来源：A high-throughput co-culture CRISPR array for rapid fitness hypothesis testing and growth engineering in CHO cells（iScience）| 编译：DNA Lab Space
导读
细胞生长速率是哺乳动物生物制造的关键性能指标，但传统生长检测方法难以分辨微小的遗传效应。本研究开发了一种基于竞争性共培养的高通量CRISPR筛选阵列，将CRISPR感受态细胞与GFP标记的CRISPR缺陷型参考细胞混合培养，通过流式细胞术追踪GFP比例动态变化。研究测试了235个单基因敲除和155个多基因组合，鉴定出28个促进生长的敲除靶点，为CHO细胞生长工程提供了可扩展的假设验证平台。
研究背景
细胞生长与适应性是哺乳动物细胞培养体系性能的基础决定因素，不仅影响实验可重复性，还关系到生物工艺应用中的长期稳定性、可扩展性和经济可行性。在工业细胞系开发中，生长速率直接影响克隆生成、种子链扩增和生产放大的时间线，而微小的适应性缺陷可能在长期培养中累积，损害生产力或产品质量。尽管生长性状至关重要，但它是一个复杂的多基因性状，其机制和遗传原理尚未完全阐明，尤其是在高密度悬浮培养优化条件下。
中国仓鼠卵巢（CHO）细胞是重组治疗性蛋白生产的主要宿主系统，因其适应化学成分明确培养基中的悬浮生长以及具备类人翻译后修饰能力而被广泛采用。经过数十年的优化，CHO生产平台已实现高滴度和良好产品质量，但这些进展主要依赖经验性工艺开发和靶向遗传干预，而非对细胞功能的系统性理解。生长速率尤其仍是细胞系开发中的常见瓶颈，增殖缓慢导致开发周期延长。
研究方法
关键资源
化学试剂与重组蛋白：L-谷氨酰胺（200 mM，Sartorius Stedim Cellca GmbH，货号03-020-1B）；TrueCut™ Cas9蛋白v2（SpCas9，Thermo Fisher Scientific，货号A36499）；QuickExtract™ DNA提取溶液（Lucigen，货号QE09050）；4Cell® SmartCHO储备与适应培养基（Sartorius，货号CFP3FB1106）；嘌呤霉素（Gibco™，Thermo Fisher Scientific，货号A1113802）；台盼蓝0.4%（Gibco™，Thermo Fisher Scientific，货号15250061）；DPBS（Gibco™，Thermo Fisher Scientific，货号14190094）。
关键商业试剂盒：NEON™转染系统100 μL试剂盒（Thermo Fisher Scientific，货号MPK10096）；NEON™转染系统10 μL试剂盒（Thermo Fisher Scientific，货号MPK1096）。
实验模型与细胞系：CHO-DG44（DHFR）−/−（Sartorius专有）；CHO mock细胞系（Sartorius专有）；CHOCas9+细胞系（Sartorius专有）。
deposited数据：原始测序数据存放于NCBI SRA，BioProject编号PRJNA1489724。
寡核苷酸：TrueGuide™合成sgRNA（Thermo Fisher Scientific，见表S7）。
重组DNA：pRSGEGP-U6-sg-EF1-TagGFP2-2A-Puro（Cellecta，货号SVCRU6EP-L）；pMock（Sartorius专有）。
