大多数蛋白质-配体复合物在整个模拟过程中维持约1.5-3.0 Å的RMSD值，表明结合稳定且整体构象稳定（详细描述见补充文件图S33）。如图4所示，化合物1-FabI复合物在最初15-20 ns内RMSD初始增加，最终稳定在2.3-2.8 Å之间；而oospoglycol–UspA1复合物的平衡阶段更早到达，RMSD维持在1.0-1.6 Å。类似地，oosponol–UspA1复合物显示初始增加后，在1.8–2.1 Å附近出现适度的结构波动。
【数据】对接分数：MurG参考配体-7.0915 kcal/mol、GmhA参考配体-6.3196 kcal/mol；FtsZ：oospoglycol -5.7261 kcal/mol、oosponol -5.5290 kcal/mol；FabI（M. catarrhalis）：-5.4~-5.6 kcal/mol；UspA1：oosponol -13.552 kcal/mol、oospoglycol -11.713 kcal/mol；N. meningitidis靶点：测试化合物-5.3181~-5.5706 kcal/mol vs 天然配体-5.9342 kcal/mol；S. aureus FabI：oospoglycol -5.4800、化合物1 -5.6214、oosponol -5.3962、天然配体-5.8284 kcal/mol；FemX：oosponol -5.7775、oospoglycol -5.7059、化合物1 -5.6206、参考配体-7.0188 kcal/mol；B. subtilis靶点：测试化合物-5.4501~-5.6409 vs 参考配体-8.5319 kcal/mol；MD模拟：100 ns，RMSD 1.5-3.0 Å（多数复合物）
预测PKS酶的系统发育分析
基于蜜褐韧革菌中预测的八个推定PKS基因，以及来自MIBiG数据库的功能表征聚酮合酶（PKS）子集（参与不同骨架的多种聚酮类抗生素生物合成，如非还原性聚酮合酶（NR-PKS）、高还原性聚酮合酶（HR-PKS）和杂合聚酮合酶-非核糖体肽合成酶（HPKS-NRPS）），构建了系统发育树。生成的最大似然树将酶分为五个主要分支，每个分支包含2-5个亚分支，反映了蜜褐韧革菌预测PKS与具有不同结构域架构和生物合成功能并经实验表征的PKS之间的进化关系和同源性。预测的蜜褐韧革菌PKS（用红色星号标记）分布在五个分支中的四个，表明其功能多样性。第一分支（分支1）汇集了杂合PKS-NRPS骨架的酶，与生物活性化合物的生物合成相关，包括equisten、fusarins、洛伐他汀及相关代谢物。第二分支（分支2）主要由HR-PKS组成，其中几个预测的蜜褐韧革菌PKS与参与strobilurin和polyene生物合成的两个生物合成基因紧密聚集，提示它们在产生结构相关化合物中的潜在作用。相比之下，分支3仅包含一个预测的蜜褐韧革菌PKS。
【数据】预测PKS基因数：8个；系统发育树分支数：5个主要分支（每支2-5个亚分支）；蜜褐韧革菌PKS分布：4/5分支
oosponol及其衍生物的生物合成基因簇预测
对蜜褐韧革菌基因组中与oosponol生物合成相关的基因簇进行了预测分析。
【数据】原文未详述具体BGC数量与基因组成
蜜褐韧革菌中oosponol的推测生物合成途径
提出了蜜褐韧革菌中oosponol的生物合成途径。该途径始于迭代PKS（oosA）组装庚酮骨架，随后由预测酶oosB–oosG介导环化、还原、甲基化、氧化、乙酰化和最终去乙酰化，生成oosponol。基因分配基本上基于交替醇、桔霉素和clavatol生物合成的高同源蛋白序列和结构域或功能推断（Chooi et al. 2015; Hajjaj et al., 1999）。
【数据】途径步骤：庚酮骨架组装（oosA）→环化→还原→甲基化→氧化→乙酰化→去乙酰化（oosB–oosG）；推断依据：alternariol、citrinin、clavatol生物合成同源蛋白
讨论与解读
蜜褐韧革菌在不同培养基上菌丝生长的初步评估确认了其产生抗菌物质的能力。测试微生物的敏感性不仅因物种而异，也随所用培养基不同而变化。酿酒酵母受到有限抑制，可能是因为该菌不太可能产生对真菌具有差异活性的代谢物。本研究所用不同培养基预期会产生不同化合物，这在一定程度上符合OSMAC策略的基础——即展示单一菌株可能产生的多种不同化合物。此外，观察到的菌丝生长最大抑菌圈（50 mm）与oospoglycol（12 mm）和oosponol（16 mm）相比更大，表明存在额外的微量衍生物和/或代谢物之间的协同效应，这些物质在色谱纯化过程中因丰度低和分离效果差而未被充分表征。
尽管oospoglycol和oosponol此前已由Kovács和Sonnenbichler于1997年从冷杉褐韧革菌中表征，但本研究的二维NMR波谱分析通过确认额外取代基团（–C(=O)–O–）的存在，实现了可靠的结构表征，为四种稀有香豆素提供了全面背景，其中化合物1是首次报道在蜜褐韧革菌中出现的分子。
编译者解读
本研究展示了整合多种技术手段挖掘"被忽视"真菌代谢潜力的有效路径。方法学上的亮点在于将基因组挖掘与实验验证闭环衔接——从表型拮抗筛选出发，经色谱纯化和波谱鉴定获得化合物，再通过对接和动力学模拟预测靶点，最后用系统发育分析锚定生物合成基因。这种"从表型到基因型再回归功能"的策略值得合成生物学借鉴。局限也很明显：抗菌活性数据仅有一次重复，且缺乏基因敲除等湿实验验证来确证所预测的BGC功能。未来若能在异源宿主中重构该生物合成途径，将有望实现这些稀有香豆素的可控量产。
参考来源
Al-Salihi SAA, Dao TT, Maulana S, Bailey AM. Exploring rare coumarins biosynthesis by Gloeophyllum trabeum: an integrated computational genomics, molecular docking and spectroscopic approach. World J Microbiol Biotechnol. PMID: 42599545.
PMID: 42599545