软件与算法：Geneious Prime（v11.0.11，Biomatters）；GraphPad Prism（v10.6.1，Dotmatics）；ICE CRISPR编辑推断（v3.0，Synthego）；BD FACSDiva™软件（BD Biosciences）；Python（v3.13.2）；pandas（v2.2.2）；NumPy（v1.26.4）；SciPy（v1.13.1）；Matplotlib（v3.9.2）；seaborn（v0.13.2）；Snakemake（v7.8.3）；FastQC（v0.12.1）；Trimmomatic（v0.39）；Kallisto（v0.48.0）；R（v4.4.2）；Bioconductor（v3.20）；tximport（v1.34.0）；edgeR（v4.4.2）；DESeq2（v1.46.0）；gprofiler2（v0.2.3）；WikiPathways；GO.db（v3.20.0）；org.Hs.e.g.db；AnnotationHub（v3.14.0）。
其他仪器：NEON™转染系统（Thermo Fisher Scientific）；CASY®细胞计数与分析仪（OMNI Life Science）；Fluent®自动化液体处理工作站（Tecan Group Ltd.）；Cellavista™成像系统（Synentec）；BD FACSAria™细胞分选仪（BD Biosciences）；4D-Nucleofector™系统（Lonza）；iQue® Screener v3（Sartorius）。
实验模型与细胞系详情
CHO DG44细胞最初来源于Lawrence Chasin（美国纽约哥伦比亚大学），此前已在内部适应无血清、化学成分明确培养基中的悬浮生长。Mock对照细胞系在本研究开始前已按前述方法生成并验证，作为本报告所有实验的亲本背景。CHOCas9+细胞系同样在先前研究中生成。细胞在无血清、无抗生素的化学成分明确4Cell® SmartCHO储备与适应培养基（Sartorius，德国乌尔姆）中培养，添加6 mM L-谷氨酰胺，悬浮条件下置于摇瓶中，培养条件为36.8°C、7.5% CO₂、80%相对湿度，除非另有说明。每2至4天传代一次，接种密度为1E5细胞/mL或2E5细胞/mL。细胞常规培养于96孔板（300 μL）中，使用自动化液体处理（Fluent®，Tecan，瑞士曼内多夫）配合自定义脚本，或手动扩增于摇瓶（25 mL）用于细胞库建立和有限实验。细胞密度和活力使用Cellavista™成像结合台盼蓝排斥法（Synentec，德国埃尔姆斯霍恩）或CASY®细胞计数与分析仪（OMNI Life Science，德国不来梅）监测。所有亲本培养物均常规检测并确认为支原体阴性。
GFP+对照的生成
GFP阳性对照细胞池通过将DHFR感受态CHO mock细胞转染商业GFP表达载体（pRSEGP-U6-sg-EF1-TagGFP2-2A-Puro）生成，该载体可实现组成型GFP表达和嘌呤霉素抗性。该构建体仅用作竞争性共培养测定的荧光标记和选择 cassette。转染使用NEON™转染系统配合NEON™转染系统100 μL试剂盒（Thermo Fisher Scientific，美国沃尔瑟姆）进行。简言之，1E6细胞与10 μg质粒DNA电穿孔，设置参数为1400 V、两次脉冲、脉冲宽度20 ms。电穿孔后，细胞以3E5细胞/mL密度重悬于添加6 mM L-谷氨酰胺的4Cell® SmartCHO储备与适应培养基（Sartorius，德国乌尔姆）中。转染后两天，添加嘌呤霉素至终浓度10 μg/mL，以筛选GFP表达细胞。筛选维持14天，之后撤除嘌呤霉素，细胞在标准培养条件下恢复。恢复的GFP阳性细胞池随后扩增并用于下游评估。
为减轻表达不稳定性和降低GFP强度异质性，生成的GFP池随后合并并进行荧光激活细胞分选（FACS）。分选在BD FACSAria™系统上使用BD FACSDiva™软件（BD Biosciences，美国圣何塞）进行。细胞基于GFP荧光强度设门，按递增的GFP强度阈值分选为四个不同群体。每个门约收集200,000细胞/孔至含有预热培养基的6孔板中。分选群体分别扩增并建库，用于下游共培养适应性测定。
基因组编辑与敲除验证
为确认CRISPR能力，表达Cas9的细胞系通过转染靶向特定基因组位点的合成sgRNA分子进行基因组编辑测试。所有基因靶点和sgRNA序列见表S1。sgRNA序列使用Geneious Prime（v11.0.11；Biomatters，新西兰奥克兰）设计，靶向所有转录本变体共有的早期外显子，以诱导移码突变并破坏蛋白质功能。基于预测的靶向效率和脱靶特异性选择最佳sgRNA，确保潜在脱靶位点位于非编码区域。脱靶分析针对完全测序和注释的宿主基因组进行。所用sgRNA在Sartorius Stedim Cellca GmbH先前内部研究中已筛选。TrueGuide™合成sgRNA（Thermo Fisher Scientific，美国沃尔瑟姆）以7.5或20.0 pmol递送至2E5个CRISPR感受态CHOCas9+细胞。作为编辑效率对照，相同sgRNA与TrueCut™ Cas9蛋白v2（Thermo Fisher Scientific）复合后使用。
共培养系统的建立与验证
将FELP3和FELP4以1:1:2比例与CHOCas9+细胞混合，创建三个共培养池（CC1-CC3），培养46天。GFP比例在所有池中保持在起始点的±10%以内，确认稳定性（图2D）。所有共培养实验使用的流式细胞术设门策略，包括碎片排除、单细胞选择和GFP阳性门定义，以及CC1-CC3的代表性GFP荧光分布，见图S2A–S2F。
高通量共培养CRISPR筛选
利用该共培养系统，研究测试了来自先前全基因组CRISPR筛选的候选基因。慢病毒文库靶向17,761个表达基因，转导至CHOCas9+细胞中。共培养筛选分为7个批次进行，包括218个单基因敲除和155个多基因组合（批次1-6），批次7包含17个额外单基因靶点和一个高阶多基因组合（10x_Ultra）。整个筛选跨越超过100天的培养周期。
生长建模与基因集反卷积
基于GFP斜率（%/天）与推断相对生长速率（Δμ）之间的关系，使用logit变换建模，锚定参考生长速率0.9241天⁻¹。斜率在−3%/天至+3%/天之间时呈现线性响应。通过组合排除法与批量转录组学分析，将多基因表型与候选驱动基因关联。
【数据】培养基：4Cell® SmartCHO储备与适应培养基；添加物：6 mM L-谷氨酰胺；温度：36.8°C；CO₂：7.5%；相对湿度：80%；传代间隔：2-4天；接种密度：1E5或2E5细胞/mL；电穿孔参数：1400V，2脉冲，20ms；质粒DNA量：10μg；细胞数：1E6；嘌呤霉素浓度：10μg/mL；筛选时间：14天；FACS收集细胞数：约200,000细胞/孔；sgRNA递送量：7.5或20.0 pmol；细胞数：2E5；共培养比例：1:1:2；共培养时间：46天；GFP比例波动范围：±10%
研究结果
培养动力学提供细胞适应性的累积读数
为评估群体动力学是否比活细胞浓度（VCC）读数更能可靠衡量细胞适应性，研究选择了在CHO细胞中具有已知表型的模型基因。EEF1A1和PGK1作为致死靶点（在先前全基因组CRISPR筛选中确认，CHO_EG2025），PRDX1根据先前研究作为生长抑制基因，FN1、LPL和FUT8作为中性对照（表S1）。致死和生长抑制靶点被有意纳入作为阳性对照，因为其敲除预期会随时间消耗编辑亚群，为竞争性测定的灵敏度和动态范围提供内部基准，可据此校准中性对照和候选生长增强扰动。
基因编辑使用两种递送格式：稳定表达Cas9的CHO细胞系和核糖核蛋白（RNP）转染。第2天测得的KO评分显示所有靶点的编辑效率较高，范围约50%至90%（图1A）。CHOCas9+细胞系的KO评分略低于RNP递送，中位值分别为65.0%和80.5%（图1B和1C）。sgRNA剂量在7.5至20 pmol之间的变化未显著影响编辑结果（图1B）。尽管CHOCas9+细胞系的KO评分比RNP低约15个百分点，但它仅需递送sgRNA，降低了高通量应用的成本和复杂性。
编辑池培养16天，每2-4天传代。相对于野生型（WT）对照归一化的VCC显示，CHOCas9+池中EEF1A1和PGK1敲除在第6至11天、RNP池中第9至11天出现短暂降低（图1D和1E）。这些差异在第11天后消失，所有变体的VCC值趋于一致。PRDX1在Cas9池中未表现出显著生长抑制，在RNP条件下VCC看似较低但无统计学显著性。总体而言，基于VCC的测量显示出高变异性，限制了其分辨中度适应性效应的能力（如PRDX1预期表现）。图1D和1E中WT归一化VCC的大误差棒（若干条件跨度约为0.5-1.5）本身就是VCC测定变异性的直接体现，正是这一局限性促使了改进读数的开发。
相比之下，群体动力学——在此操作化为混合群体中功能编辑细胞比例的时间变化——提供了更清晰和累积的适应性读数。该方法不测量绝对细胞数，而是追踪扰动亚群在连续细胞分裂中的相对竞争优势或劣势，将即使微小的适应性差异随时间的推移整合为可检测信号。KO评分轨迹量化了第2、7和16天的功能敲除比例（图1F和1G）。两种编辑格式均显示致死敲除EEF1A1和PGK1随时间的完全消失，而中性靶点保持稳定。ΔKO评分确认了致死变体的显著耗竭（图1H和1I），而PRDX1在这些条件下未显示耗竭。
EEF1A1和PGK1 KO细胞在第5天左右的快速丢失（图1F和1G）是致死扰动的预期动力学特征，与图1D和1E中WT归一化VCC的短暂降低一致——一旦存活的未编辑细胞主导群体，这些降低便得以消除；因此生长效应可归因于编辑细胞仍存在的早期窗口期内的敲除，尽管此后功能KO评分已耗竭。PRDX1 KO评分随时间维持，表明PRDX1缺失可被耐受，但VCC未显示统计学显著生长差异；其轻度生长抑制效应低于VCC在该单培养格式中的分辨率。这些发现表明，基于生长的指标是瞬时的且对检测细微差异不敏感，而群体动力学随时间的推移整合效应、降低方差，并消除了对代谢测定的需求。
【数据】KO评分范围：约50%-90%；CHOCas9+中位KO评分：65.0%；RNP中位KO评分：80.5；KO评分差异：约15个百分点；sgRNA剂量范围：7.5-20 pmol；培养时间：16天；传代间隔：2-4天；VCC归一化波动范围：约0.5-1.5；KO评分检测时间点：第2、7、16天；致死敲除消失时间：约第5天
共培养实现单参数流式细胞术适应性读数
优先选择共培养验证而非单培养生长测量的原理在图S3A中概念性说明，展示了微小生长速率差异如何在单培养中难以分辨，但在竞争性共培养格式中累积为可量化信号。为建立能够通过单一流式细胞术读数检测细胞适应性变化的高通量共培养系统，研究将CRISPR感受态CHOCas9+细胞系与CRISPR缺陷型GFP表达细胞系结合。该设计确保sgRNA递送后仅一半群体被编辑，而GFP表达使流式细胞术能够快速、经济高效地监测群体动力学。
两个先决条件得到验证：（1）GFP+与CHOCas9+细胞之间生长速率相当；（2）GFP表达稳定，在长期培养中与GFP阴性细胞清晰分离。研究有意采用多克隆参考池而非单克隆GFP+参考克隆。这一选择最小化了克隆异质性引入的偏差，避免过度解读由克隆特异性背景变异驱动的适应性效应。正如生产细胞系所广泛讨论的，混合池提供更具代表性的平均表型，在探究细微适应性差异时提高准确性。尽管本共培养测定在非生产背景下进行，但相同原则适用：使用混合池平均了克隆间变异性，更好地反映群体水平适应性，这有利于灵敏的高通量筛选应用。研究承认混合在原理上可能引入额外的群体内异质性，因为混合池包含具有不同基线行为的细胞，可能对给定扰动产生不同响应；在本设计中，这一问题通过FACS富集稳定参考池和对照归一化（ΔΔGFP）得到缓解，因此对竞争性读数的净效应是改善而非降低可重复性。
为生成GFP+对照，将编码GFP的质粒转染至mock CHO细胞系，随后进行嘌呤霉素筛选。九个转染池中，三个混合形成三个大型混合池（LPP1-3）。这些池监测GFP稳定性（图2A）。GFP水平在撤除嘌呤霉素后下降，30天后达到约85%-90%。为改善信号稳定性，将混合的LPP1-3群体基于GFP强度FACS分选为四个富集池（FELP1-4），每池含2E5细胞。用于生成FELP1-4的代表性设门策略和GFP强度阈值见图S1A–S1D。平均荧光强度（MFI）范围为4×10⁵至6×10⁵，最高强度分选池与单克隆GFP+参考相当（图2B）。GFP信号强度监测进一步显示所有FELP群体在长期培养（>100天）中MFI谱稳定，其中FELP3和FELP4表现出最高的长期稳定性（图S1E和S2C）。
利用该共培养系统，研究测试了来自先前全基因组CRISPR筛选的候选基因，涵盖235个单基因敲除和155个多基因组合，分布于7个批次、超过100天的培养周期中。该测定检测到预期的致死和生长抑制扰动，并鉴定出28个通过VCC测量难以分辨的生长增强敲除或基因组合。
【数据】GFP阳性比例30天后：约85%-90%；FACS分选细胞数：2E5细胞/池；MFI范围：4×10⁵至6×10⁵；长期培养时间：>100天；共培养时间：46天；GFP比例波动范围：±10%；单基因敲除数：235；多基因组合数：155；批次：7；培养周期：>100天；生长增强敲除/组合数：28
大规模共培养CRISPR筛选与命中鉴定
批次1-6包含218个单基因敲除和155个多基因组合。批次7包含17个额外单基因靶点和一个高阶多基因组合（10x_Ultra）。基于斜率推断的生长建模与转录组学分析相结合，对基因集进行反卷积分析，将多基因表型与候选驱动基因关联。该方法实现了可扩展的适应性假设验证和CHO生长工程靶点的优先级排序，为下游宿主细胞开发提供支持。
【数据】批次1-6单基因敲除数：218；多基因组合数：155；批次7单基因靶点数：17；高阶多基因组合：1个（10x_Ultra）
讨论与解读
本研究建立了一个高通量共培养CRISPR阵列，利用竞争性群体动力学验证CHO细胞中细胞适应性和生长的遗传决定因素。基于先前全基因组CRISPR筛选，主要目标是开发一种灵敏且高通量的验证方法，能够分辨传统单培养生长测定难以捕捉的细微生长/适应性效应。针对必需或生长抑制基因的初步实验证实，基于VCC的指标不足以分辨混合编辑群体中的适应性差异：适应性降低是短暂的，仅在培养第二周可检测，且被未编辑细胞的快速过度生长所掩盖。相比之下，竞争性共培养将增殖或存活差异在多次分裂中整合，提供累积适应性读数，受传代、编辑效率或处理变异性的影响较小。值得注意的是，即使约1%的适度生长优势也可在数周内复合，显著改变培养组成。
斜率建模将GFP动力学转化为推断的生长速率变化，组合排除法与批量转录组学将多基因表型与候选驱动基因关联。该方法支持可扩展的适应性假设测试，并对CHO生长工程靶点进行优先级排序，为下游宿主细胞开发奠定基础。
编译者解读
该研究的核心价值在于将竞争性共培养原理系统性地引入CHO细胞生长工程领域。传统的VCC测量在混合编辑群体中分辨率有限，而GFP比例追踪将适应性差异转化为可累积的流式细胞术信号，这一设计在工业细胞系开发中具有直接应用前景。多克隆参考池策略规避了单克隆异质性偏差，ΔΔGFP归一化增强了数据可比性。值得关注的是，该平台不仅限于生长相关基因验证，其原理可扩展至生产力、代谢效率等其他复杂表型的假设检验。局限在于共培养体系无法完全模拟工业生产中胁迫环境下的生长表现，候选靶点仍需在真实工艺条件下进一步确认。
DOI: 10.1016/j.isci.2026.117201